Neural Stem Cell Culture: Protocols for Neurosphere Formation

Култура на невронни стволови клетки: Протоколи за формиране на невросфери

Невронните стволови клетки (НСК) притежават забележителната способност за самообновяване и диференциране в трите основни невронни линии: неврони, астроцити и олигодендроцити. Тестът за невросфери, разработен в началото на 90-те години на миналия век, остава основополагаща техника за изолиране, разширяване и характеризиране на НСК от ембрионални и възрастни нервни тъкани. Тази система за триизмерна суспензионна култура обогатява клетките със свойства на стволови/прогениторни и осигурява платформа за изучаване на нервното развитие, моделиране на неврологични заболявания и разработване на клетъчни терапии за нарушения на нервната система.

Основни изводи

• Невросфери се образуват от невронни стволови/прогениторни клетки, култивирани в среда без серум с EGF и FGF-2
• Серийното пасиране на невросфери демонстрира способността за самообновяване, характерна за стволовите клетки
• Клетките, получени от невросфери, се диференцират в неврони, астроцити и олигодендроцити след отнемане на митогена
• Размерът на сферите и ефективността на образуване осигуряват количествени показатели за свойствата на НСК
• Приложенията обхващат изследвания на невронното развитие, моделиране на заболявания и регенеративна медицина

Принципи на формиране на невросфери

Тестът за невросфери използва способността на невронните стволови клетки да оцеляват и да се размножават в безсерумна суспензионна култура, когато са снабдени със специфични митогени. За разлика от диференцираните невронни клетки, които се нуждаят от прикрепване към субстрат и серумни фактори за оцеляване, НСК се размножават като плаващи агрегати при култивиране с епидермален растежен фактор (EGF) и основен фибробластен растежен фактор (FGF-2/bFGF). Това селективно оцеляване обогатява клетките със стволови/прогениторни свойства.

Образуването на невросфери става чрез клоново разрастване на отделни НСК, съчетано с агрегация на клетките. Експериментите за ограничаване на разреждането показват, че невросферите могат да възникнат от единични клетки, което потвърждава клоналния произход. Стандартните условия на култивиране обаче позволяват и сливане на сфери, което изисква внимателно тълкуване на тестовете за образуване на сфери. Поставянето на клонална плътност (приблизително 10 клетки/μL) свежда до минимум случаите на сливане.

Невронните стволови клетки експресират характерни маркери, включително nestin (протеин от междинни нишки), Sox2 (транскрипционен фактор, поддържащ стволовия характер) и Musashi (РНК-свързващ протеин). Тези маркери помагат да се идентифицират обогатените популации от НСК в хетерогенни невросферни култури, съдържащи стволови клетки, транзитно амплифициращи се прогенитори и по-ангажирани прекурсори.

Източници на тъкани и протоколи за дисоциация

Невронните стволови клетки могат да бъдат изолирани от ембрионални, фетални и възрастни невронни тъкани. Ембрионалните невросфери произхождат от невронната тръба или от развиващите се мозъчни области, като дават силно пролиферативни култури. Възрастните невросфери от субвентрикуларната зона (SVZ) или хипокампалната зъбчата гируса съдържат по-спокойни НСК с потенциално различни диференциационни пристрастия. Изборът на източници зависи от целите на изследването и съображенията за вида.

Механичната дисоциация свежда до минимум ензимното увреждане на рецепторите на клетъчната повърхност, важни за оцеляването и сигнализацията на НСК. Тъканта се раздробява и тритурира чрез пипети с все по-малки отвори, за да се получат едноклетъчни суспензии. Ензимната дисоциация с използване на трипсин или акутаза увеличава добива, но може да повлияе на кинетиката на образуване на сфери. Добавянето на ДНаза I предотвратява образуването на струпвания от ДНК, освободена от увредени клетки.

За невробиологични изследвания установените невронни клетъчни линии осигуряват допълнителни модели. PC-12 Клетките, получени от феохромоцитом на плъх, се диференцират в симпатикови невроноподобни клетки при третиране с нервен растежен фактор. Клетките Neuro-2a предоставят модели на невробластом за приложения в неврологията. Клетките U87MG представляват модели на глиобластома за изследване на мозъчни тумори.

Състав на средата за култивиране на невросфери

Стандартната среда за невросфери се състои от DMEM/F12 (1:1), допълнена с добавки B27 или N2, които осигуряват инсулин, трансферин, селен и други фактори, подпомагащи оцеляването на невронните клетки. Условията без серум са от съществено значение; дори ниски концентрации на серум насърчават диференциацията и инхибират образуването на сфери. Средата се допълва със свежи митогени при всяко хранене.

EGF (20 ng/ml) служи като основен митоген за култивиране на невросфери, като активира сигнализацията на EGFR, която насърчава пролиферацията на NSC. FGF-2 (20 ng/mL) синергизира с EGF и може да поддържа различни популации от прогенитори. Някои протоколи включват хепарин (2-5 μg/mL) за стабилизиране на FGF-2 и повишаване на неговата биоактивност. Премахването на тези митогени предизвиква диференциация.

Средата DMEM/Ham's F12 представлява основната формула за култивиране на невросфери. Добавки B27 и N2, съдържащи определени хранителни вещества и фактори за оцеляване, заместват серума. Средата за замразяване CM-1 дава възможност за криоконсервация на невросфери или дисоциирани НСК, докато вариантите без серум поддържат протоколи от клиничен клас.

