Spheroid Formation Protocols for SNU Gastrointestinal Cancer Cells

首爾國立大學胃腸道癌細胞的球體形成實驗流程

相較於傳統的二維單層培養，三維（3D）細胞培養系統能更精確地重現腫瘤微環境，從而徹底改變了癌症研究的格局。 源自韓國胃癌及大腸癌患者的 SNU 胃腸道癌症細胞系，展現出強大的球體形成能力，有助於探究藥物抗性機制、腫瘤異質性及癌症幹細胞生物學。為 SNU 細胞系建立標準化的球體形成操作流程，可確保跨實驗室的可重複性，並促進轉譯研究的應用。

重點摘要

• SNU 胃癌與大腸癌細胞系可形成緊密且可重複的球體，適用於藥物篩選應用
• 超低附著表面與懸滴法可產生具有不同應用場景的獨特球體形態
• 在 SNU 模型中，球體大小與緊密程度與藥物滲透及抗藥性表型呈相關性
• 整合間質細胞與免疫細胞的共培養球體，可模擬腫瘤微環境
• 標準化操作流程使利用 SNU 細胞系進行基於球體的高通量藥物篩選成為可能

超低附著表面球體形成

超低附著（ULA）培養板是生成均勻 SNU 癌細胞球體最廣泛採用的方法。這些培養板具有共價鍵結合的水凝膠表面，可防止細胞附著，迫使細胞聚集並形成三維結構。 ULA培養板的圓底幾何結構有助於每個孔中形成單一球體，從而實現定量檢測，並將孔間變異性降至最低。

針對 SNU 胃癌細胞系，最佳接種密度範圍為每孔 500 至 5,000 個細胞，具體取決於特定細胞系及預期的球體大小。 較低的接種密度會產生較小且更緊密的球體，適合用於藥物滲透研究；而較高的接種密度則會產生較大的球體，這些球體會形成壞死核心，模擬血管化不良的腫瘤區域。由於不同的 SNU 細胞系展現出截然不同的聚集動力學與緊密化特性，因此針對特定細胞系進行優化至關重要。

AGS 細胞是一種常用的胃腺癌模型，接種後 48 至 72 小時內即可形成緊密的球體。MKN-45 細胞的聚集速度較快，但形成的結構較為鬆散；而 KATO-III 細胞則因其印環細胞的特徵，呈現出獨特的球體形態。 MKN-74 細胞則提供一種適合球體培養的腸型分化模型。

懸滴法：精準控制球體尺寸

懸滴技術透過將特定體積的細胞懸浮於倒置的培養表面，可精確控制初始細胞數量及最終形成的球體尺寸。此方法無需使用特殊培養板，且能產生高度可重複的球體尺寸，這對於標準化的藥物篩選應用至關重要。重力會使細胞聚集於滴液頂端，形成不受基質相互作用影響的球體。

針對 SNU 細胞系的標準懸滴操作流程，採用 20–25 μL 的液滴，其中含有 1,000–5,000 個細胞，並以完全培養基為基質。 經過 24–48 小時的初步聚合後，細胞球會被轉移至 ULA 培養板或懸浮培養中以繼續成熟。在懸滴培養基中添加甲基纖維素（0.24% w/v）可增加黏度並防止液滴擴散，從而提升細胞球的均勻性。

結直腸癌球體模型的應用範圍不僅限於胃癌。HCT116 細胞可形成緊密且高度可重複的球體，適合用於高通量篩選應用。 Caco-2 細胞在球體內會形成極化的上皮結構，而 DLD-1 細胞和 SW620 細胞則提供了具有不同遺傳背景的額外大腸腺癌模型。

發佈日期：2023年 | 最後審閱日期：2026年5月

優化球體形成所需的培養基

培養基成分對 SNU 細胞系的球體形成效率、形態及存活率具有顯著影響。標準單層培養基通常需補充基底膜萃取物或調整血清濃度，以促進球體緊實化。選擇適當的基礎培養基與添加劑，將決定球體品質及實驗的可重複性。

RPMI 1640 培養基是大多數 SNU 胃腸道癌症細胞系的標準基礎培養基。將血清濃度從標準的 10% 降低至 2-5% 胎牛血清，可透過減少細胞與基質之間的黏附訊號傳導，促進球體緊實化。 補充 EGF 和 bFGF 等生長因子，有助於在球體內富集癌症幹細胞，從而便於研究腫瘤起始細胞群。

