Spheroid Formation Protocols for SNU Gastrointestinal Cancer Cells

โปรโตคอลการสร้างรูปทรงกลมสำหรับเซลล์มะเร็งทางเดินอาหารของ SNU

ระบบเพาะเลี้ยงเซลล์สามมิติ (3D) ได้ปฏิวัติการวิจัยโรคมะเร็งโดยการให้แบบจำลองที่สามารถจำลองสภาพแวดล้อมของเนื้องอกได้ใกล้เคียงกับของจริงมากกว่าการเพาะเลี้ยงเซลล์แบบชั้นเดียวสองมิติแบบดั้งเดิมเซลล์ไลน์มะเร็งทางเดินอาหาร SNU ซึ่งได้มาจากผู้ป่วยโรคมะเร็งกระเพาะอาหารและลำไส้ใหญ่ในเกาหลี แสดงความสามารถในการสร้างก้อนเซลล์ทรงกลมที่แข็งแกร่ง ซึ่งช่วยให้สามารถศึกษาการต้านยาของเซลล์มะเร็ง ความหลากหลายของเนื้องอก และชีววิทยาของเซลล์ต้นกำเนิดมะเร็งได้ การจัดตั้งโปรโตคอลการสร้างก้อนเซลล์ทรงกลมที่เป็นมาตรฐานสำหรับเซลล์ไลน์ SNU จะช่วยให้การทดลองสามารถทำซ้ำได้ระหว่างห้องปฏิบัติการต่าง ๆ และช่วยให้การวิจัยเชิงประยุกต์สามารถนำไปใช้ได้

ประเด็นสำคัญ

• เซลล์ไลน์มะเร็งกระเพาะอาหารและลำไส้ใหญ่ของ SNU สร้างเป็นทรงกลมที่หนาแน่นและสามารถทำซ้ำได้ เหมาะสำหรับการทดสอบยา
• พื้นผิวที่มีการยึดเกาะต่ำมากและวิธีการหยดแบบแขวนให้รูปแบบทรงกลมที่แตกต่างกันซึ่งมีการประยุกต์ใช้ที่แตกต่างกัน
• ขนาดของทรงกลมและระดับการอัดแน่นมีความสัมพันธ์กับการแทรกซึมของยาและลักษณะต้านทานยาในแบบจำลอง SNU
• การเพาะเลี้ยงแบบร่วมของก้อนทรงกลมที่ประกอบด้วยเซลล์สโตรมาและเซลล์ภูมิคุ้มกันจำลองสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอก
• โปรโตคอลมาตรฐานช่วยให้การคัดกรองยาแบบใช้สเฟียรอยด์ในปริมาณมากเป็นไปได้โดยใช้สายเซลล์ SNU

การสร้างทรงกลมในพื้นผิวที่มีการยึดเกาะต่ำมาก

แผ่นเพาะเลี้ยงเซลล์แบบยึดเกาะต่ำพิเศษ (Ultra-low attachment หรือ ULA) เป็นวิธีที่ได้รับการยอมรับอย่างแพร่หลายที่สุดในการสร้างก้อนเซลล์มะเร็ง SNU ที่มีรูปร่างสม่ำเสมอ แผ่นเพาะเลี้ยงเหล่านี้มีพื้นผิวไฮโดรเจลที่เชื่อมต่อกับพื้นผิวอย่างถาวร ช่วยป้องกันการยึดเกาะของเซลล์ ทำให้เซลล์ต้องรวมตัวกันและสร้างโครงสร้างสามมิติ รูปทรงก้นกลมของแผ่น ULA ส่งเสริมการก่อตัวของก้อนเซลล์เดี่ยวในแต่ละหลุม ช่วยให้สามารถทำการวิเคราะห์เชิงปริมาณที่มีความแปรปรวนระหว่างหลุมน้อยที่สุด