Оценка на самоподновяването

Серийното пасиране осигурява функционална демонстрация на способността за самообновяване. Първичните невросфери се разделят на единични клетки, размножават се при определена плътност и се култивират до образуване на вторични невросфери. Продължаващото образуване на сфери през множество пасажи (обикновено 3-5 или повече) потвърждава наличието на самообновяващи се стволови клетки. Намаляващото образуване на сфери показва изчерпване на прогениторите.

Ефективността на образуване на сфери (SFE) определя количествено дела на плакираните клетки, способни да образуват невросфери. Първичната тъкан обикновено дава SFE от 0,1-1 %, докато пасираните невросфери показват по-висока SFE (1-10 %), което отразява обогатяването на NSC. SFE предоставя количествена метрика за сравняване на свойствата на NSC при различни условия или генотипове.

Анализът на лимитиращото разреждане определя честотата на НСК в невросферните култури. Клетките се пласират при прогресивно по-ниска плътност, а кладенчетата се оценяват за образуване на сфери. Статистиката на Поасон оценява честотата на клетките, иницииращи образуването на сфери, като разграничава невросферни култури със сходни обемни свойства, но с различно съдържание на NSC.

Протоколи за диференциране

Диференцирането на невросфери изисква отнемане на митогена и осигуряване на субстрат за прикрепване. Дисоциираните невросферни клетки, напластени върху повърхности, покрити с поли-D-лизин или ламинин, в среда, съдържаща серум или определена среда, генерират смесени култури от неврони, астроцити и олигодендроцити. Диференциацията по подразбиране обикновено благоприятства производството на астроцити, което отразява програмата за развитие на възрастните НСК.

Невронната диференциация се засилва от специфични условия на култивиране. Третирането с ретиноева киселина подпомага съдбата на невроните, както и невротрофичните фактори BDNF и NT-3. Активирането на пътя на Sonic hedgehog насочва съдбата на вентралните неврони, докато дорзалните сигнали (BMPs, Wnts) влияят върху дорзалните фенотипи. Получените невронни подтипове зависят от регионалната идентичност на изходните НСК и протоколите за индукция.

Диференцирането на олигодендроцити изисква продължителни периоди на култивиране (2-4 седмици) и специфични комбинации от фактори. PDGF насърчава пролиферацията на олигодендроцитните прогенитори, докато тиреоидният хормон (T3) и оттеглянето на митогените насърчават терминалната диференциация. Генерирането на олигодендроцити обикновено е по-малко ефективно от производството на неврони или астроцити от стандартни невросферни култури.

Приложения при моделиране на заболявания

Невросфери от животни, които са модел на заболяване, или от индуцирани плурипотентни стволови клетки (iPSC), получени от пациенти, позволяват моделиране на невронни заболявания. Невросферите от генетични модели на заболявания показват фенотипи, отразяващи патофизиологията на заболяването. Чрез този подход са създадени модели за невродегенеративни заболявания, мозъчни тумори и нарушения на невроразвитието.

Скринингът на лекарства с помощта на невросферни системи идентифицира съединения, които влияят върху пролиферацията, оцеляването или диференциацията на НСК. Високопроизводителни невросферни тестове проверяват библиотеки от съединения за невронни ефекти. Идентифицираните попадения се подлагат на вторично валидиране, включително тестове за диференциация и функционално характеризиране на диференцирани потомства.

Стволовите клетки на мозъчните тумори образуват туморни сфери, аналогични на нормалните невросфери, но с аберантни свойства на растеж. Стволовите клетки на глиобластома демонстрират засилено образуване на сфери, устойчивост на радиация и способност за иницииране на тумори. Насочването към стволовите клетки на мозъчните тумори представлява терапевтична стратегия за справяне с рецидивите на туморите.

Технически съображения и отстраняване на неизправности

Размерът на невросферата корелира с продължителността на култивиране и плътността на клетките, но не показва пряко съдържанието на НСК. Големите сфери могат да съдържат предимно диференцирани или умиращи клетки в ядрата си. Оптималният размер на сферата (100-200 μm диаметър) балансира растежа с поддържането на здрави клетки. Редовното пасиране предотвратява свръхрастежа.

Мониторингът на жизнеспособността на клетките гарантира здравето на сферите по време на култивирането. Изключването на трипановото синьо или оцветяването на живи/мъртви клетки идентифицира култури с прекомерна клетъчна смърт, което показва неоптимални условия. Здравите невросфери изглеждат фазово светли с гладки граници; неправилните форми или тъмните центрове предполагат проблеми.

Удостоверяването на клетъчните линии потвърждава идентичността на невронните клетъчни линии, използвани във връзка с изследванията на невросферите. Тестването за микоплазма предотвратява замърсяване, което променя поведението на НСК и капацитета за диференциация. Тези мерки за качество гарантират възпроизводими изследвания на невросфери.

Заключение

Културата на невросфери осигурява мощна платформа за изучаване на биологията на невронните стволови клетки, моделиране на неврологични заболявания и разработване на клетъчни терапии. Стандартизираните протоколи за формиране на сфери, пасиране и диференциране позволяват възпроизводими изследвания в различни лаборатории. Интегрирането на техниките за невросфери със съвременни инструменти, включително редактиране на генома и анализ на единични клетки, продължава да задълбочава разбирането на невронното развитие и болестите.