Spheroid Formation Protocols for SNU Gastrointestinal Cancer Cells

بروتوكولات تكوين الخلايا الكروية لخلايا سرطان الجهاز الهضمي SNU

لقد أحدثت أنظمة زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) ثورة في أبحاث السرطان من خلال توفير نماذج تحاكي البيئة الدقيقة للورم بدقة أكبر مقارنةً بالمزارع التقليدية ثنائية الأبعاد أحادية الطبقة. تُظهر سلالات خلايا سرطان الجهاز الهضمي المستخلصة من مرضى سرطان المعدة والقولون والمستقيم الكوريين قدرة قوية على تكوين الخلايا الكروية التي تتيح إمكانية التحقيق في آليات مقاومة الأدوية وعدم تجانس الورم وبيولوجيا الخلايا الجذعية السرطانية. ويضمن وضع بروتوكولات موحدة لتكوين الخلايا الكروية لخطوط خلايا SNU إمكانية التكرار في المختبرات ويسهل تطبيقات البحوث الانتقالية.

الوجبات الرئيسية

• تشكل خطوط خلايا سرطان المعدة وسرطان القولون والمستقيم من SNU خلايا مضغوطة وقابلة للتكرار مناسبة لتطبيقات فحص الأدوية
• تسفر أسطح التعلق المنخفضة للغاية وطرق الإسقاط المعلقة عن أشكال متميزة للكريات الكروية مع تطبيقات مختلفة
• يرتبط حجم الخلية الكروية وانضغاطها بتغلغل الدواء والأنماط الظاهرية للمقاومة في نماذج وحدة SNU
• زراعة الخلايا الكروية المشتركة التي تتضمن الخلايا اللحمية والخلايا المناعية لنموذج البيئة الدقيقة للورم
• تمكّن البروتوكولات الموحدة من إجراء فحص عالي الإنتاجية للأدوية القائمة على الخلايا الكروية باستخدام خطوط خلايا SNU

تشكيل الخلايا الكروية السطحية منخفضة التعلق للغاية

توفر ألواح الاستزراع ذات التعلق المنخفض للغاية (ULA) الطريقة الأكثر اعتماداً على نطاق واسع لتوليد خلايا سرطانية متجانسة متجانسة من الخلايا السرطانية. تتميز هذه الألواح بأسطح هيدروجيل مرتبطة تساهميًا تمنع التصاق الخلايا، مما يجبر الخلايا على التجمع وتشكيل هياكل ثلاثية الأبعاد. وتعزز هندسة القاع المستديرة لألواح ULA تكوين خلية كروية واحدة في كل بئر، مما يتيح إجراء فحوصات كمية بأقل قدر من التباين من بئر إلى بئر.

بالنسبة لخطوط خلايا سرطان المعدة السرطانية في SNU، تتراوح كثافة البذر المثلى من 500 إلى 5000 خلية لكل بئر اعتمادًا على خط الخلية المحدد وحجم الخلية الكروية المقصود. تؤدي كثافات البذر المنخفضة إلى إنتاج أجسام كروية أصغر حجماً وأكثر إحكاماً ومناسبة لدراسات تغلغل الأدوية، بينما تولد الكثافات الأعلى أجساماً كروية أكبر حجماً تُنشئ نوى نخرية تحاكي مناطق الورم سيئة الأوعية الدموية. يعد التحسين الخاص بخط الخلية أمرًا ضروريًا، حيث تُظهر خطوط SNU المختلفة حركية تجميع وخصائص ضغط متميزة.

تمثلخلايا AGS Cells نموذجًا شائع الاستخدام لسرطان غدي معدي شائع الاستخدام يشكل أجسامًا شبيهة متماسكة في غضون 48-72 ساعة من البذر. تُظهر خلايا MKN-45 تجميعًا أسرع ولكنها تشكل هياكل أقل انضغاطًا، بينما تقدم خلايا MKN-45 شكلًا كرويًا فريدًا بسبب خصائص خلاياها الحلقية. توفر خلايا MKN-74 نموذج تمايز من النوع المعوي قابل للاستزراع الكروي.

طريقة القطرة المعلقة للتحكم في حجم الخلية الكروية

تتيح تقنية القطرة المعلقة تحكمًا دقيقًا في أعداد الخلايا الأولية وأبعاد الخلايا الكروية الناتجة عن طريق تعليق أحجام خلايا محددة من أسطح المزرعة المقلوبة. وتغني هذه الطريقة عن الحاجة إلى ألواح متخصصة وتنتج أحجاماً كروية قابلة للتكرار بشكل كبير وهي ضرورية لتطبيقات فحص الأدوية الموحدة. تعمل قوة الجاذبية على تجميع الخلايا في قمة القطرة لتكوين أجسام كروية مستقلة عن تفاعلات الركيزة.

