Neural Stem Cell Culture: Protocols for Neurosphere Formation

Neuronų kamieninių ląstelių kultūra: Neurosferų formavimo protokolai

Nervų kamieninės ląstelės (NKL) pasižymi ypatingu gebėjimu savaime atsinaujinti ir diferencijuotis į tris pagrindines nervų linijas: neuronus, astrocitus ir oligodendrocitus. XX a. dešimtojo dešimtmečio pradžioje sukurtas neurosferų tyrimas tebėra pagrindinis metodas, skirtas NSC iš embrioninių ir suaugusių nervinių audinių išskirti, išplėsti ir apibūdinti. Ši trimatė suspensinių kultūrų sistema praturtina ląsteles, pasižyminčias kamieninėmis ir (arba) genitorinėmis savybėmis, ir suteikia galimybę tirti nervų vystymąsi, modeliuoti neurologines ligas ir kurti nervų sistemos sutrikimų ląstelinę terapiją.

Pagrindinės išvados

• Neurosferos susidaro iš nervų kamieninių ir (arba) genitorinių ląstelių, kultivuojamų terpėje be serumo su EGF ir FGF-2
• Neurosferų serijinis pasaugojimas rodo kamieninėms ląstelėms būdingą savęs atnaujinimo gebėjimą
• Iš neurosferų gautos ląstelės diferencijuojasi į neuronus, astrocitus ir oligodendrocitus po mitogeno pašalinimo
• Sferų dydis ir formavimosi efektyvumas leidžia kiekybiškai įvertinti NSC savybes
• Taikomos neuronų raidos tyrimams, ligų modeliavimui ir regeneracinei medicinai

Neurosferų formavimo principai

Neurosferos tyrime naudojamas nervų kamieninių ląstelių gebėjimas išgyventi ir daugintis suspensijos kultūroje be serumo, kai joms suteikiama specifinių mitogenų. Kitaip nei diferencijuotos nervinės ląstelės, kurioms reikia prisitvirtinti prie substrato ir išlikimo serume veiksnių, NSC dauginasi kaip plūduriuojantys agregatai, kai kultivuojamos su epidermio augimo faktoriumi (EGF) ir pagrindiniu fibroblastų augimo faktoriumi (FGF-2/bFGF). Šis selektyvus išgyvenimas praturtina kamieninių ir (arba) genitorinių savybių turinčias ląsteles.

Neurosferos susidaro dėl atskirų NSC kloninio išsiplėtimo ir ląstelių agregacijos. Ribinio skiedimo eksperimentai rodo, kad neurosferos gali susidaryti iš pavienių ląstelių, o tai patvirtina kloninę kilmę. Tačiau standartinės auginimo sąlygos taip pat sudaro sąlygas sferų ir sferų susiliejimui, todėl reikia atidžiai interpretuoti sferų formavimosi tyrimus. Kloninio tankio (maždaug 10 ląstelių/μL) sodinimas sumažina susiliejimo atvejų skaičių.

Nervų kamieninės ląstelės išreiškia būdingus žymenis, įskaitant nestiną (tarpinių gijų baltymą), Sox2 (transkripcijos veiksnį, palaikantį kamieniškumą) ir Musashi (RNR jungiantį baltymą). Šie žymenys padeda identifikuoti NSC praturtintas populiacijas heterogeninėse neurosferų kultūrose, kuriose yra kamieninių ląstelių, tranzitinių amplifikuojančių progenitorių ir labiau įsitvirtinusių pirmtakų.

Audinių šaltiniai ir disociacijos protokolai

Nervų kamieninės ląstelės gali būti išskirtos iš embriono, vaisiaus ir suaugusio žmogaus nervų audinių. Embrioninės neurosferos gaunamos iš nervinio vamzdelio arba besivystančių smegenų sričių, todėl jų kultūros labai dauginasi. Suaugusiųjų neurosferose iš subventrikulinės zonos (SVZ) arba hipokampo dentatinės gyslos yra daugiau ramybės būsenoje esančių NSC, kurių diferenciacijos tendencijos gali skirtis. Šaltinio pasirinkimas priklauso nuo mokslinių tyrimų tikslų ir rūšies aplinkybių.

