Spheroid Formation Protocols for SNU Gastrointestinal Cancer Cells

Протоколи за формиране на сфероиди за ракови клетки на стомашно-чревния тракт SNU

Триизмерните (3D) системи за клетъчни култури направиха революция в изследванията на рака, като предоставиха модели, които по-точно пресъздават туморната микросреда в сравнение с традиционните двуизмерни монослойни култури. Клетъчните линии за рак на стомашно-чревния тракт SNU, получени от корейски пациенти с рак на стомаха и колоректален рак, демонстрират стабилна способност за формиране на сфероиди, което позволява изследване на механизмите на лекарствена резистентност, туморната хетерогенност и биологията на раковите стволови клетки. Създаването на стандартизирани протоколи за формиране на сфероиди за клетъчни линии SNU осигурява възпроизводимост в различни лаборатории и улеснява приложенията за транслационни изследвания.

Основни изводи

• Клетъчните линии на SNU за рак на стомаха и колоректален рак образуват компактни, възпроизводими сфероиди, подходящи за приложения за скрининг на лекарства
• Изключително ниските повърхности на прикрепване и методите на висящите капки дават различни морфологии на сфероидите с различни приложения
• Размерът на сфероидите и уплътняването им корелират с фенотипите на проникване на лекарства и резистентност в моделите SNU
• Сфероидите за съвместно култивиране, включващи стромални и имунни клетки, моделират туморната микросреда
• Стандартизираните протоколи дават възможност за високопроизводителен скрининг на лекарства на базата на сфероиди, като се използват клетъчни линии на SNU

Формиране на сфероиди на повърхността с ултраниска степен на привързаност

Плочите за култивиране с ултраниска степен на прикрепване (ULA) са най-широко разпространеният метод за генериране на равномерни сфероиди от ракови клетки SNU. Тези плаки имат ковалентно свързани хидрогелни повърхности, които предотвратяват залепването на клетките, принуждавайки ги да се агрегират и да образуват триизмерни структури. Геометрията на кръглото дъно на ULA плаките насърчава образуването на единични сфероиди в ямка, което позволява провеждането на количествени анализи с минимална вариабилност между ямките.

За клетъчните линии на SNU рак на стомаха оптималната гъстота на посяване варира от 500 до 5000 клетки в ямка в зависимост от конкретната клетъчна линия и планирания размер на сфероида. По-ниската плътност на посяване дава по-малки, по-компактни сфероиди, подходящи за проучвания за проникване на лекарства, докато по-високата плътност генерира по-големи сфероиди, които развиват некротични ядра, имитиращи слабо васкуларизирани туморни области. Специфичната за клетъчната линия оптимизация е от съществено значение, тъй като различните линии SNU показват различна кинетика на агрегиране и характеристики на уплътняване.

Клетките AGS представляват често използван модел на стомашен аденокарцином, който образува плътни сфероиди в рамките на 48-72 часа след посяването. Клетките MKN-45 демонстрират по-бърза агрегация, но образуват по-малко компактни структури, докато клетките KATO-III имат уникална сфероидна морфология поради характеристиките си на клетки с пръстен на Синету. Клетките MKN-74 осигуряват модел за диференциация от чревен тип, който е подходящ за култивиране на сфероиди.

Метод на висящите капки за контролиран размер на сфероидите

Методът на висящите капки позволява прецизен контрол на първоначалния брой клетки и получените размери на сфероидите чрез суспендиране на определени обеми клетки от обърнати повърхности за култивиране. Този метод елиминира нуждата от специализирани плаки и осигурява високо възпроизводими размери на сфероидите, които са от решаващо значение за стандартизираните приложения за скрининг на лекарства. Гравитационната сила агрегира клетките на върха на капката, образувайки сфероиди, независими от взаимодействията със субстрата.

Стандартните протоколи за висящи капки за клетъчни линии SNU използват 20-25 μl капки, съдържащи 1000-5000 клетки в пълна хранителна среда. След 24-48 часа първоначално агрегиране, сфероидите се прехвърлят в ULA плаки или суспензионна култура за продължаване на зреенето. Добавянето на метилцелулоза (0,24 % w/v) към средата за висящи капки увеличава вискозитета и предотвратява разпръскването на капките, като подобрява равномерността на сфероидите.

Сфероидните модели за рак на дебелото черво надхвърлят приложенията за рак на стомаха. Клетките на HCT116 образуват компактни, силно възпроизводими сфероиди, подходящи за високопроизводителни скринингови приложения. Клетките Caco-2 развиват поляризирана епителна архитектура в сфероиди, а клетките DLD-1 и SW620 осигуряват допълнителни модели на колоректален аденокарцином с различен генетичен фон.

Оптимизиране на хранителната среда за формиране на сфероиди

Съставът на средата за култивиране оказва значително влияние върху ефективността на формиране на сфероиди, морфологията и жизнеспособността на клетъчната линия SNU. Стандартните монослойни среди за култивиране обикновено изискват добавяне на екстракт от базална мембрана или модифицирани концентрации на серум, за да се насърчи уплътняването на сфероидите. Изборът на подходяща основна среда и добавки определя качеството на сфероидите и възпроизводимостта на експеримента.

Средата RPMI 1640 служи като стандартна базова среда за повечето клетъчни линии на SNU рак на стомашно-чревния тракт. Намаляването на серума от стандартните 10 % до 2-5 % фетален говежди серум насърчава уплътняването на сфероидите чрез намаляване на сигналите за прикрепване на клетките към субстрата. Добавянето на растежни фактори с EGF и bFGF подпомага обогатяването на раковите стволови клетки в сфероидите, което дава възможност за изследване на популациите от иницииращи тумора клетки.