وتستخدم بروتوكولات القطرات المعلقة القياسية لخطوط خلايا SNU قطرات سعة 20-25 ميكرولتر تحتوي على 1,000-5,000 خلية في وسط مزرعة كامل. بعد 24-48 ساعة من التجميع الأولي، تُنقل الأجسام الشبه الكروية إلى ألواح ULA أو مزرعة معلقة لمواصلة النضج. تزيد إضافة ميثيل سلولوز الميثيل (0.24% وزن/وزن V) إلى وسط القطرات المعلقة من اللزوجة وتمنع انتشار القطرات، مما يحسن من انتظام الخلايا الكروية.

تمتد نماذج الخلايا الكروية لسرطان القولون والمستقيم إلى ما هو أبعد من تطبيقات سرطان المعدة. تُشكّل خلايا HCT116 خلايا مضغوطة وقابلة للتكرار بشكل كبير ومناسبة لتطبيقات الفحص عالية الإنتاجية. تقوم خلايا Caco-2 بتطوير بنية طلائية مستقطبة داخل الأجسام الكروية الكروية، بينما توفر خلايا DLD-1 وخلايا SW620 نماذج إضافية لسرطان القولون والمستقيم مع خلفيات وراثية متميزة.

تحسين وسط الاستزراع لتكوين الخلايا الكروية

تؤثر تركيبة وسط الاستزراع بشكل كبير على كفاءة تكوين الخلايا الكروية لخط خلايا SNU، وعلى التشكل والحيوية. تتطلب وسائط الزرع أحادية الطبقة القياسية عادةً إضافة مستخلص الغشاء القاعدي أو تركيزات مصل معدلة لتعزيز انضغاط الخلايا الكروية. يحدد اختيار الوسط الأساسي المناسب والمواد المضافة جودة الخلايا الكروية وقابلية التكرار التجريبي.

يُستخدموسط RPMI 1640 كوسيط أساسي قياسي لمعظم خطوط خلايا سرطان الجهاز الهضمي SNU. يعمل تقليل المصل من 10% إلى 2-5% من مصل الأبقار الجنيني القياسي على تعزيز انضغاط الخلايا الكروية عن طريق تقليل إشارات الارتباط بين الخلية والركيزة. تدعم مكملات عامل النمو بعامل النمو EGF وBFGF إثراء الخلايا الجذعية السرطانية داخل الأجسام الكروية مما يتيح إجراء دراسات على مجموعات الخلايا البادئة للورم.

توفر تركيباتوسط DMEM/وسيط هام F12 وسائط أساسية بديلة لخطوط خلايا SNU محددة تتطلب تركيبات مغذية مختلفة. وتؤدي إضافة مكمل B27 ومكمل N2 إلى زيادة إثراء المجموعات الشبيهة بالجذعية داخل الأجسام الكروية. يتيح وسيط التجميد CM-1 إمكانية حفظ مزارع الخلايا الكروية بالتبريد للتخزين طويل الأمد والاتساق التجريبي.

تحليل حجم الخلية الكروية وانضغاطها

يوفر التقييم الكمي لأبعاد الخلايا الكروية وحالة الانضغاط مقاييس أساسية لمراقبة الجودة ونقاط النهاية التجريبية. تلتقط منصات التصوير المؤتمتة صورًا للحقل الساطع أو صورًا متباينة الطور للأجسام الكروية الفردية، مما يتيح القياس الخوارزمي للقطر والدائرية وعدم انتظام السطح. وترتبط هذه المعلمات بنضج الأجسام الكروية وتتنبأ بخصائص تغلغل الدواء.

عادةً ما تصل الأجسام الكروية السرطانية السرطانية المعدية SNU إلى أبعاد مستقرة يتراوح قطرها بين 300-500 ميكرومتر بحلول اليوم الخامس والسابع من الاستزراع، اعتمادًا على كثافة البذر الأولية وخط الخلية. تطور الأجسام الكروية التي يتجاوز قطرها 500 ميكرومتر نوى مركزية ناقصة التأكسج تؤدي إلى تنشيط مسار HIF وإعادة برمجة التمثيل الغذائي، مما يؤدي إلى نمذجة البيئة الدقيقة للورم ناقص التأكسج. يؤثر تدرج نقص الأكسجين هذا على الاستجابة للأدوية وتطور المقاومة في نماذج الخلايا الكروية.

تميّز مؤشرات الانضغاط المحسوبة من مساحة الخلية الكروية بالنسبة لعدد الخلايا الأولي بين الأجسام الكروية الضيقة من النوع الظهاري والكتل الرخوة من النوع الوسيطي. تُشكّل سلالات خلايا SNU ذات التعبير العالي للكادرين E-cadherin أجسامًا كروية أكثر انضغاطًا من سلالات الخلايا التي خضعت للانتقال من الظهارة إلى الوسيطة. ويرتبط هذا التباين المورفولوجي بالقدرة على الانتقال النقيلي وأنماط الحساسية للأدوية التي لوحظت سريريًا.

