Spheroid Formation Protocols for SNU Gastrointestinal Cancer Cells

Các quy trình tạo khối cầu cho tế bào ung thư đường tiêu hóa của SNU

Hệ thống nuôi cấy tế bào ba chiều (3D) đã cách mạng hóa nghiên cứu ung thư bằng cách cung cấp các mô hình tái tạo chính xác hơn môi trường vi mô của khối u so với các hệ thống nuôi cấy lớp đơn hai chiều truyền thống. Các dòng tế bào ung thư đường tiêu hóa SNU, được phân lập từ bệnh nhân ung thư dạ dày và đại tràng Hàn Quốc, thể hiện khả năng hình thành khối cầu mạnh mẽ, cho phép nghiên cứu cơ chế kháng thuốc, tính đa dạng của khối u và sinh học tế bào gốc ung thư. Thiết lập các quy trình hình thành khối cầu tiêu chuẩn cho các dòng tế bào SNU đảm bảo tính tái hiện giữa các phòng thí nghiệm và thúc đẩy các ứng dụng nghiên cứu chuyển giao.

Điểm chính

• Các dòng tế bào ung thư dạ dày và đại tràng SNU tạo thành các khối cầu nhỏ gọn, có thể tái hiện, phù hợp cho các ứng dụng sàng lọc thuốc
• Bề mặt có độ bám dính cực thấp và phương pháp giọt treo tạo ra các hình thái khối cầu khác nhau với các ứng dụng khác nhau
• Kích thước và độ đặc của khối cầu tương quan với khả năng thâm nhập thuốc và biểu hiện kháng thuốc trong các mô hình SNU
• Spheroid đồng nuôi cấy kết hợp các tế bào mô liên kết và miễn dịch mô phỏng môi trường vi mô của khối u
• Các quy trình tiêu chuẩn hóa cho phép sàng lọc thuốc dựa trên khối cầu với năng suất cao sử dụng dòng tế bào SNU

Hình thành khối cầu tế bào ung thư vú siêu thấp bám dính

Đĩa nuôi cấy bề mặt bám dính cực thấp (ULA) là phương pháp được áp dụng rộng rãi nhất để tạo ra các khối cầu tế bào ung thư SNU đồng nhất. Các đĩa này có bề mặt hydrogel liên kết cộng hóa trị, ngăn chặn sự bám dính của tế bào, buộc tế bào phải tụ lại và hình thành cấu trúc ba chiều. Thiết kế đáy tròn của đĩa ULA thúc đẩy việc hình thành một khối cầu duy nhất trong mỗi giếng, cho phép thực hiện các thử nghiệm định lượng với độ biến thiên giữa các giếng tối thiểu.

Đối với các dòng tế bào ung thư dạ dày SNU, mật độ gieo tế bào tối ưu dao động từ 500 đến 5.000 tế bào mỗi giếng, tùy thuộc vào dòng tế bào cụ thể và kích thước khối cầu mong muốn. Mật độ gieo thấp cho ra các khối cầu nhỏ hơn, chặt chẽ hơn, phù hợp cho các nghiên cứu thâm nhập thuốc, trong khi mật độ cao tạo ra các khối cầu lớn hơn phát triển lõi hoại tử, mô phỏng các vùng khối u ít mạch máu. Tối ưu hóa theo dòng tế bào là cần thiết, vì các dòng SNU khác nhau có động học kết tụ và đặc điểm nén chặt khác nhau.

Tế bào AGS là mô hình ung thư tuyến dạ dày được sử dụng phổ biến, hình thành các khối cầu chặt chẽ trong vòng 48-72 giờ sau khi gieo. Tế bào MKN-45 có tốc độ kết tụ nhanh hơn nhưng hình thành các cấu trúc ít chặt chẽ hơn, trong khi tế bào KATO-III có hình thái khối cầu độc đáo do đặc điểm tế bào hình nhẫn. Tế bào MKN-74 cung cấp mô hình biệt hóa kiểu ruột phù hợp cho nuôi cấy khối cầu.

Phương pháp giọt treo để kiểm soát kích thước khối cầu

Phương pháp giọt treo cho phép kiểm soát chính xác số lượng tế bào ban đầu và kích thước khối cầu bằng cách treo các thể tích tế bào xác định từ bề mặt nuôi cấy đảo ngược. Phương pháp này loại bỏ nhu cầu sử dụng đĩa chuyên dụng và tạo ra kích thước khối cầu có độ tái hiện cao, quan trọng cho các ứng dụng sàng lọc thuốc tiêu chuẩn. Lực hấp dẫn tập trung tế bào tại đỉnh giọt, hình thành khối cầu độc lập với tương tác với nền.

