Neural Stem Cell Culture: Protocols for Neurosphere Formation

زراعة الخلايا الجذعية العصبية: بروتوكولات تكوين الخلايا الجذعية العصبية

تتمتع الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) بقدرة ملحوظة على التجديد الذاتي والتمايز في السلالات العصبية الرئيسية الثلاث: الخلايا العصبية والخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن. لا يزال اختبار الكرة العصبية، الذي تم تطويره في أوائل تسعينيات القرن الماضي، تقنية أساسية لعزل الخلايا الجذعية العصبية غير الجذعية وتوسيعها وتوصيفها من الأنسجة العصبية الجنينية والبالغة. يثري نظام الاستزراع المعلق ثلاثي الأبعاد هذا الخلايا ذات الخصائص الجذعية/الجينية ويوفر منصة لدراسة التطور العصبي ونمذجة الأمراض العصبية وتطوير علاجات قائمة على الخلايا لاضطرابات الجهاز العصبي.

الوجبات الرئيسية

• تتشكل كريات عصبية من الخلايا الجذعية العصبية/الجذعية الجينية المستنبتة في وسط خالٍ من المصل مع عامل النمو العصبي EGF وFGF-2
• يُظهر التمرير المتسلسل للكرات العصبية قدرة الخلايا الجذعية على التجديد الذاتي المميزة للخلايا الجذعية
• تتمايز الخلايا المشتقة من الكرات العصبية إلى خلايا عصبية وخلايا نجمية وخلايا قليلة التغصن عند سحب المولدات الميتوجينية
• يوفر حجم الكرة وكفاءة التكوين مقاييس كمية لخصائص الخلايا الجذعية العصبية غير الجذعية
• تشمل التطبيقات أبحاث التطور العصبي ونمذجة الأمراض والطب التجديدي

مبادئ تكوين الكريات العصبية

يستغل اختبار الكرية العصبية قدرة الخلايا الجذعية العصبية على البقاء والتكاثر في مزرعة معلقة خالية من المصل عند تزويدها بميتوجينات محددة. وخلافاً للخلايا العصبية المتمايزة التي تتطلب التعلق بالركيزة وعوامل بقاء المصل، تتكاثر الخلايا الجذعية العصبية غير الجذعية كمجموعات عائمة عند زراعتها بعامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الأرومة الليفية الأساسية (FGF-2/BFGFF). يثري هذا البقاء الانتقائي للخلايا ذات الخصائص الجذعية/الجديدة.

يحدث تكوين الكريات العصبية من خلال التمدد النسلي للخلايا الجذعية العصبية الفردية مع تجمع الخلايا. تُظهر تجارب التخفيف المحدود أن الكريات العصبية يمكن أن تنشأ من خلايا مفردة، مما يؤكد الأصل النسلي. ومع ذلك، تسمح ظروف الاستزراع القياسية أيضًا بالاندماج بين الكريات الكروية، مما يتطلب تفسيرًا دقيقًا لمقايسات تكوين الكريات. يقلل الطلاء ذو الكثافة النسيلية (حوالي 10 خلايا/ميكرولتر) من أحداث الاندماج.

وتعبر الخلايا الجذعية العصبية عن علامات مميزة بما في ذلك النيستين (بروتين خيوط وسيطة) وسوكس2 (عامل نسخ يحافظ على الجذعية) وموساش (بروتين مرتبط بالحمض النووي الريبي). تساعد هذه الواسمات في تحديد المجموعات السكانية الغنية بالخلايا الجذعية العصبية غير المتجانسة داخل مزارع الكريات العصبية غير المتجانسة التي تحتوي على خلايا جذعية، وسلائف عابرة للتضخيم، وسلائف أكثر التزامًا.

مصادر الأنسجة وبروتوكولات التفكيك

يمكن عزل الخلايا الجذعية العصبية من الأنسجة العصبية الجنينية والجنينية والبالغة. تُشتق الكريات العصبية الجنينية من الأنبوب العصبي أو من مناطق الدماغ النامية، مما ينتج عنه مزارع عالية التكاثر. وتحتوي الكريات العصبية البالغة من المنطقة تحت البطينية (SVZ) أو التلفيف المسنن الحصيني على المزيد من الخلايا العصبية غير الجذعية الهادئة مع تحيزات تمايزية مختلفة محتملة. يعتمد اختيار المصدر على أهداف البحث واعتبارات الأنواع.

يقلل التفكيك الميكانيكي من الضرر الأنزيمي لمستقبلات سطح الخلية المهمة لبقاء الخلايا الجذعية العصبية الوطنية وإشاراتها. يتم فرم الأنسجة وتقطيعها من خلال ماصات ذات تجويف أصغر تدريجياً لتوليد معلقات أحادية الخلية. يزيد التفكيك الأنزيمي باستخدام التربسين أو الأكوتاز من المحصول ولكنه قد يؤثر على حركية تكوين الكرة. تمنع إضافة DNase I من التكتل من الحمض النووي الصادر عن الخلايا التالفة.