Комбинациите отсреда DMEM/Ham's F12 осигуряват алтернативни базови среди за специфични клетъчни линии SNU, изискващи различен състав на хранителните вещества. Добавянето на добавка B27 и добавка N2 допълнително обогатява стволовите популации в сфероидите. Средата за замразяване CM-1 дава възможност за криоконсервация на сфероидните култури за дългосрочно съхранение и експериментална последователност.

Анализ на размера на сфероидите и уплътняването им

Количествената оценка на размерите на сфероидите и състоянието на уплътняване осигурява основни показатели за контрол на качеството и експериментални крайни точки. Автоматизираните платформи за визуализация заснемат светлополеви или фазово-контрастни изображения на отделни сфероиди, което позволява алгоритмично измерване на диаметъра, кръглостта и неправилността на повърхността. Тези параметри корелират със зрелостта на сфероидите и предсказват характеристиките на проникване на лекарствата.

Сфероидите от рак на стомаха SNU обикновено достигат стабилни размери от 300-500 μm диаметър до 5-7-ия ден от култивирането, в зависимост от първоначалната плътност на посявката и клетъчната линия. Сфероидите с диаметър над 500 μm развиват централни хипоксични ядра, които предизвикват активиране на пътя HIF и метаболитно препрограмиране, моделирайки хипоксичната туморна микросреда. Този хипоксичен градиент влияе върху лекарствения отговор и развитието на резистентност в сфероидните модели.

Индексите на уплътняване, изчислени на базата на площта на сфероида спрямо първоначалния брой клетки, разграничават плътните сфероиди от епителен тип от хлабавите агрегати от мезенхимен тип. Клетъчните линии SNU с висока експресия на E-cadherin образуват по-компактни сфероиди от клетъчните линии, които са претърпели епително-мезенхимен преход. Тази морфологична вариация корелира с метастатичния потенциал и моделите на лекарствена чувствителност, наблюдавани в клинични условия.

Модели на ко-културални сфероиди на туморната микросреда

Прогресирането на тумора и отговорът към лекарствата зависят в решаваща степен от взаимодействията между раковите клетки и стромалните компоненти, включително фибробласти, ендотелни клетки и имунни клетки. Системите за ко-култивиране на сфероиди, включващи множество клетъчни типове, моделират тези взаимодействия в триизмерна архитектура, разкривайки приноса на стромата към лекарствената резистентност и имунното избягване. Клетъчните линии SNU лесно образуват хетеротипни сфероиди с различни популации от стромални клетки.

Съвместното култивиране на раково-асоциирани фибробласти (CAF) с клетки от рак на стомаха SNU генерира сфероиди с повишена лекарствена устойчивост в сравнение с монокултурните сфероиди. Факторите, получени от CAF, включително HGF и IL-6, активират пътищата за оцеляване на раковите клетки и ремоделират извънклетъчния матрикс в сфероидите. Съотношението между раковите клетки и фибробластите може да се променя, за да се моделират различни степени на инфилтрация на стромата.

Съвместното култивиране на имунни клетки позволява изследване на туморно-имунните взаимодействия в рамките на сфероидната архитектура. Клетките THP-1, диференцирани до макрофаги, инфилтрират SNU сфероиди и приемат фенотипи на тумор-асоциирани макрофаги. Клетките Jurkat E6.1 осигуряват Т-клетъчни модели за изследване на отговора на имунотерапията в ко-култури от сфероиди, докато клетките K562 позволяват изследвания на цитотоксичността на клетките естествени убийци.

Високопроизводителен скрининг на лекарства на базата на сфероиди

Автоматизираните платформи за култивиране на сфероиди позволяват мащабируем скрининг на лекарства, като се използват SNU модели на рак на стомашно-чревния тракт. Роботизираните системи за обработка на течности посяват клетките в 384-ямкови ULA плаки, добавят съединения в множество концентрации и наблюдават отговора на сфероидите във времето, като използват интегрирани изображения. Този високопроизводителен формат генерира данни за дозовия отговор на библиотеки от съединения в терапевтично значими триизмерни култури.

Оценката на жизнеспособността на сфероидите използва луминесцентно количествено определяне на АТФ (CellTiter-Glo 3D) или флуоресцентни индикатори за клетъчна смърт (пропидиев йодид, багрила SYTOX), съвместими с високопроизводителни четци. Триизмерните култури изискват по-дълго време на експозиция на лекарството в сравнение с монослоевете, обикновено 72-120 часа, за да се отчете кинетиката на проникване на лекарството и по-бавните темпове на пролиферация. Тази удължена продължителност на експозиция идентифицира съединения със забавена активност, пропуснати при краткосрочните анализи на монослоеве.

Контролът на качеството при високопроизводителния скрининг на сфероиди изисква автентични клетъчни линии и стандартизирани протоколи. Услугите за удостоверяване на клетъчни линии проверяват идентичността на SNU клетъчни линии чрез STR профилиране преди започване на кампаниите за скрининг. Тестването на микоплазми гарантира целостта на сфероидните култури, тъй като замърсяването с микоплазми променя формирането на сфероидите и характеристиките на лекарствения отговор.

Заключение

Стандартизираните протоколи за формиране на сфероиди за SNU клетъчни линии на рак на стомашно-чревния тракт осигуряват надеждни триизмерни модели за откриване на лекарства и изследвания в областта на биологията на рака. Чрез избор на подходящи методи за формиране, оптимизиране на условията на култивиране и прилагане на количествени показатели за качество изследователите могат да създават възпроизводими сфероидни култури, подходящи за приложения с висока производителност. Включването на стромални и имунни компоненти допълнително повишава физиологичната релевантност на тези модели, подпомагайки превръщането на лабораторните открития в клинични ползи.