Các quy trình giọt treo tiêu chuẩn cho dòng tế bào SNU sử dụng giọt có thể tích 20-25 μL chứa 1.000-5.000 tế bào trong môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh. Sau 24-48 giờ tập trung ban đầu, các khối cầu được chuyển sang đĩa ULA hoặc nuôi cấy treo lơ lửng để tiếp tục phát triển. Việc thêm methylcellulose (0,24% w/v) vào môi trường treo giọt tăng độ nhớt và ngăn giọt lan rộng, cải thiện độ đồng nhất của khối cầu.

Các mô hình khối cầu ung thư đại trực tràng mở rộng ngoài các ứng dụng ung thư dạ dày. Tế bào HCT116 tạo ra các khối cầu chặt chẽ, có độ tái hiện cao, phù hợp cho các ứng dụng sàng lọc quy mô lớn. Tế bào Caco-2 phát triển cấu trúc biểu mô phân cực bên trong khối cầu, trong khi tế bào DLD-1 và SW620 cung cấp các mô hình ung thư đại trực tràng khác với nền tảng di truyền riêng biệt.

Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy cho quá trình hình thành khối cầu

Thành phần của môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất, hình thái và độ sống của khối cầu tế bào dòng SNU. Môi trường nuôi cấy lớp đơn tiêu chuẩn thường yêu cầu bổ sung chiết xuất màng nền hoặc nồng độ huyết thanh đã điều chỉnh để thúc đẩy quá trình nén khối cầu. Việc lựa chọn môi trường cơ bản và các chất phụ gia phù hợp quyết định chất lượng khối cầu và tính tái hiện của thí nghiệm.

Môi trường RPMI 1640 được sử dụng làm môi trường cơ bản tiêu chuẩn cho hầu hết các dòng tế bào ung thư đường tiêu hóa SNU. Giảm nồng độ huyết thanh từ 10% tiêu chuẩn xuống 2-5% huyết thanh bò non thúc đẩy quá trình nén khối cầu bằng cách giảm tín hiệu gắn kết tế bào với nền. Bổ sung yếu tố tăng trưởng EGF và bFGF hỗ trợ việc làm giàu tế bào gốc ung thư trong khối cầu, cho phép nghiên cứu các quần thể tế bào khởi phát khối u.

Các kết hợpmôi trường DMEM/Ham's F12 cung cấp môi trường cơ bản thay thế cho các dòng tế bào SNU cụ thể yêu cầu thành phần dinh dưỡng khác nhau. Việc bổ sung B27 và N2 giúp tăng cường các quần thể tương tự tế bào gốc trong khối cầu. Môi trường đông lạnh CM-1 cho phép bảo quản đông lạnh các văn hóa khối cầu cho lưu trữ lâu dài và tính nhất quán của thí nghiệm.

Phân tích kích thước và độ nén của khối cầu

Đánh giá định lượng kích thước và trạng thái nén của khối cầu cung cấp các chỉ số kiểm soát chất lượng và điểm kết thúc thí nghiệm quan trọng. Các nền tảng hình ảnh tự động ghi lại hình ảnh ánh sáng hoặc tương phản pha của từng khối cầu, cho phép đo lường thuật toán đường kính, độ tròn và độ không đều bề mặt. Các thông số này tương quan với độ trưởng thành của khối cầu và dự đoán đặc tính thâm nhập thuốc.

Các khối cầu ung thư dạ dày SNU thường đạt kích thước ổn định từ 300-500 μm đường kính vào ngày 5-7 của quá trình nuôi cấy, tùy thuộc vào mật độ gieo ban đầu và dòng tế bào. Các khối cầu có đường kính vượt quá 500 μm phát triển lõi thiếu oxy trung tâm, kích hoạt con đường HIF và tái lập trình chuyển hóa, mô phỏng môi trường vi mô thiếu oxy của khối u. Gradient thiếu oxy này ảnh hưởng đến phản ứng thuốc và sự phát triển kháng thuốc trong mô hình khối cầu.

Chỉ số nén được tính toán từ diện tích khối cầu so với số lượng tế bào ban đầu giúp phân biệt các khối cầu chặt chẽ, loại biểu mô, với các khối cầu lỏng lẻo, loại trung mô. Các dòng tế bào SNU có biểu hiện E-cadherin cao hình thành các khối cầu chặt chẽ hơn so với các dòng tế bào đã trải qua quá trình chuyển đổi biểu mô-trung mô. Sự biến đổi hình thái này tương quan với tiềm năng di căn và mô hình nhạy cảm với thuốc được quan sát lâm sàng.

