Spheroid Formation Protocols for SNU Gastrointestinal Cancer Cells

SNU kuņģa un zarnu trakta vēža šūnu sferoīdu veidošanās protokoli

Trīsdimensiju (3D) šūnu kultūru sistēmas ir revolucionizējušas vēža pētniecību, nodrošinot modeļus, kas precīzāk atveido audzēja mikrovidi salīdzinājumā ar tradicionālajām divdimensiju monoslāņa kultūrām. SNU kuņģa un zarnu trakta vēža šūnu līnijas, kas iegūtas no Korejas kuņģa un kolorektālā vēža pacientiem, uzrāda spēcīgu sferoīdu veidošanās spēju, kas ļauj pētīt rezistences pret zālēm mehānismus, audzēja heterogenitāti un vēža cilmes šūnu bioloģiju. Standartizētu sferoīdu veidošanās protokolu izveide SNU šūnu līnijām nodrošina reproducējamību dažādās laboratorijās un atvieglo pielietojumu pētniecībā.

Galvenie secinājumi

• SNU kuņģa un kolorektālā vēža šūnu līnijas veido kompaktus, reproducējamus sferoīdus, kas piemēroti zāļu skrīninga lietojumiem
• Ļoti zemas piestiprināšanas virsmas un karājas pilienu metodes ļauj iegūt atšķirīgas sferoīdu morfoloģijas, kas izmantojamas dažādiem lietojumiem
• Sferoīdu izmērs un sablīvēšanās korelē ar zāļu iekļūšanu un rezistences fenotipiem SNU modeļos
• Ko-kultūras sferoīdi, kas ietver stromas un imūnās šūnas, modelē audzēja mikrovidi
• Standartizēti protokoli ļauj veikt augstas veiktspējas sferoīdu zāļu skrīningu, izmantojot SNU šūnu līnijas

Īpaši zema piestiprinājuma virsmas sferoīda veidošanās

Īpaši zemas piestiprināšanas (ULA) kultūru plates ir visplašāk izmantotā metode viendabīgu SNU vēža šūnu sferoīdu veidošanai. Šīm plāksnēm ir kovalenti saistītas hidrogēla virsmas, kas novērš šūnu saķeri, liekot šūnām apvienoties un veidot trīsdimensiju struktūras. ULA plākšņu apaļā dibena ģeometrija veicina viena sferoīda veidošanos katrā iedobē, ļaujot veikt kvantitatīvus testus ar minimālu mainīgumu starp iedobēm.

SNU kuņģa vēža šūnu līnijām optimālais izsējas blīvums ir no 500 līdz 5000 šūnu iedobē atkarībā no konkrētās šūnu līnijas un paredzētā sferoīda izmēra. Mazāks izsējas blīvums ļauj iegūt mazākus, kompaktākus sferoīdus, kas piemēroti zāļu iekļūšanas pētījumiem, savukārt lielāks blīvums rada lielākus sferoīdus, kuros veidojas nekrotiski kodoli, kas imitē vāji vaskularizētus audzēja reģionus. Ļoti svarīga ir optimizācija atkarībā no šūnu līnijas, jo dažādām SNU līnijām ir atšķirīga agregācijas kinētika un sablīvēšanās īpašības.

AGS šūnas ir plaši izmantots kuņģa adenokarcinomas modelis, kas 48-72 stundu laikā pēc izsēšanas veido ciešus sferoīdus. MKN-45 šūnas uzrāda ātrāku agregāciju, bet veido mazāk kompaktas struktūras, savukārt KATO-III šūnām ir unikāla sferoīdu morfoloģija, ko nosaka to signeta gredzena šūnu īpašības. MKN-74 šūnas nodrošina zarnu tipa diferenciācijas modeli, kas piemērots sferoīdu kultūrai.

Piekārto pilienu metode kontrolēta sferoīda izmēra iegūšanai

Piekārto pilienu metode ļauj precīzi kontrolēt sākotnējo šūnu skaitu un iegūto sferoīdu izmērus, suspendējot noteiktus šūnu apjomus no apgrieztām kultūru virsmām. Šī metode novērš vajadzību pēc specializētām plāksnēm un ļauj iegūt ļoti reproducējamus sferoīdu izmērus, kas ir ļoti svarīgi standartizētiem zāļu skrīninga lietojumiem. Gravitācijas spēks apvieno šūnas piliena virsotnē, veidojot sferoīdus neatkarīgi no substrāta mijiedarbības.