สำหรับเซลล์มะเร็งกระเพาะอาหารสายพันธุ์ SNU ความหนาแน่นที่เหมาะสมในการเพาะเลี้ยงอยู่ระหว่าง 500 ถึง 5,000 เซลล์ต่อหลุม ขึ้นอยู่กับสายพันธุ์เซลล์และขนาดของสเฟียรอยด์ที่ต้องการ ความหนาแน่นในการเพาะเลี้ยงที่ต่ำจะให้สเฟียรอยด์ขนาดเล็กและแน่นเหมาะสำหรับการศึกษาการซึมผ่านของยา ในขณะที่ความหนาแน่นที่สูงจะสร้างสเฟียรอยด์ขนาดใหญ่ที่มีแกนเนโครติกซึ่งเลียนแบบบริเวณเนื้องอกที่มีการไหลเวียนของเลือดน้อยการปรับให้เหมาะสมเฉพาะสายเซลล์เป็นสิ่งสำคัญ เนื่องจากสายเซลล์ SNU แต่ละสายมีลักษณะการรวมตัวและคุณสมบัติการอัดตัวที่แตกต่างกัน

เซลล์ AGSเป็นแบบจำลองมะเร็งต่อมน้ำเหลืองในกระเพาะอาหารที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย ซึ่งสามารถก่อตัวเป็นทรงกลมแน่นภายใน 48-72 ชั่วโมงหลังจากการเพาะปลูกเซลล์ MKN-45แสดงให้เห็นการรวมตัวที่รวดเร็วกว่า แต่ก่อตัวเป็นโครงสร้างที่ไม่แน่นหนาเท่าในขณะที่เซลล์ KATO-IIIมีลักษณะทรงกลมที่เป็นเอกลักษณ์เนื่องจากลักษณะของเซลล์แหวนตราประทับเซลล์ MKN-74ให้แบบจำลองการแยกประเภทแบบลำไส้ที่เหมาะสำหรับการเพาะเลี้ยงแบบทรงกลม

วิธีหยดแขวนสำหรับการควบคุมขนาดของสเฟียรอยด์

เทคนิคการแขวนหยดช่วยให้สามารถควบคุมจำนวนเซลล์เริ่มต้นและขนาดของสเฟียรอยด์ที่ได้อย่างแม่นยำ โดยการแขวนปริมาตรเซลล์ที่กำหนดไว้จากพื้นผิวเพาะเลี้ยงที่คว่ำ วิธีนี้ช่วยลดความจำเป็นในการใช้จานเพาะเลี้ยงเฉพาะทางและผลิตสเฟียรอยด์ที่มีขนาดซ้ำได้สูง ซึ่งมีความสำคัญสำหรับการใช้งานในการคัดกรองยาแบบมาตรฐาน แรงโน้มถ่วงจะรวมเซลล์เข้าด้วยกันที่จุดยอดของหยด ก่อให้เกิดสเฟียรอยด์ที่ไม่ขึ้นต่อการปฏิสัมพันธ์กับพื้นผิว

โปรโตคอลการหยดแขวนมาตรฐานสำหรับเซลล์ไลน์ SNU ใช้หยดขนาด 20-25 μL ที่มีเซลล์ 1,000-5,000 เซลล์ในอาหารเลี้ยงเซลล์ครบถ้วนหลังจากเกิดการรวมตัวครั้งแรกเป็นเวลา 24-48 ชั่วโมง สเฟียรอยด์จะถูกย้ายไปยังจานเพาะเลี้ยงแบบ ULA หรือระบบเพาะเลี้ยงแบบแขวนลอยเพื่อการเจริญเติบโตต่อไป การเติมเมทิลเซลลูโลส (0.24% w/v) ลงในอาหารเลี้ยงเซลล์แบบหยดแขวนลอยจะช่วยเพิ่มความหนืดและป้องกันการกระจายตัวของหยดอาหาร ส่งผลให้สเฟียรอยด์มีความสม่ำเสมอมากขึ้น

แบบจำลองก้อนกลมของมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนักขยายขอบเขตไปไกลกว่าการประยุกต์ใช้กับมะเร็งกระเพาะอาหารเซลล์ HCT116สร้างก้อนกลมที่แน่นหนาและสามารถทำซ้ำได้สูง เหมาะสำหรับการใช้งานการคัดกรองแบบความจุสูงเซลล์ Caco-2พัฒนาโครงสร้างเยื่อบุผิวที่มีการแบ่งขั้วภายในก้อนกลมในขณะที่เซลล์ DLD-1 และเซลล์ SW620ให้แบบจำลองมะเร็งลำไส้ใหญ่ชนิดอะดีโนคาร์ซิโนมาเพิ่มเติมที่มีพื้นหลังทางพันธุกรรมที่แตกต่างกัน

