Spheroid Formation Protocols for SNU Gastrointestinal Cancer Cells

Protokoli za oblikovanje sferoidov za celice raka prebavil SNU

Tridimenzionalni (3D) sistemi celičnih kultur so revolucionarno spremenili raziskave raka, saj zagotavljajo modele, ki v primerjavi s tradicionalnimi dvodimenzionalnimi enoslojnimi kulturami natančneje povzemajo tumorsko mikrookolje. Celične linije raka prebavil SNU, pridobljene od korejskih bolnikov z rakom želodca in debelega črevesa, imajo močno sposobnost oblikovanja sferoidov, kar omogoča raziskave mehanizmov odpornosti na zdravila, heterogenosti tumorjev in biologije matičnih celic raka. Vzpostavitev standardiziranih protokolov za oblikovanje sferoidov za celične linije SNU zagotavlja ponovljivost v različnih laboratorijih in olajša uporabo v translacijskih raziskavah.

Ključne ugotovitve

• Celične linije SNU raka želodca in debelega črevesa tvorijo kompaktne, ponovljive sferoide, primerne za uporabo pri presejanju zdravil
• Izjemno nizke pritrdilne površine in metode visečih kapljic dajejo različne morfologije sferoidov z različnimi aplikacijami
• Velikost sferoida in zgoščenost korelirata s fenotipi penetracije in odpornosti na zdravila v modelih SNU
• Sferoidi za ko-kulture, ki vključujejo stromalne in imunske celice, modelirajo tumorsko mikrookolje
• Standardizirani protokoli omogočajo visoko zmogljivo presejanje zdravil na osnovi sferoidov z uporabo celičnih linij SNU

Oblikovanje sferoidov na površini z izjemno nizko stopnjo pritrditve

Plošče za gojenje z zelo nizko stopnjo pritrditve (ULA) so najbolj razširjena metoda za ustvarjanje enakomernih sferoidov rakavih celic SNU. Te plošče imajo kovalentno vezane hidrogelne površine, ki preprečujejo prijemanje celic in jih silijo v združevanje in oblikovanje tridimenzionalnih struktur. Geometrija okroglega dna plošč ULA spodbuja oblikovanje posameznega sferoida na vdolbino, kar omogoča kvantitativne teste z minimalno variabilnostjo od vdolbine do vdolbine.

Za celične linije raka želodca SNU je optimalna gostota setve od 500 do 5 000 celic na vdolbinico, odvisno od specifične celične linije in predvidene velikosti sferoida. Manjše gostote sejanja dajejo manjše, bolj kompaktne sferoide, primerne za študije penetracije zdravil, medtem ko večje gostote dajejo večje sferoide, ki razvijejo nekrotična jedra, ki posnemajo slabo vaskularizirana področja tumorja. Bistvena je optimizacija glede na celično linijo, saj imajo različne linije SNU različno kinetiko združevanja in značilnosti zgoščevanja.

Celice AGS predstavljajo pogosto uporabljen model adenokarcinoma želodca, ki tvori tesne sferoide v 48-72 urah po nasaditvi. Celice MKN-45 kažejo hitrejšo agregacijo, vendar tvorijo manj kompaktne strukture, medtem ko imajo celice KATO-III edinstveno morfologijo sferoida zaradi značilnosti celic z obročkom. Celice MKN-74 zagotavljajo model diferenciacije črevesnega tipa, ki je primeren za gojenje sferoidov.

Metoda visečih kapljic za nadzorovano velikost sferoidov

Tehnika visečih kapljic omogoča natančen nadzor nad začetnim številom celic in posledičnimi sferoidnimi dimenzijami s suspendiranjem določenih količin celic z obrnjenih površin za gojenje. Ta metoda odpravlja potrebo po posebnih ploščah in omogoča zelo ponovljive velikosti sferoidov, ki so ključnega pomena za standardizirane aplikacije za pregledovanje zdravil. Gravitacijska sila združi celice na vrhu kapljice in tvori sferoide neodvisno od interakcij s substratom.