Standarta pakārto pilienu protokolos SNU šūnu līnijām izmanto 20-25 μl pilienus, kas satur 1 000-5 000 šūnu pilnā barotnē. Pēc 24-48 stundu ilgas sākotnējās agregācijas sferoīdus pārnes uz ULA plāksnēm vai suspensijas kultūru, lai turpinātu nogatavināšanu. Metilcelulozes (0,24 % w/v) pievienošana pilienu vidē palielina viskozitāti un novērš pilienu izkliedi, uzlabojot sferoīdu viendabīgumu.

Kolorektālā vēža sferoīdu modeļus var izmantot ne tikai kuņģa vēža vajadzībām. HCT116 šūnas veido kompaktus, ļoti reproducējamus sferoīdus, kas piemēroti augstas veiktspējas skrīninga lietojumiem. Caco-2 šūnas veido polarizētu epitēlija arhitektūru sferoīdos, savukārt DLD-1 šūnas un SW620 šūnas nodrošina papildu kolorektālās adenokarcinomas modeļus ar atšķirīgu ģenētisko fonu.

Kultūras barotnes optimizēšana sferoīdu veidošanai

Kultūras barotnes sastāvs būtiski ietekmē SNU šūnu līnijas sferoīdu veidošanās efektivitāti, morfoloģiju un dzīvotspēju. Standarta monoslāņa kultūras barotnes parasti ir jāpapildina ar bazālās membrānas ekstraktu vai modificētu seruma koncentrāciju, lai veicinātu sferoīdu sablīvēšanos. Atbilstošas bāzes barotnes un piedevu izvēle nosaka sferoīdu kvalitāti un eksperimentālo reproducējamību.

RPMI 1640 barotne ir standarta bāzes barotne lielākajai daļai SNU kuņģa un zarnu trakta vēža šūnu līniju. Seruma samazināšana no standarta 10 % līdz 2-5 % fetālā liellopu seruma veicina sferoīdu sablīvēšanos, samazinot šūnu un substrāta piesaistes signālus. Augšanas faktoru papildināšana ar EGF un bFGF veicina vēža cilmes šūnu bagātināšanu sferoīdos, ļaujot pētīt audzēju ierosinošo šūnu populācijas.

DMEM/Ham's F12 barotnes kombinācijas nodrošina alternatīvas bāzes barotnes konkrētām SNU šūnu līnijām, kurām nepieciešams atšķirīgs barības vielu sastāvs. B27 piedevas un N2 piedevas pievienošana vēl vairāk bagātina cilmes tipa populācijas sferoīdos. Saldēšanas barotne CM-1 nodrošina sferoīdu kultūru kriokonservēšanu ilgstošai uzglabāšanai un eksperimentu konsekvencei.

Sferoīdu izmēra un sablīvēšanās analīze

Sferoīdu izmēru un sablīvēšanās stāvokļa kvantitatīvs novērtējums nodrošina būtiskus kvalitātes kontroles rādītājus un eksperimentālos galapunktus. Automatizētās attēlveidošanas platformas uztver atsevišķu sferoīdu spilgtā lauka vai fāzu kontrasta attēlus, ļaujot algoritmiski izmērīt diametru, apaļumu un virsmas neregularitāti. Šie parametri korelē ar sferoīda gatavību un ļauj prognozēt zāļu iekļūšanas īpašības.

SNU kuņģa vēža sferoīdi parasti sasniedz stabilus 300-500 μm diametra izmērus 5.-7. kultūras dienā atkarībā no sākotnējā izsējas blīvuma un šūnu līnijas. Sferoīdos, kuru diametrs pārsniedz 500 μm, veidojas centrālie hipoksiskie kodoli, kas izraisa HIF ceļa aktivizāciju un metabolisko pārprogrammēšanu, modelējot hipoksisku audzēja mikrovidi. Šis hipoksiskais gradients ietekmē reakciju uz zālēm un rezistences attīstību sferoīdu modeļos.

Blīvuma rādītāji, kas aprēķināti pēc sferoīda platības attiecībā pret sākotnējo šūnu skaitu, ļauj atšķirt stingrus epitēlija tipa sferoīdus no vaļējiem mezenhima tipa agregātiem. SNU šūnu līnijas ar augstu E-kadherīna ekspresiju veido kompaktākus sferoīdus nekā šūnu līnijas, kurās notikusi epitēlija-mezenhīma pāreja. Šī morfoloģiskā atšķirība korelē ar klīniski novēroto metastātisko potenciālu un jutību pret zālēm.