การปรับสภาพอาหารเลี้ยงเชื้อให้เหมาะสมสำหรับการสร้างสเฟียรอยด์

องค์ประกอบของอาหารเลี้ยงเชื้อมีผลอย่างมีนัยสำคัญต่อประสิทธิภาพการสร้างสเฟียรอยด์ของเซลล์ไลน์ SNU รวมถึงรูปร่างและอัตราการอยู่รอดของเซลล์ อาหารเลี้ยงเชื้อแบบชั้นเดียวมาตรฐานมักต้องมีการเติมสารสกัดจากเยื่อหุ้มฐานหรือปรับความเข้มข้นของซีรัมเพื่อส่งเสริมการอัดตัวของสเฟียรอยด์ การเลือกอาหารเลี้ยงเชื้อพื้นฐานและสารเติมแต่งที่เหมาะสมจะเป็นตัวกำหนดคุณภาพของสเฟียรอยด์และความสามารถในการทำซ้ำของการทดลอง

RPMI 1640 Mediumทำหน้าที่เป็นอาหารเลี้ยงเซลล์มาตรฐานสำหรับเซลล์มะเร็งทางเดินอาหารส่วนใหญ่ของ SNU การลดซีรั่มจากมาตรฐาน 10% เป็น 2-5% ของเซรั่มวัวตัวอ่อนจะส่งเสริมการอัดตัวของสเฟียรอยด์โดยการลดสัญญาณการยึดเกาะของเซลล์กับพื้นผิว การเสริมปัจจัยการเจริญเติบโตด้วย EGF และ bFGF สนับสนุนการเพิ่มความเข้มข้นของเซลล์ต้นกำเนิดมะเร็งภายในสเฟียรอยด์ ทำให้สามารถศึกษาประชากรเซลล์ที่ก่อให้เกิดเนื้องอกได้

การผสมผสานDMEM/Ham's F12 Mediumให้เป็นสื่อพื้นฐานทางเลือกสำหรับสายเซลล์ SNU ที่ต้องการองค์ประกอบสารอาหารที่แตกต่างกัน การเติม B27 supplement และ N2 supplement ช่วยเพิ่มความเข้มข้นของประชากรเซลล์ที่มีลักษณะคล้ายสเต็มเซลล์ภายในสเฟียรอยด์Freeze Medium CM-1ช่วยให้สามารถเก็บรักษาสเฟียรอยด์ในสภาวะแช่แข็งสำหรับการจัดเก็บระยะยาวและความสม่ำเสมอในการทดลอง

การวิเคราะห์ขนาดทรงกลมและการอัดแน่น

การประเมินเชิงปริมาณของขนาดทรงกลมและสถานะการอัดแน่นให้ข้อมูลเมตริกการควบคุมคุณภาพและจุดสิ้นสุดของการทดลองที่จำเป็น แพลตฟอร์มการถ่ายภาพอัตโนมัติจับภาพแบบ brightfield หรือ phase-contrast ของทรงกลมแต่ละตัว ทำให้สามารถวัดเส้นผ่านศูนย์กลาง ความกลม และความไม่สม่ำเสมอของพื้นผิวด้วยอัลกอริทึมได้ พารามิเตอร์เหล่านี้มีความสัมพันธ์กับความสุกของทรงกลมและทำนายลักษณะการแทรกซึมของยา

ก้อนเซลล์ทรงกลมของมะเร็งกระเพาะอาหารจาก SNU มักจะมีขนาดคงที่ที่เส้นผ่านศูนย์กลาง 300-500 ไมโครเมตรภายในวันที่ 5-7 ของการเพาะเลี้ยง ขึ้นอยู่กับความหนาแน่นของการเพาะเริ่มต้นและสายพันธุ์ของเซลล์ ก้อนเซลล์ที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางเกิน 500 ไมโครเมตรจะพัฒนาแกนกลางที่มีออกซิเจนต่ำซึ่งกระตุ้นการเปิดใช้งานเส้นทาง HIF และการปรับโปรแกรมเมตาบอลิซึมใหม่ ซึ่งจำลองสภาพแวดล้อมของเนื้องอกที่มีออกซิเจนต่ำ ความชันของออกซิเจนต่ำนี้มีอิทธิพลต่อการตอบสนองต่อยาและการพัฒนาความต้านทานในแบบจำลองก้อนเซลล์

