Neural Stem Cell Culture: Protocols for Neurosphere Formation

神經幹細胞培養：神經球形成實驗方案

神經幹細胞（NSCs）具備非凡的自我更新能力，並能分化為三大神經細胞系：神經元、星形膠質細胞及少突膠質細胞。 神經球檢測法於 1990 年代初期開發，至今仍是從胚胎及成人神經組織中分離、擴增及鑑定神經幹細胞的基礎技術。 這種三維懸浮培養系統能富集具有幹細胞／前體細胞特性的細胞，並為研究神經發育、建構神經系統疾病模型，以及開發針對神經系統疾病的細胞療法提供了平台。

重點摘要

• 神經球由在含 EGF 和 FGF-2 的無血清培養基中培養的神經幹細胞／前體細胞形成
• 神經球的連續傳代顯示出幹細胞特有的自我更新能力
• 在撤除細胞分裂因子後，神經球衍生的細胞會分化為神經元、星形膠質細胞及少突膠質細胞
• 神經球的大小與形成效率可作為神經幹細胞特性的定量指標
• 應用範圍涵蓋神經發育研究、疾病模型建立及再生醫學

神經球形成的原理

神經球檢測法利用神經幹細胞在獲得特定有絲分裂原後，於無血清懸浮培養中存活與增殖的能力。 與需要附著於基質並依賴血清生存因子才能存活的分化神經細胞不同，神經幹細胞在添加表皮生長因子（EGF）和鹼性成纖維細胞生長因子（FGF-2/bFGF）的培養條件下，會以懸浮聚集体形式增殖。這種選擇性存活機制能富集具有幹細胞／前體細胞特性的細胞。

神經球形成是透過單個神經幹細胞的克隆擴增與細胞聚集共同作用而產生。極限稀釋實驗證明，神經球可由單一細胞產生，這證實了其克隆起源。然而，標準培養條件也會導致神經球之間的融合，因此必須謹慎解讀神經球形成實驗的結果。 採用克隆密度接種（約 10 個細胞/μL）可將融合事件降至最低。

神經幹細胞表達特徵性標記物，包括 nestin（一種中間絲蛋白）、Sox2（一種維持幹細胞特性的轉錄因子）以及 Musashi（一種 RNA 結合蛋白）。 這些標記有助於在異質性神經球培養物中識別富含神經幹細胞（NSC）的群體，該培養物中包含幹細胞、過渡增殖前體細胞以及分化程度更高的前體細胞。

組織來源與分離方案

神經幹細胞可從胚胎、胎兒和成人的神經組織中分離出來。胚胎神經球源自神經管或發育中的腦區，可產生增殖能力極高的培養物。 來自側腦室下區（SVZ）或海馬齒狀回的成人神經球則含有更多靜息狀態的神經幹細胞，其分化傾向可能有所不同。來源的選擇取決於研究目標及物種考量。

機械性分離可將酶解對神經幹細胞存活與訊號傳導至關重要的細胞表面受體造成的損傷降至最低。組織經由逐漸縮小內徑的移液管進行切碎與研磨，以產生單細胞懸浮液。使用胰蛋白酶或 Accutase 進行酶解分離雖可提高產量，但可能會影響球體的形成動力學。 添加 DNase I 可防止因受損細胞釋放的 DNA 導致細胞凝集。

對於神經生物學研究而言，已建立的神經細胞系可提供互補性模型。源自大鼠嗜鉻細胞瘤的 PC-12 細胞，在神經生長因子處理下會分化為類似交感神經元的細胞。Neuro-2a 細胞為神經科學應用提供神經母細胞瘤模型。U87MG 細胞則是腦腫瘤研究中的膠質母細胞瘤模型。

神經球培養基配方

標準神經球培養基由 DMEM/F12（1:1）組成，並添加 B27 或 N2 補充劑，其中含有胰島素、轉鐵蛋白、硒及其他支持神經細胞存活的因子。必須採用無血清條件；即使低濃度的血清也會促進分化並抑制球體形成。每次換液時，均需新鮮添加細胞分裂原至培養基中。

EGF（20 ng/mL）是神經球培養的主要細胞分裂因子，可激活 EGFR 訊號傳導，從而促進神經幹細胞（NSC）增殖。 FGF-2（20 ng/mL）與 EGF 產生協同作用，並可能支持不同的前體細胞群。部分實驗方案會加入肝素（2-5 μg/mL）以穩定 FGF-2 並增強其生物活性。移除這些細胞增殖因子會觸發分化。