Standardni protokoli za viseče kapljice za celične linije SNU uporabljajo 20-25 μl kapljice, ki vsebujejo 1 000-5 000 celic v popolnem gojišču. Po 24-48 urah začetne agregacije se sferoidi prenesejo na plošče ULA ali v suspenzijsko kulturo za nadaljnje zorenje. Dodatek metilceluloze (0,24 % m/v) gojišču za viseče kapljice poveča viskoznost in preprečuje širjenje kapljic, kar izboljša enakomernost sferoidov.

Sferoidni modeli raka debelega črevesa in danke niso namenjeni le uporabi pri raku želodca. Celice HCT116 tvorijo kompaktne, zelo ponovljive sferoide, primerne za visoko zmogljive presejalne aplikacije. Celice Caco-2 razvijejo polarizirano epitelijsko arhitekturo v sferoidih, medtem ko celice DLD-1 in SW620 zagotavljajo dodatne modele kolorektalnega adenokarcinoma z različnimi genetskimi ozadji.

Optimizacija gojišča za oblikovanje sferoidov

Sestava gojišča pomembno vpliva na učinkovitost oblikovanja sferoidov, morfologijo in sposobnost preživetja celične linije SNU. Standardna enoslojna gojišča običajno zahtevajo dodatek ekstrakta bazalne membrane ali spremenjene koncentracije seruma, da se spodbudi zgoščevanje sferoidov. Izbira ustreznega osnovnega gojišča in dodatkov določa kakovost sferoidov in ponovljivost poskusa.

Medij RPMI 1640 je standardno osnovno gojišče za večino celičnih linij raka prebavil SNU. Zmanjšanje seruma s standardnih 10 % na 2-5 % fetalnega govejega seruma spodbuja zgoščevanje sferoidov z zmanjšanjem signalizacije pritrditve celic na substrat. Dodajanje rastnih dejavnikov EGF in bFGF podpira obogatitev rakavih matičnih celic v sferoidih, kar omogoča študije populacij celic, ki sprožajo tumor.

Kombinacijemedijev DMEM/Ham's F12 zagotavljajo alternativne osnovne medije za posebne celične linije SNU, ki potrebujejo različne sestave hranil. Dodajanje dodatka B27 in dodatka N2 dodatno obogati populacije matičnih celic v sferoidih. Sredstvo za zamrzovanje CM-1 omogoča kriokonzervacijo sferoidnih kultur za dolgoročno shranjevanje in eksperimentalno konsistenco.

Analiza velikosti in zgoščenosti sferoidov

Kvantitativna ocena dimenzij sferoidov in stanja zgoščenosti zagotavlja bistvene metrike za nadzor kakovosti in končne točke poskusov. Avtomatizirane slikovne platforme zajemajo slike posameznih sferoidov v svetlem polju ali s faznim kontrastom, kar omogoča algoritmično merjenje premera, krožnosti in nepravilnosti površine. Ti parametri so povezani z zrelostjo sferoida in napovedujejo značilnosti penetracije zdravila.

Sferoidi raka želodca SNU običajno dosežejo stabilne dimenzije premera 300-500 μm do 5.-7. dneva gojenja, odvisno od začetne gostote setve in celične linije. Sferoidi s premerom nad 500 μm razvijejo osrednja hipoksična jedra, ki sprožijo aktivacijo poti HIF in presnovno reprogramiranje ter tako modelirajo hipoksično tumorsko mikrookolje. Ta hipoksični gradient vpliva na odziv na zdravila in razvoj odpornosti v sferoidnih modelih.

Indeksi zgoščenosti, izračunani iz površine sferoida glede na začetno število celic, razlikujejo tesne sferoide epitelijskega tipa od ohlapnih agregatov mezenhimskega tipa. Celične linije SNU z visokim izražanjem E-kaderina tvorijo bolj kompaktne sferoide kot celične linije, pri katerih je prišlo do epitelijsko-mezenhimskega prehoda. Ta morfološka razlika je povezana z vzorci metastatskega potenciala in občutljivosti na zdravila, ki jih opažamo v kliniki.