ดัชนีการอัดแน่นที่คำนวณจากพื้นที่ทรงกลมเปรียบเทียบกับจำนวนเซลล์เริ่มต้นสามารถแยกแยะสเฟียรอยด์ชนิดแน่นแบบเยื่อบุผิวออกจากกลุ่มก้อนหลวมแบบมีเซนไคม์ได้ สายเซลล์ SNU ที่มีการแสดงออกของ E-cadherin สูงจะสร้างสเฟียรอยด์ที่แน่นกว่าสายเซลล์ที่ผ่านกระบวนการเปลี่ยนผ่านจากเยื่อบุผิวไปเป็นมีเซนไคม์ ความแตกต่างทางสัณฐานวิทยานี้มีความสัมพันธ์กับศักยภาพในการแพร่กระจายและรูปแบบความไวต่อยาที่พบในทางคลินิก

แบบจำลองสเฟียรอยด์ร่วมวัฒนธรรมของจุลภาคในสิ่งแวดล้อมของเนื้องอก

การเจริญเติบโตของเนื้องอกและการตอบสนองต่อยาขึ้นอยู่กับการปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์มะเร็งกับองค์ประกอบของเนื้อเยื่อรอบข้าง ซึ่งรวมถึงไฟโบรบลาสต์ เซลล์บุผนังหลอดเลือด และเซลล์ภูมิคุ้มกัน ระบบเพาะเลี้ยงแบบรวมกลุ่มเป็นทรงกลม (co-culture spheroid) ที่ประกอบด้วยเซลล์หลายชนิดสามารถจำลองปฏิสัมพันธ์เหล่านี้ในโครงสร้างสามมิติ เผยให้เห็นบทบาทของเนื้อเยื่อรอบข้างในการดื้อยาและการหลบเลี่ยงระบบภูมิคุ้มกันของเซลล์มะเร็ง สายพันธุ์เซลล์ SNU สามารถสร้างกลุ่มเซลล์ทรงกลมแบบผสมชนิด (heterotypic spheroids) กับเซลล์เนื้อเยื่อรอบข้างหลากหลายชนิดได้อย่างง่ายดาย

การเพาะเลี้ยงร่วมของไฟโบรบลาสต์ที่เกี่ยวข้องกับมะเร็ง (CAF) กับเซลล์มะเร็งกระเพาะอาหาร SNU สร้างสเฟียรอยด์ที่มีความต้านทานต่อยาเพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกับสเฟียรอยด์ที่เพาะเลี้ยงเดี่ยว ปัจจัยที่มาจาก CAF รวมถึง HGF และ IL-6 กระตุ้นเส้นทางการอยู่รอดในเซลล์มะเร็งและปรับโครงสร้างเมทริกซ์นอกเซลล์ภายในสเฟียรอยด์ อัตราส่วนของเซลล์มะเร็งต่อไฟโบรบลาสต์สามารถปรับได้เพื่อจำลองระดับการแทรกซึมของสโตรมาที่แตกต่างกัน

การเพาะเลี้ยงร่วมของเซลล์ภูมิคุ้มกันช่วยให้สามารถศึกษาปฏิสัมพันธ์ระหว่างเนื้องอกกับภูมิคุ้มกันภายในโครงสร้างทรงกลมได้เซลล์ THP-1ที่แยกตัวเป็นแมคโครฟาจแทรกซึมเข้าไปในสเฟียรอยด์ SNU และรับลักษณะของแมคโครฟาจที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอกเซลล์ Jurkat E6.1ทำหน้าที่เป็นแบบจำลองของเซลล์ T สำหรับศึกษาการตอบสนองต่อการรักษาด้วยภูมิคุ้มกันในสภาวะเพาะเลี้ยงร่วมของสเฟียรอยด์ ในขณะที่เซลล์ K562ช่วยให้สามารถศึกษาความเป็นพิษของเซลล์นักฆ่าตามธรรมชาติได้

