Neural Stem Cell Culture: Protocols for Neurosphere Formation

Văn hóa tế bào gốc thần kinh: Quy trình hình thành neurosphere

Tế bào gốc thần kinh (NSCs) có khả năng tự tái tạo và biệt hóa thành ba dòng tế bào thần kinh chính: neuron, astrocyte và oligodendrocyte. Phương pháp neurosphere, được phát triển vào đầu những năm 1990, vẫn là kỹ thuật cơ bản để tách chiết, nhân giống và đặc trưng hóa NSCs từ mô thần kinh phôi thai và người lớn. Hệ thống nuôi cấy ba chiều dạng huyền phù này giúp tập trung các tế bào có tính chất gốc/tiền thân và cung cấp nền tảng để nghiên cứu sự phát triển thần kinh, mô phỏng các bệnh lý thần kinh và phát triển các liệu pháp dựa trên tế bào cho các rối loạn hệ thần kinh.

Điểm chính

• Các neurosphere hình thành từ các tế bào gốc/tiền thân thần kinh được nuôi cấy trong môi trường không chứa huyết thanh với EGF và FGF-2
• Việc truyền liên tiếp các neurospheres cho thấy khả năng tự tái tạo đặc trưng của tế bào gốc
• Các tế bào được phân lập từ neurospheres phân hóa thành neuron, astrocyte và oligodendrocyte khi loại bỏ yếu tố kích thích
• Kích thước và hiệu suất hình thành neurosphere cung cấp các chỉ số định lượng về đặc tính của tế bào gốc thần kinh (NSC)
• Ứng dụng bao gồm nghiên cứu phát triển thần kinh, mô hình hóa bệnh tật và y học tái tạo

Nguyên lý hình thành neurosphere

Phép thử neurosphere tận dụng khả năng của tế bào gốc thần kinh (NSC) để tồn tại và phân chia trong môi trường nuôi cấy không chứa huyết thanh khi được cung cấp các yếu tố kích thích phân chia cụ thể. Khác với các tế bào thần kinh đã biệt hóa cần sự bám dính vào chất nền và các yếu tố tồn tại trong huyết thanh, NSCs phân chia dưới dạng các khối tế bào nổi khi được nuôi cấy với yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF) và yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi cơ bản (FGF-2/bFGF). Sự tồn tại chọn lọc này làm giàu cho các tế bào có tính chất gốc/tiền thân.

Hình thành neurosphere diễn ra thông qua sự mở rộng dòng tế bào của các tế bào gốc thần kinh riêng lẻ kết hợp với sự kết tụ tế bào. Các thí nghiệm pha loãng giới hạn cho thấy neurosphere có thể hình thành từ một tế bào duy nhất, xác nhận nguồn gốc dòng tế bào. Tuy nhiên, điều kiện nuôi cấy tiêu chuẩn cũng cho phép sự hợp nhất giữa các neurosphere, đòi hỏi phải giải thích cẩn thận các thử nghiệm hình thành neurosphere. Việc gieo tế bào với mật độ dòng tế bào (khoảng 10 tế bào/μL) giúp giảm thiểu các sự kiện hợp nhất.

Tế bào gốc thần kinh biểu hiện các dấu hiệu đặc trưng bao gồm nestin (một protein sợi trung gian), Sox2 (một yếu tố chuyển vị duy trì tính chất gốc) và Musashi (một protein liên kết RNA). Các dấu hiệu này giúp xác định các quần thể giàu NSC trong các văn hóa neurosphere hỗn hợp chứa tế bào gốc, tiền thân tăng sinh và các tiền thân đã cam kết hơn.

Nguồn mô và quy trình phân tách

Tế bào gốc thần kinh có thể được tách chiết từ mô thần kinh phôi thai, thai nhi và người trưởng thành. Các neurosphere phôi thai được tạo ra từ ống thần kinh hoặc các vùng não đang phát triển, cho ra các văn hóa có khả năng phân chia cao. Các neurosphere người trưởng thành từ vùng dưới màng nhện (SVZ) hoặc vùng răng hàm hải mã chứa nhiều tế bào gốc thần kinh (NSC) ở trạng thái nghỉ ngơi với các xu hướng biệt hóa tiềm năng khác nhau. Việc lựa chọn nguồn phụ thuộc vào mục tiêu nghiên cứu và các yếu tố liên quan đến loài.

Phân tách cơ học giảm thiểu tổn thương enzym đối với các thụ thể bề mặt tế bào quan trọng cho sự sống còn và tín hiệu của NSC. Mô được cắt nhỏ và nghiền qua các ống tiêm có đường kính ngày càng nhỏ để tạo ra hỗn hợp tế bào đơn. Phân tách enzym sử dụng trypsin hoặc Accutase tăng năng suất nhưng có thể ảnh hưởng đến động học hình thành cầu. Thêm DNase I ngăn chặn sự kết tụ do DNA được giải phóng từ các tế bào bị tổn thương.