Ko-kultūru sferoīdu modeļi audzēja mikrovidei

Audzēja progresēšana un atbildes reakcija uz zālēm ir būtiski atkarīga no mijiedarbības starp vēža šūnām un stromas komponentiem, tostarp fibroblastiem, endotēlija šūnām un imūnšūnām. Kopkultūru sferoīdu sistēmas, kurās ir iekļauti vairāki šūnu tipi, modelē šo mijiedarbību trīsdimensiju arhitektūrā, atklājot stromas ietekmi uz rezistenci pret zālēm un izvairīšanos no imūnsistēmas. SNU šūnu līnijas viegli veido heterotipiskus sferoīdus ar dažādām stromālo šūnu populācijām.

Ar vēzi saistīto fibroblastu (CAF) kopkultūra ar SNU kuņģa vēža šūnām rada sferoīdus ar paaugstinātu rezistenci pret zālēm, salīdzinot ar monokultūras sferoīdiem. CAF izdalītie faktori, tostarp HGF un IL-6, aktivizē vēža šūnu izdzīvošanas ceļus un pārveido ārpusšūnu matricu sferoīdos. Vēža šūnu un fibroblastu attiecību var titrēt, lai modelētu dažādas stromas infiltrācijas pakāpes.

Imūnšūnu kopkultūra ļauj pētīt audzēja un imūnā organisma mijiedarbību sferoīdu arhitektūrā. THP-1 šūnas, kas diferencētas par makrofāgiem, infiltrējas SNU sferoīdās un pieņem ar audzēju saistītu makrofāgu fenotipus. Jurkat E6.1 šūnas nodrošina T-šūnu modeļus imūnterapijas atbildes reakcijas izpētei sferoīdu kopkultūrās, savukārt K562 šūnas ļauj veikt dabisko nāvējošo šūnu citotoksicitātes pētījumus.

Uz sferoīdām balstīta augstas veiktspējas zāļu skrīnings

Automatizētas sferoīdu kultūru platformas ļauj veikt mērogojamu zāļu skrīningu, izmantojot SNU kuņģa un zarnu trakta vēža modeļus. Robotiskās šķidrumu apstrādes sistēmas izsēj šūnas 384 iedobju ULA plāksnītēs, pievieno savienojumus vairākās koncentrācijās un uzrauga sferoīdu reakciju laika gaitā, izmantojot integrētu attēlveidošanu. Šis augstas caurlaidības formāts ļauj iegūt datus par devas un reakcijas reakciju uz savienojumiem terapeitiski nozīmīgās trīsdimensiju kultūru kontekstā.

Sferoīdu dzīvotspējas novērtēšanai izmanto luminiscences ATP kvantitatīvo noteikšanu (CellTiter-Glo 3D) vai fluorescences šūnu nāves indikatorus (propīdija jodīds, SYTOX krāsvielas), kas ir saderīgi ar augstas caurlaidības lasītājiem. Lai ņemtu vērā zāļu iekļūšanas kinētiku un lēnāku proliferācijas ātrumu, trīsdimensiju kultūrām ir nepieciešams ilgāks zāļu iedarbības laiks salīdzinājumā ar monoslāņiem, parasti 72-120 stundas. Šis pagarinātais iedarbības ilgums ļauj identificēt savienojumus ar novēlotu aktivitāti, kas netika konstatēta īslaicīgos monoslāņa testos.

Augstas veiktspējas sferoīdu skrīninga kvalitātes kontrolei nepieciešamas autentificētas šūnu līnijas un standartizēti protokoli. Šūnu līniju autentifikācijas pakalpojumi pārbauda SNU šūnu līniju identitāti, izmantojot STR profilēšanu pirms skrīninga kampaņu uzsākšanas. Mikoplazmas testēšana nodrošina sferoīdu kultūru integritāti, jo mikoplazmas piesārņojums maina sferoīdu veidošanos un reakcijas uz zālēm īpašības.

Secinājums

Standartizēti sferoīdu veidošanās protokoli SNU kuņģa un zarnu trakta vēža šūnu līnijām nodrošina stabilus trīsdimensiju modeļus zāļu atklāšanai un vēža bioloģijas pētījumiem. Izvēloties piemērotas veidošanās metodes, optimizējot audzēšanas apstākļus un ieviešot kvantitatīvus kvalitātes rādītājus, pētnieki var radīt reproducējamas sferoīdu kultūras, kas piemērotas augstas veiktspējas lietojumiem. Stromālo un imūnsistēmas komponentu iekļaušana vēl vairāk uzlabo šo modeļu fizioloģisko atbilstību, veicinot laboratorijas atklājumu pārvēršanu klīniskos ieguvumos.