Mô hình khối cầu đồng nuôi cấy của môi trường vi mô khối u

Sự tiến triển của khối u và phản ứng với thuốc phụ thuộc quan trọng vào tương tác giữa tế bào ung thư và các thành phần mô liên kết bao gồm tế bào sợi, tế bào nội mô và tế bào miễn dịch. Hệ thống mô hình khối cầu đồng nuôi cấy kết hợp nhiều loại tế bào mô phỏng các tương tác này trong cấu trúc ba chiều, tiết lộ đóng góp của mô liên kết vào kháng thuốc và tránh né miễn dịch. Các dòng tế bào SNU dễ dàng hình thành các khối cầu dị loại với các quần thể tế bào mô liên kết khác nhau.

Việc đồng nuôi cấy tế bào sợi liên quan đến ung thư (CAF) với tế bào ung thư dạ dày SNU tạo ra các khối cầu có khả năng kháng thuốc cao hơn so với các khối cầu đơn nuôi cấy. Các yếu tố do CAF sản xuất, bao gồm HGF và IL-6, kích hoạt các con đường sinh tồn trong tế bào ung thư và tái cấu trúc ma trận ngoại bào bên trong các khối cầu. Tỷ lệ giữa tế bào ung thư và tế bào sợi có thể được điều chỉnh để mô phỏng các mức độ xâm nhập mô liên kết khác nhau.

Việc nuôi cấy chung với tế bào miễn dịch cho phép nghiên cứu tương tác giữa khối u và hệ miễn dịch trong cấu trúc khối cầu. Tế bào THP-1 được biệt hóa thành đại thực bào xâm nhập vào khối cầu SNU và phát triển các đặc tính của đại thực bào liên quan đến khối u. Tế bào Jurkat E6.1 cung cấp mô hình tế bào T để nghiên cứu phản ứng với liệu pháp miễn dịch trong nuôi cấy chung khối cầu, trong khi tế bào K562 cho phép nghiên cứu độc tính của tế bào giết tự nhiên.

Màn hình thuốc dựa trên khối cầu với năng suất cao

Các nền tảng nuôi cấy khối cầu tự động cho phép sàng lọc thuốc quy mô lớn sử dụng các mô hình ung thư đường tiêu hóa SNU. Hệ thống xử lý chất lỏng robot gieo tế bào vào các đĩa ULA 384 giếng, thêm các hợp chất ở nhiều nồng độ khác nhau và theo dõi phản ứng của khối cầu theo thời gian bằng hệ thống hình ảnh tích hợp. Định dạng quy mô lớn này tạo ra dữ liệu đáp ứng liều lượng trên các thư viện hợp chất trong bối cảnh nuôi cấy ba chiều có ý nghĩa điều trị.

Đánh giá độ sống của khối cầu sử dụng định lượng ATP phát quang (CellTiter-Glo 3D) hoặc các chỉ thị chết tế bào huỳnh quang (iodide propidium, thuốc nhuộm SYTOX) tương thích với các thiết bị đọc quy mô lớn. Văn hóa ba chiều yêu cầu thời gian tiếp xúc thuốc dài hơn so với văn hóa lớp đơn, thường là 72-120 giờ, để tính đến động học thâm nhập thuốc và tốc độ tăng trưởng chậm hơn. Thời gian tiếp xúc kéo dài này giúp xác định các hợp chất có hoạt tính chậm, vốn bị bỏ qua trong các thử nghiệm lớp đơn ngắn hạn.

Kiểm soát chất lượng trong sàng lọc khối cầu tế bào quy mô lớn yêu cầu các dòng tế bào được xác thực và các quy trình tiêu chuẩn hóa. Dịch vụ xác thực dòng tế bào SNU xác minh danh tính dòng tế bào thông qua phân tích STR trước khi bắt đầu các chiến dịch sàng lọc. Kiểm tra mycoplasma đảm bảo tính toàn vẹn của văn hóa khối cầu, vì nhiễm mycoplasma làm thay đổi quá trình hình thành khối cầu và đặc tính phản ứng với thuốc.

Kết luận

Các quy trình hình thành khối cầu tiêu chuẩn hóa cho dòng tế bào ung thư đường tiêu hóa SNU cung cấp các mô hình ba chiều mạnh mẽ cho nghiên cứu phát hiện thuốc và sinh học ung thư. Bằng cách lựa chọn phương pháp hình thành phù hợp, tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và áp dụng các tiêu chí chất lượng định lượng, các nhà nghiên cứu có thể tạo ra các văn hóa khối cầu có thể tái tạo, phù hợp cho các ứng dụng quy mô lớn. Việc tích hợp các thành phần mô liên kết và miễn dịch càng nâng cao tính liên quan sinh lý của các mô hình này, hỗ trợ việc chuyển đổi từ kết quả thí nghiệm sang lợi ích lâm sàng.