Ko-kulturni sferoidni modeli tumorskega mikrookolja

Napredovanje tumorja in odziv na zdravila sta odločilno odvisna od interakcij med rakavimi celicami in stromalnimi komponentami, vključno s fibroblasti, endotelijskimi celicami in imunskimi celicami. Sferoidni sistemi za ko-kulture, ki vključujejo več vrst celic, modelirajo te interakcije v tridimenzionalni arhitekturi in razkrivajo prispevke stromalnega tkiva k odpornosti na zdravila in izogibanju imunskemu sistemu. Celične linije SNU zlahka tvorijo heterotipske sferoide z različnimi populacijami stromalnih celic.

Snokultura z rakom povezanih fibroblastov (CAF) s celicami raka želodca SNU ustvarja sferoide z večjo odpornostjo na zdravila v primerjavi z monokulturnimi sferoidi. Dejavniki, ki izhajajo iz CAF, vključno z HGF in IL-6, aktivirajo poti preživetja v rakavih celicah in preoblikujejo zunajcelični matriks v sferoidih. Razmerje med rakavimi celicami in fibroblasti se lahko spreminja, da se modelirajo različne stopnje infiltracije stromalnega tkiva.

Kulture imunskih celic omogočajo raziskovanje interakcij med tumorjem in imunskim sistemom v sferoidni arhitekturi. Celice THP-1, diferencirane v makrofage, se infiltrirajo v sferoide SNU in privzamejo fenotipe makrofagov, povezanih s tumorjem. Celice Jurkat E6. 1 zagotavljajo modele celic T za preučevanje odziva na imunoterapijo v sferoidnih ko-kulturah, medtem ko celice K562 omogočajo študije citotoksičnosti celic naravnih ubijalk.

Visoko zmogljivo presejanje zdravil na podlagi sferoidov

Avtomatizirane platforme za gojenje sferoidnih kultur omogočajo skalabilno presejanje zdravil z uporabo modelov raka prebavil SNU. Robotski sistemi za ravnanje s tekočino sejejo celice v 384-delne plošče ULA, dodajajo spojine v več koncentracijah in spremljajo odziv sferoidov skozi čas s pomočjo integriranega slikanja. Ta visoko zmogljiva oblika omogoča pridobivanje podatkov o odzivu na odmerek za vse knjižnice spojin v terapevtsko pomembnih tridimenzionalnih kulturah.

Pri ocenjevanju viabilnosti sferoidov se uporablja luminiscenčna kvantifikacija ATP (CellTiter-Glo 3D) ali fluorescenčni indikatorji celične smrti (propidijev jodid, barvila SYTOX), ki so združljivi z visoko zmogljivimi bralniki. Tridimenzionalne kulture zahtevajo daljši čas izpostavljenosti zdravilu v primerjavi z enoplastnimi, običajno 72-120 ur, da se upošteva kinetika prodiranja zdravila in počasnejše stopnje proliferacije. S tem podaljšanim trajanjem izpostavljenosti se identificirajo spojine z zakasnelo aktivnostjo, ki so bile pri kratkotrajnih enoslojnih testih spregledane.

Za nadzor kakovosti pri visoko zmogljivem presejanju sferoidov so potrebne preverjene celične linije in standardizirani protokoli. Storitve avtentikacije celičnih linij pred začetkom presejalnih kampanj preverijo identiteto celičnih linij SNU s profiliranjem STR. Testiranje mikoplazme zagotavlja celovitost kulture sferoidov, saj kontaminacija z mikoplazmo spreminja oblikovanje sferoidov in značilnosti odziva na zdravila.

Zaključek

Standardizirani protokoli za oblikovanje sferoidov za celične linije raka prebavil SNU zagotavljajo zanesljive tridimenzionalne modele za odkrivanje zdravil in raziskave biologije raka. Z izbiro ustreznih metod oblikovanja, optimizacijo pogojev gojenja in izvajanjem kvantitativnih meril kakovosti lahko raziskovalci ustvarijo ponovljive kulture sferoidov, primerne za visoko zmogljive aplikacije. Vključitev stromalnih in imunskih komponent še poveča fiziološko ustreznost teh modelov, kar podpira prenos laboratorijskih ugotovitev v klinično prakso.