بالنسبة للأبحاث البيولوجية العصبية، توفر خطوط الخلايا العصبية الراسخة نماذج تكميلية. تتمايز خلايا PC-12 المشتقة من ورم القواتم العصبي لدى الفئران إلى خلايا شبيهة بالخلايا العصبية الوديّة عند معالجة عامل النمو العصبي. وتوفر خلايا Neuro-2a نماذج للورم الأرومي العصبي لتطبيقات علم الأعصاب. تمثل خلايا U87MG نماذج الورم الأرومي الدبقي لأبحاث أورام الدماغ.

تركيبة وسط زراعة الكرية العصبية

يتكون وسط الكريات العصبية القياسي من وسط DMEM/F12 (1:1) مضافاً إليه مكملات B27 أو N2 التي توفر الأنسولين والترانسفيرين والسيلينيوم وعوامل أخرى تدعم بقاء الخلايا العصبية. وتُعد الظروف الخالية من المصل ضرورية؛ فحتى تركيزات المصل المنخفضة تعزز التمايز وتمنع تكوين الكرة. يُستكمل الوسط طازجاً بمولدات الميثوجين في كل تغذية.

يعمل عامل النمو EGF (20 نانوغرام/مل) كمولد ميتوجين أساسي لزراعة الكريات العصبية، حيث ينشط إشارات EGFR التي تعزز تكاثر الخلايا العصبية غير الجذعية. يتآزر عامل النمو الغشائي 2 (20 نانوغرام/مل) مع عامل النمو الغشائي EGF وقد يدعم مجموعات مختلفة من السلف. وتتضمن بعض البروتوكولات الهيبارين (2-5 ميكروغرام/ملل) لتثبيت عامل النمو الوظيفي FGF-2 وتعزيز نشاطه الحيوي. تؤدي إزالة هذه المولدات إلى تحفيز التمايز.

يوفرDMEM/وسيط هام F12 التركيبة الأساسية لزراعة الكريات العصبية. وتحل مكملات B27 و N2 التي تحتوي على مغذيات محددة وعوامل بقاء محل المصل. يتيح وسيط التجميد CM-1 حفظ الكريات العصبية بالتبريد أو الخلايا العصبية غير الجذعية المنفصلة بالتبريد، بينما تدعم الخيارات الخالية من المصل بروتوكولات الدرجة السريرية.

تقييم التجديد الذاتي

يوفر الترحيل المتسلسل دليلاً وظيفياً على القدرة على التجديد الذاتي. يتم فصل الخلايا الجذعية العصبية الأولية إلى خلايا مفردة، وتكرارها بكثافة محددة، وزراعتها حتى تكوين كريات عصبية ثانوية. يؤكد استمرار تكوين الكرية من خلال ممرات متعددة (عادةً 3-5 أو أكثر) وجود خلايا جذعية متجددة ذاتيًا. يشير انخفاض تكوين الكرية إلى استنفاد السلف.

تقيس كفاءة تكوين الكرات (SFE) نسبة الخلايا المطحونة القادرة على توليد كرات عصبية. وعادةً ما تنتج الأنسجة الأولية كفاءة تكوين كريات عصبية كروية بنسبة 0.1-1%، بينما تُظهر الكريات العصبية الممررة كفاءة أعلى (1-10%) مما يعكس إثراء الخلايا الجذعية غير الجذعية. ويوفر هذا التخصيب مقياساً كمياً لمقارنة خصائص الكريات العصبية غير الجذعية عبر الظروف أو الأنماط الجينية.

ويحدد تحليل التخفيف المحدود تواتر الكريات العصبية غير الجذعية داخل مزارع الكريات العصبية. تُطْرَح الخلايا بكثافات أقل تدريجياً، ويتم تسجيل الآبار لتكوين الكريات العصبية. تُقدّر إحصائيات بواسون تواتر الخلايا البادئة للكرات الكروية، وتميز بين مزارع الكريات العصبية ذات الخصائص السائبة المتشابهة ولكن محتوى الكريات العصبية غير الجذعية مختلف.

بروتوكولات التمايز

يتطلب التمايز بين الكريات العصبية سحب المولدات الميتوجينية وتوفير ركيزة التعلق. تولد خلايا الكرية العصبية المنفصلة الموضوعة على أسطح مغطاة بالبولي دي ليسين أو اللامينين في وسط يحتوي على المصل أو وسط محدد مزارع مختلطة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن. ويفضل التمايز الافتراضي عادةً إنتاج الخلايا النجمية، مما يعكس البرنامج التطوري للخلايا العصبية غير الجذعية البالغة.