نماذج الخلايا الكروية المشتركة للبيئة الدقيقة للورم

يعتمد تطور الورم والاستجابة للدواء بشكل حاسم على التفاعلات بين الخلايا السرطانية والمكونات اللحمية بما في ذلك الخلايا الليفية والخلايا البطانية والخلايا المناعية. تقوم أنظمة الخلايا الكروية المزروعة بشكل مشترك التي تضم أنواعًا متعددة من الخلايا بنمذجة هذه التفاعلات في بنية ثلاثية الأبعاد، مما يكشف عن مساهمات الخلايا اللحمية في مقاومة الأدوية والتهرب المناعي. تشكل خطوط خلايا SNU الخلوية بسهولة أجسامًا كروية غير متجانسة مع مجموعات مختلفة من الخلايا اللحمية.

تولد الزراعة المشتركة للأرومة الليفية المرتبطة بالسرطان (CAF) مع خلايا سرطان المعدة SNU أشباه أرومة ذات مقاومة معززة للأدوية مقارنة بالأشباه أحادية النمط. تنشط العوامل المشتقة من الخلايا الليفية المرتبطة بالخلايا السرطانية بما في ذلك HGF و IL-6 مسارات البقاء على قيد الحياة في الخلايا السرطانية وتعيد تشكيل المصفوفة خارج الخلية داخل الأجسام الكروية. يمكن معايرة نسبة الخلايا السرطانية إلى الخلايا الليفية لنمذجة درجات مختلفة من الارتشاح اللحمي.

تتيح الزراعة المشتركة للخلايا المناعية إمكانية فحص التفاعلات بين الورم والمناعة داخل بنية الخلايا الكروية. تتسلل خلايا THP-1 المتمايزة إلى الخلايا البلعمية الكبيرة إلى الأجسام الكروية الشبيهة بالورم وتتبنى الأنماط الظاهرية للبلعمية الكبيرة المرتبطة بالورم. وتوفر خلايا Jurkat E6.1 نماذج الخلايا التائية لدراسة استجابة العلاج المناعي في المزارع الكروية المشتركة، بينما تتيح خلايا K562 دراسات السمية الخلوية للخلايا القاتلة الطبيعية.

الفحص الدوائي القائم على الخلايا الكروية عالية الإنتاجية

تتيح منصات زراعة الخلايا الكروية المؤتمتة إمكانية إجراء فحص دوائي قابل للتطوير باستخدام نماذج سرطان الجهاز الهضمي باستخدام خلايا الخلايا الكروية. تقوم أنظمة مناولة السوائل الآلية بزرع الخلايا في ألواح ULA ذات 384 بئر، وإضافة مركبات بتركيزات متعددة، ومراقبة استجابة الخلايا الكروية بمرور الوقت باستخدام التصوير المتكامل. يولد هذا الشكل عالي الإنتاجية بيانات عن الاستجابة للجرعة عبر مكتبات المركبات في سياقات زراعة ثلاثية الأبعاد ذات صلة علاجياً.

ويستخدم تقييم قابلية الخلايا الكروية على البقاء قياس كمية الإنارة ATP (CellTiter-Glo 3D) أو مؤشرات موت الخلايا الفلورية (بروبيديوم يوديد، وأصباغ SYTOX) المتوافقة مع أجهزة القراءة عالية الإنتاجية. تتطلب المزروعات ثلاثية الأبعاد أوقات تعرض أطول للعقاقير مقارنةً بالطبقات الأحادية، عادةً ما تكون 72-120 ساعة، لمراعاة حركية تغلغل الدواء ومعدلات الانتشار الأبطأ. وتحدد مدة التعرض الممتدة هذه المركبات ذات النشاط المتأخر التي لم يتم تحديدها في فحوصات الطبقة الأحادية قصيرة المدى.

وتتطلب مراقبة الجودة في فحص الخلايا الكروية عالية الإنتاجية خطوط خلايا معتمدة وبروتوكولات موحدة. تتحقق خدمات مصادقة خط الخلية من هوية خط خلية SNU من خلال تحديد سمات STR قبل بدء حملات الفحص. ويضمن اختبار الميكوبلازما سلامة مزرعة الخلايا الكروية، حيث أن تلوث الميكوبلازما يغير من تكوين الخلايا الكروية وخصائص الاستجابة للأدوية.

الخلاصة

توفر البروتوكولات الموحدة لتكوين الخلايا الكروية لخطوط خلايا سرطان الجهاز الهضمي من نوع SNU نماذج ثلاثية الأبعاد قوية لاكتشاف الأدوية وأبحاث بيولوجيا السرطان. من خلال اختيار طرق التكوين المناسبة، وتحسين ظروف الاستزراع، وتنفيذ مقاييس الجودة الكمية، يمكن للباحثين توليد مزارع كروية قابلة للتكرار ومناسبة للتطبيقات عالية الإنتاجية. ويعزز دمج المكونات اللحمية والمناعية من الأهمية الفسيولوجية لهذه النماذج، مما يدعم الترجمة من النتائج المختبرية إلى الفائدة السريرية.