Đối với nghiên cứu thần kinh sinh học, các dòng tế bào thần kinh đã được thiết lập cung cấp các mô hình bổ sung. Tế bào PC-12, được phân lập từ u tủy thượng thận của chuột, phân hóa thành các tế bào thần kinh giao cảm tương tự sau khi được xử lý bằng yếu tố tăng trưởng thần kinh. Tế bào Neuro-2a cung cấp mô hình u thần kinh cho các ứng dụng thần kinh học. Tế bào U87MG đại diện cho mô hình u não cho nghiên cứu u não.

Công thức môi trường nuôi cấy neurosphere

Phương pháp nuôi cấy neurosphere tiêu chuẩn bao gồm DMEM/F12 (tỷ lệ 1:1) được bổ sung với B27 hoặc N2, cung cấp insulin, transferrin, selenium và các yếu tố khác hỗ trợ sự sống còn của tế bào thần kinh. Điều kiện không chứa huyết thanh là cần thiết; ngay cả nồng độ huyết thanh thấp cũng thúc đẩy sự biệt hóa và ức chế quá trình hình thành neurosphere. Dung dịch nuôi cấy được bổ sung tươi với các chất kích thích phân bào tại mỗi lần cấp dưỡng.

EGF (20 ng/mL) là chất kích thích chính cho nuôi cấy neurosphere, kích hoạt tín hiệu EGFR để thúc đẩy sự phát triển của tế bào gốc thần kinh (NSC). FGF-2 (20 ng/mL) tương tác với EGF và có thể hỗ trợ các quần thể tiền thân khác nhau. Một số quy trình bao gồm heparin (2-5 μg/mL) để ổn định FGF-2 và tăng cường hoạt tính sinh học của nó. Việc loại bỏ các chất kích thích này kích hoạt quá trình biệt hóa.

DMEM/Ham's F12 Medium cung cấp công thức cơ bản cho nuôi cấy neurosphere. Các chất bổ sung B27 và N2 chứa các chất dinh dưỡng và yếu tố sinh tồn được định nghĩa thay thế huyết thanh. Dung dịch đông lạnh CM-1 cho phép bảo quản đông lạnh neurosphere hoặc NSC đã tách rời, trong khi các tùy chọn không chứa huyết thanh hỗ trợ các quy trình đạt tiêu chuẩn lâm sàng.

Đánh giá khả năng tự tái tạo

Việc nuôi cấy liên tục cung cấp bằng chứng chức năng về khả năng tự tái tạo. Các neurosphere nguyên phát được tách thành tế bào đơn lẻ, gieo lại với mật độ xác định và nuôi cấy cho đến khi hình thành neurosphere thứ cấp. Việc tiếp tục hình thành neurosphere qua nhiều lần nuôi cấy (thường là 3-5 lần hoặc hơn) xác nhận sự hiện diện của tế bào gốc có khả năng tự tái tạo. Sự suy giảm trong việc hình thành neurosphere cho thấy sự cạn kiệt của tế bào tiền thân.

Hiệu suất hình thành neurosphere (SFE) đo lường tỷ lệ tế bào được cấy có khả năng tạo ra neurosphere. Vùng mô ban đầu thường cho SFE từ 0,1-1%, trong khi neurosphere được truyền qua nhiều lần có SFE cao hơn (1-10%), phản ánh sự giàu có của tế bào gốc thần kinh (NSC). SFE cung cấp một chỉ số định lượng để so sánh đặc tính của NSC giữa các điều kiện hoặc kiểu gen.

Phân tích pha loãng giới hạn xác định tần suất NSC trong văn hóa neurosphere. Tế bào được gieo với mật độ ngày càng thấp, và các giếng được đánh giá về khả năng hình thành neurosphere. Thống kê Poisson ước tính tần suất của các tế bào khởi đầu neurosphere, phân biệt giữa các văn hóa neurosphere có đặc tính tổng thể tương tự nhưng hàm lượng NSC khác nhau.

Các quy trình biệt hóa

Phân hóa neurosphere yêu cầu loại bỏ mitogen và cung cấp chất nền bám dính. Các tế bào neurosphere được phân tách và gieo trên bề mặt phủ poly-D-lysine hoặc laminin trong môi trường chứa huyết thanh hoặc môi trường định nghĩa sẽ tạo ra các văn hóa hỗn hợp của neuron, astrocyte và oligodendrocyte. Phân hóa mặc định thường ưa chuộng sản xuất astrocyte, phản ánh chương trình phát triển của NSC người lớn.