DMEM/Ham's F12 培養基為神經球培養提供基礎配方。含有特定營養素與生存因子的 B27 及 N2 補充劑可取代血清。CM-1 冷凍培養基可實現神經球或離散神經幹細胞（NSCs）的冷凍保存，而無血清選項則適用於臨床級別的實驗方案。

發佈日期：2023年 | 最後審閱日期：2026年5月

自我更新評估

連續傳代可功能性驗證自我更新能力。將原代神經球解離為單一細胞，以特定密度重新接種，並培養至形成二次神經球為止。 若經多次傳代（通常為 3–5 次或更多）後仍持續形成神經球，即證實存在具有自我更新能力的幹細胞；若神經球形成量逐漸減少，則表示前體細胞已耗竭。

神經球形成效率（SFE）量化了能產生神經球的接種細胞比例。 原代組織的 SFE 通常為 0.1–1%，而經傳代的神經球則顯示較高的 SFE（1–10%），反映神經幹細胞（NSC）的富集。SFE 提供了一項定量指標，可用於比較不同條件或基因型下神經幹細胞的特性。

極限稀釋分析用於測定神經球培養物中的神經幹細胞（NSC）頻率。將細胞以逐漸降低的密度接種，並對各孔中的球體形成情況進行評分。透過泊松統計估算球體起始細胞的頻率，藉此區分具有相似整體特性但神經幹細胞含量不同的神經球培養物。

分化實驗方案

神經球的分化需要撤除細胞分裂素並提供附著基質。 將分離的神經球細胞接種於聚-D-賴胺酸或層黏蛋白包被的表面，並使用含血清或定義培養基，可產生由神經元、星形膠質細胞及少突膠質細胞組成的混合培養物。預設的分化過程通常傾向於產生星形膠質細胞，這反映了成人神經幹細胞的發育程式。

透過特定的培養條件，可增強神經元分化。 維甲酸處理可促進神經元分化，神經營養因子 BDNF 和 NT-3 亦然。Sonic hedgehog 途徑的活化會引導腹側神經分化，而背側化訊號（BMPs、Wnts）則影響背側表型。最終形成的神經元亞型取決於來源神經幹細胞的區域特徵以及誘導方案。

少突膠質細胞的分化需要較長的培養時間（2-4 週）以及特定的因子組合。血小板衍生生長因子（PDGF）可促進少突膠質細胞前體的增殖，而甲狀腺激素（T3）及去除有絲分裂原則可促進終末分化。 相較於標準神經球培養所產生的神經元或星形膠質細胞，少突膠質細胞的生成效率通常較低。

在疾病建模中的應用

來自疾病模型動物或患者來源誘導多能幹細胞（iPSCs）的神經球，可應用於神經疾病建模。來自遺傳性疾病模型的神經球所展現的表型，能反映疾病的病理生理學特徵。此方法已成功建立神經退行性疾病、腦腫瘤及神經發育障礙的模型。

利用神經球系統進行藥物篩選，可識別出影響神經幹細胞（NSC）增殖、存活或分化的化合物。高通量神經球檢測可篩選化合物庫以評估其對神經系統的影響。經識別的候選化合物將進行二次驗證，包括分化檢測以及分化後代細胞的功能表徵。

腦腫瘤幹細胞會形成與正常神經球相似的腫瘤球，但具有異常的生長特性。膠質母細胞瘤幹細胞展現出增強的球體形成能力、抗輻射性及腫瘤起始能力。針對腦腫瘤幹細胞進行治療，是應對腫瘤復發的一種治療策略。

技術考量與疑難排解

神經球大小與培養時間及細胞密度相關，但並不能直接反映神經幹細胞（NSC）的含量。大型神經球的核心可能主要由已分化或凋亡的細胞組成。最佳神經球大小（直徑 100–200 μm）能在細胞生長與維持健康細胞之間取得平衡。定期傳代可防止過度增生。

監測細胞存活率可確保神經球在整個培養過程中的健康狀態。透過台盼藍排斥法或活死細胞染色，可識別細胞死亡過多的培養物，這通常表示培養條件未達最佳狀態。健康的神經球在顯微鏡下呈現相位明亮且邊界平滑的狀態；若形狀不規則或中心呈深色，則暗示存在問題。

細胞系認證可確認用於神經球研究的神經細胞系之身分。進行支原體檢測可防止污染，以免影響神經幹細胞的行為及分化能力。這些品質管控措施可確保神經球研究具有可重複性。

結論

神經球培養為研究神經幹細胞生物學、建模神經系統疾病以及開發細胞療法提供了強大的平台。針對神經球形成、傳代及分化的標準化操作流程，使不同實驗室間的研究結果具有可重複性。將神經球技術與基因組編輯及單細胞分析等現代工具相結合，持續深化我們對神經發育與疾病的理解。