DMEM/Ham's F12 培養基組合為需要不同營養成分的特定 SNU 細胞系提供了替代性基礎培養基。添加 B27 補充劑和 N2 補充劑可進一步豐富球體內的幹細胞樣群體。冷凍培養基 CM-1 使球體培養物能夠進行冷凍保存，以實現長期儲存與實驗的一致性。

球體尺寸與緻密度分析

對球體尺寸與緻密度的定量評估，提供了至關重要的品質控制指標與實驗終點。自動化成像平台可擷取單個球體的明場或相位對比影像，並透過演算法測量直徑、圓度及表面不規則性。這些參數與球體成熟度相關，並可預測藥物滲透特性。

首爾大學（SNU）胃癌球體通常在培養第 5 至 7 天達到直徑 300-500 μm 的穩定尺寸，具體取決於初始接種密度和細胞系。 直徑超過 500 μm 的球體會形成中央缺氧核心，進而觸發 HIF 路徑的活化與代謝重編程，模擬缺氧的腫瘤微環境。此缺氧梯度會影響球體模型中的藥物反應及抗藥性發展。

根據球體面積與初始細胞數之比計算出的緊密指數，可區分緊密的上皮型球體與鬆散的間質型聚集体。E-鈣黏蛋白高表達的 SNU 細胞系所形成的球體，比已發生上皮-間質轉化的細胞系更為緊密。 這種形態學差異與臨床觀察到的轉移潛能及藥物敏感性模式呈相關性。

腫瘤微環境的共培養球體模型

腫瘤進展與藥物反應在很大程度上取決於癌細胞與基質成分（包括成纖維細胞、內皮細胞和免疫細胞）之間的相互作用。 整合多種細胞類型的共培養球體系統，能在三維結構中模擬這些相互作用，揭示基質在藥物抗性與免疫逃逸中的作用。SNU 細胞系能輕易與各種基質細胞群形成異型球體。

與 SNU 胃癌細胞共培養的癌症相關成纖維細胞（CAF），所形成的球體相較於單細胞培養球體，具有更強的藥物抗性。源自 CAF 的因子（包括 HGF 和 IL-6）會激活癌細胞的存活途徑，並重塑球體內的細胞外基質。 可透過調整癌細胞與成纖維細胞的比例，模擬不同程度的基質浸潤。

免疫細胞共培養使研究人員能夠探究球體結構內的腫瘤-免疫相互作用。 分化為巨噬細胞的 THP-1 細胞會滲入 SNU 球體，並呈現腫瘤相關巨噬細胞的表型。Jurkat E6.1 細胞可作為 T 細胞模型，用於研究球體共培養中的免疫療法反應；而 K562 細胞則可用於自然殺手細胞細胞毒性研究。

基於球體的高通量藥物篩選

自動化球體培養平台可利用 SNU 胃腸道癌症模型進行可擴展性的藥物篩選。 機器人液體處理系統可將細胞接種至 384 孔 ULA 培養板中，加入多種濃度的化合物，並透過整合式成像技術監測球體隨時間的反應。此高通量格式能在具治療相關性的三維培養環境中，針對化合物庫產生劑量反應數據。

球體存活率評估採用與高通量讀取儀相容的發光式 ATP 定量法（CellTiter-Glo 3D）或螢光細胞死亡指標（碘化丙啶、SYTOX 染料）。 相較於單層培養，三維培養需要更長的藥物暴露時間（通常為 72-120 小時），以考量藥物滲透動力學及較慢的增殖速率。此延長的暴露時間可識別出在短期單層實驗中被忽略、具有延遲活性的化合物。

高通量球體篩選的品質控制需仰賴經認證的細胞系與標準化操作流程。細胞系認證服務會在啟動篩選計畫前，透過短串聯重組（STR）分型驗證 SNU 細胞系的身份。支原體檢測則可確保球體培養的完整性，因為支原體污染會改變球體的形成及藥物反應特性。

結論

針對 SNU 胃腸道癌症細胞系的標準化球體形成協議，為藥物發現與癌症生物學研究提供了穩健的三維模型。透過選擇適當的形成方法、優化培養條件並實施定量品質指標，研究人員可建立適用於高通量應用的可重複性球體培養。 整合間質與免疫成分，進一步增強了這些模型的生理相關性，有助於將實驗室研究成果轉化為臨床效益。