Phân hóa neuron được tăng cường bởi các điều kiện nuôi cấy cụ thể. Điều trị bằng acid retinoic thúc đẩy số phận neuron, cũng như các yếu tố thần kinh BDNF và NT-3. Kích hoạt con đường Sonic hedgehog hướng tới số phận thần kinh bụng, trong khi các tín hiệu dorsal hóa (BMPs, Wnts) ảnh hưởng đến các biểu hiện dorsal. Các loại neuron kết quả phụ thuộc vào danh tính khu vực của NSC nguồn và các quy trình kích thích.

Sự biệt hóa oligodendrocyte yêu cầu thời gian nuôi cấy kéo dài (2-4 tuần) và các kết hợp yếu tố cụ thể. PDGF thúc đẩy sự tăng sinh của tiền thân oligodendrocyte, trong khi hormone tuyến giáp (T3) và việc loại bỏ các yếu tố kích thích phân bào thúc đẩy sự biệt hóa cuối cùng. Việc tạo ra oligodendrocyte thường kém hiệu quả hơn so với việc sản xuất neuron hoặc astrocyte từ các văn hóa neurosphere tiêu chuẩn.

Ứng dụng trong mô hình bệnh tật

Các neurosphere từ động vật mô hình bệnh hoặc tế bào gốc đa năng được cảm ứng từ bệnh nhân (iPSCs) cho phép mô hình hóa bệnh lý thần kinh. Các neurosphere từ mô hình bệnh di truyền thể hiện các biểu hiện phản ánh cơ chế bệnh lý. Phương pháp này đã tạo ra các mô hình cho các bệnh thoái hóa thần kinh, u não và rối loạn phát triển thần kinh.

Màn hình thuốc sử dụng hệ thống neurosphere xác định các hợp chất ảnh hưởng đến sự tăng sinh, sự sống còn hoặc sự biệt hóa của tế bào gốc thần kinh (NSC). Các thử nghiệm neurosphere quy mô lớn sàng lọc các thư viện hợp chất để tìm tác động thần kinh. Các hợp chất được xác định sẽ trải qua quá trình xác minh thứ cấp bao gồm các thử nghiệm biệt hóa và đặc trưng chức năng của các tế bào con biệt hóa.

Tế bào gốc u não hình thành các khối u tương tự như neurospheres bình thường nhưng có đặc tính tăng trưởng bất thường. Tế bào gốc glioblastoma thể hiện khả năng hình thành khối u tăng cường, kháng xạ và khả năng khởi phát u. Mục tiêu vào tế bào gốc u não đại diện cho một chiến lược điều trị nhằm giải quyết tái phát u.

Xem xét kỹ thuật và khắc phục sự cố

Kích thước neurosphere tương quan với thời gian nuôi cấy và mật độ tế bào nhưng không trực tiếp chỉ ra hàm lượng tế bào gốc thần kinh (NSC). Các neurosphere lớn có thể chứa chủ yếu các tế bào đã biệt hóa hoặc đang chết ở lõi. Kích thước neurosphere tối ưu (đường kính 100-200 μm) cân bằng giữa tăng trưởng và duy trì tế bào khỏe mạnh. Việc chuyển cấy định kỳ ngăn ngừa sự phát triển quá mức.

Theo dõi độ sống của tế bào đảm bảo sức khỏe của khối cầu trong suốt quá trình nuôi cấy. Phương pháp loại trừ Trypan blue hoặc nhuộm sống/chết giúp xác định các mẫu nuôi cấy có tỷ lệ tế bào chết quá cao, cho thấy điều kiện nuôi cấy không tối ưu. Các khối cầu khỏe mạnh có màu sáng đều với biên giới mịn; hình dạng bất thường hoặc trung tâm tối cho thấy có vấn đề.

Xác thực dòng tế bào xác nhận danh tính của các dòng tế bào thần kinh được sử dụng trong nghiên cứu neurosphere. Kiểm tra mycoplasma ngăn ngừa nhiễm khuẩn làm thay đổi hành vi và khả năng biệt hóa của NSC. Các biện pháp chất lượng này đảm bảo nghiên cứu neurosphere có thể tái hiện.

Kết luận

Văn hóa neurosphere cung cấp một nền tảng mạnh mẽ để nghiên cứu sinh học tế bào gốc thần kinh, mô phỏng các bệnh thần kinh và phát triển các liệu pháp dựa trên tế bào. Các quy trình tiêu chuẩn hóa cho việc hình thành, truyền và biệt hóa neurosphere cho phép nghiên cứu có thể tái hiện giữa các phòng thí nghiệm. Việc tích hợp các kỹ thuật neurosphere với các công cụ hiện đại như chỉnh sửa gen và phân tích tế bào đơn tiếp tục thúc đẩy sự hiểu biết về sự phát triển thần kinh và bệnh tật.