การคัดกรองยาแบบใช้เซลล์ทรงกลมจำนวนมาก

แพลตฟอร์มเพาะเลี้ยงสเฟียรอยด์อัตโนมัติช่วยให้สามารถคัดกรองยาแบบขยายขนาดได้โดยใช้แบบจำลองมะเร็งทางเดินอาหารของ SNU ระบบจัดการของเหลวแบบหุ่นยนต์จะปลูกเซลล์ลงในจาน ULA ขนาด 384 หลุม เติมสารประกอบในความเข้มข้นต่างๆ และติดตามการตอบสนองของสเฟียรอยด์ตามเวลาโดยใช้การถ่ายภาพแบบบูรณาการ รูปแบบการทำงานแบบความเร็วสูงนี้สร้างข้อมูลการตอบสนองต่อขนาดยาจากคลังสารประกอบต่างๆ ในบริบทการเพาะเลี้ยงแบบสามมิติที่มีความเกี่ยวข้องทางคลินิก

การประเมินความมีชีวิตของเซลล์ทรงกลมใช้การวัดปริมาณ ATP ที่เรืองแสง (CellTiter-Glo 3D) หรือตัวบ่งชี้การตายของเซลล์ที่เรืองแสง (propidium iodide, สีย้อม SYTOX) ซึ่งเข้ากันได้กับเครื่องอ่านแบบความจุสูงวัฒนธรรมสามมิติต้องการระยะเวลาการสัมผัสยาที่ยาวนานกว่าเมื่อเทียบกับชั้นเซลล์เดี่ยว โดยทั่วไปคือ 72-120 ชั่วโมง เพื่อรองรับการเคลื่อนที่ของยาและการเพิ่มจำนวนเซลล์ที่ช้ากว่า ระยะเวลาการสัมผัสที่ยาวนานนี้ช่วยระบุสารประกอบที่มีฤทธิ์ล่าช้าซึ่งอาจถูกมองข้ามในการทดสอบชั้นเซลล์เดี่ยวระยะสั้น

การควบคุมคุณภาพในการคัดกรองสเฟียรอยด์แบบผ่านปริมาณสูงต้องการสายพันธุ์เซลล์ที่ได้รับการยืนยันและโปรโตคอลมาตรฐานบริการยืนยันสายพันธุ์เซลล์ตรวจสอบตัวตนของสายพันธุ์เซลล์SNU ผ่านการวิเคราะห์ STR ก่อนเริ่มการคัดกรองการทดสอบการปนเปื้อนไมโคพลาสมาช่วยให้มั่นใจในความสมบูรณ์ของการเพาะเลี้ยงสเฟียรอยด์ เนื่องจากการปนเปื้อนไมโคพลาสมาจะเปลี่ยนแปลงลักษณะการก่อตัวของสเฟียรอยด์และลักษณะการตอบสนองต่อยา

สรุป

โปรโตคอลการสร้างสเฟียรอยด์มาตรฐานสำหรับเซลล์ไลน์มะเร็งทางเดินอาหารของ SNU ให้แบบจำลองสามมิติที่แข็งแกร่งสำหรับการค้นคว้ายาและการวิจัยชีววิทยามะเร็ง ด้วยการเลือกวิธีการสร้างที่เหมาะสม ปรับปรุงสภาพการเพาะเลี้ยง และใช้ตัวชี้วัดคุณภาพเชิงปริมาณ นักวิจัยสามารถสร้างวัฒนธรรมสเฟียรอยด์ที่สามารถทำซ้ำได้และเหมาะสำหรับการประยุกต์ใช้ในปริมาณมาก การรวมส่วนประกอบของสโตรมาและภูมิคุ้มกันยังช่วยเพิ่มความเกี่ยวข้องทางสรีรวิทยาของแบบจำลองเหล่านี้ สนับสนุนการแปลผลการค้นพบในห้องปฏิบัติการไปสู่ประโยชน์ทางคลินิก