يتم تعزيز تمايز الخلايا العصبية من خلال ظروف زراعة محددة. يعزز العلاج بحمض الريتينويك مصير الخلايا العصبية، كما تفعل عوامل التغذية العصبية BDNF وNT-3. يوجّه تنشيط مسار القنفذ الصوتي المصير العصبي البطني، بينما تؤثر الإشارات الظهرية (BMPs، Wnts) على الأنماط الظاهرية الظهرية. وتعتمد الأنماط الفرعية العصبية الناتجة على الهوية الإقليمية للمجتمعات العصبية غير الجذعية المصدرية وبروتوكولات التحريض.

يتطلب التمايز بين الخلايا قليلة التغصن فترات استزراع ممتدة (2-4 أسابيع) ومجموعات عوامل محددة. يعمل عامل PDGF على تعزيز تكاثر سلائف الخلايا قليلة التغصن قليلة التغصن، في حين أن هرمون الغدة الدرقية (T3) وسحب الميثوجينات يعزز التمايز النهائي. عادةً ما يكون توليد الخلايا قليلة التغصّن أقل كفاءة من إنتاج الخلايا العصبية أو الخلايا النجمية من مزارع الكريات العصبية القياسية.

التطبيقات في نمذجة الأمراض

تتيح الكريات العصبية من حيوانات نموذج المرض أو الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) المستمدة من المرضى إمكانية نمذجة الأمراض العصبية. تُظهر الكريات العصبية من نماذج الأمراض الوراثية أنماطاً ظاهرية تعكس الفيزيولوجيا المرضية للمرض. وقد أنتج هذا النهج نماذج لأمراض التنكس العصبي وأورام الدماغ واضطرابات النمو العصبي.

يحدد الفحص الدوائي باستخدام أنظمة الكريات العصبية المركبات التي تؤثر على تكاثر الخلايا العصبية غير الجذعية أو بقائها أو تمايزها. تقوم فحوصات الكريات العصبية عالية الإنتاجية بفحص مكتبات المركبات للتأثيرات العصبية. تخضع النتائج التي تم تحديدها للتحقق الثانوي بما في ذلك فحوصات التمايز والتوصيف الوظيفي للذرية المتمايزة.

تُشكل الخلايا الجذعية لأورام الدماغ كرات ورمية مماثلة للكرات العصبية الطبيعية ولكن بخصائص نمو شاذة. تُظهِر الخلايا الجذعية للورم الأرومي الدبقي تشكيل كريات كروية معززة ومقاومة للإشعاع وقدرة على تكوين الأورام. ويمثل استهداف الخلايا الجذعية لأورام الدماغ استراتيجية علاجية تعالج تكرار الورم.

الاعتبارات التقنية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

يرتبط حجم الكرية العصبية بمدة الاستزراع وكثافة الخلايا ولكنه لا يشير مباشرةً إلى محتوى الخلايا الجذعية العصبية غير الجذعية. قد تحتوي الكريات الكبيرة على خلايا متمايزة أو محتضرة في المقام الأول في نواتها. يوازن الحجم الأمثل للكرات (قطر 100-200 ميكرومتر) بين النمو والحفاظ على الخلايا السليمة. يمنع الترحيل المنتظم النمو الزائد.

تضمن مراقبة حيوية الخلية سلامة الكرة طوال فترة الاستزراع. يحدد استبعاد التريبان الأزرق أو التلطيخ الحي/الميت المستنبتات التي تعاني من موت الخلايا المفرط مما يشير إلى ظروف دون المستوى الأمثل. تظهر الكريات العصبية السليمة مشرقة الطور بحدود ناعمة؛ بينما تشير الأشكال غير المنتظمة أو المراكز المظلمة إلى وجود مشاكل.

تؤكدمصادقة خط الخلية هوية خطوط الخلايا العصبية المستخدمة في دراسات الكريات العصبية. يمنع اختبار الميكوبلازما التلوث الذي يغير سلوك الخلايا العصبية غير الجذعية وقدرتها على التمايز. تضمن مقاييس الجودة هذه إجراء أبحاث قابلة للتكرار في مجال الكريات العصبية.

الخلاصة

توفر مزرعة الكرية العصبية منصة قوية لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية العصبية، ونمذجة الأمراض العصبية، وتطوير علاجات قائمة على الخلايا. وتتيح البروتوكولات الموحدة لتكوين الكريات العصبية وتمريرها وتمايزها إمكانية إجراء أبحاث قابلة للتكرار في المختبرات. يستمر تكامل تقنيات الكرية العصبية مع الأدوات الحديثة بما في ذلك تحرير الجينوم وتحليل الخلية الواحدة في تعزيز فهم التطور العصبي والأمراض العصبية.