Mechaninė disociacija iki minimumo sumažina fermentinį ląstelių paviršiaus receptorių, svarbių NSC išlikimui ir signalizavimui, pažeidimą. Audiniai susmulkinami ir trituiruojami vis mažesnio skersmens pipetėmis, kad susidarytų pavienių ląstelių suspensijos. Fermentinė disociacija naudojant tripsiną arba akutazę padidina išeigą, bet gali turėti įtakos sferų formavimosi kinetikai. Pridėjus DNazės I, išvengiama DNR, išsiskiriančios iš pažeistų ląstelių, susitelkimo.

Neurobiologiniams tyrimams sukurti neuroninių ląstelių linijų modeliai yra papildomi modeliai. PC-12 ląstelės, gautos iš žiurkių feochromocitomos, diferencijuojasi į į simpatinius neuronus panašias ląsteles, veikiant nervų augimo faktoriumi. Neuro-2a ląstelės yra neuroblastomos modeliai neurobiologiniams tyrimams. U87MG ląstelės yra glioblastomos modeliai smegenų navikų tyrimams.

Neurosferų kultūrų terpės sudėtis

Standartinę neurosferų terpę sudaro DMEM/F12 (1:1), papildyta B27 arba N2 priedais, kurie suteikia insulino, transferino, seleno ir kitų veiksnių, palaikančių nervinių ląstelių išgyvenamumą. Labai svarbu, kad nebūtų serumo; net maža serumo koncentracija skatina diferenciaciją ir slopina sferų formavimąsi. Kiekvieno maitinimo metu terpė papildoma naujais mitogenais.

EGF (20 ng/ml) yra pagrindinis mitogenas neurosferų kultūroje, aktyvuojantis EGFR signalus, kurie skatina NSK proliferaciją. FGF-2 (20 ng/ml) sinergizuoja EGF ir gali palaikyti skirtingas progenitorių populiacijas. Į kai kuriuos protokolus įtraukiamas heparinas (2-5 μg/ml), kad stabilizuotų FGF-2 ir padidintų jo biologinį aktyvumą. Pašalinus šiuos mitogenus, prasideda diferenciacija.

DMEM/Ham's F12 terpė yra pagrindinė neurosferų kultūrosterpė. Serumą pakeičia B27 ir N2 priedai, kuriuose yra nustatytų maistinių medžiagų ir išgyvenimo veiksnių. Užšaldymo terpė CM-1 leidžia kriokonservuoti neurosferas arba disocijuotus NSC, o be serumo galima naudoti klinikinio lygio protokolus.

Savęs atnaujinimo vertinimas

Serijinis pasažavimas leidžia funkcionaliai parodyti savęs atnaujinimo gebėjimą. Pirminės neurosferos išskiriamos į atskiras ląsteles, dauginamos nustatytu tankumu ir auginamos, kol susiformuoja antrinės neurosferos. Nepertraukiamas sferų formavimasis per kelis kartus (paprastai 3-5 ar daugiau) patvirtina, kad yra savaime atsinaujinančių kamieninių ląstelių. Mažėjantis sferų formavimasis rodo, kad progenitoriai išsekę.

Sferų formavimosi efektyvumas (SFE) kiekybiškai įvertina ląstelių, galinčių suformuoti neurosferas, dalį. Pirminio audinio SFE paprastai siekia 0,1-1 %, tuo tarpu pasyvintų neurosferų SFE yra didesnis (1-10 %), o tai atspindi NSC praturtinimą. SFE yra kiekybinis rodiklis, leidžiantis palyginti skirtingų sąlygų ar genotipų NSC savybes.

Ribinio praskiedimo analizė nustato NSK dažnį neurosferų kultūrose. Ląstelės dengiamos vis mažesniu tankumu, o duobutės vertinamos pagal sferų susidarymą. Pagal Poissono statistiką įvertinamas sferas inicijuojančių ląstelių dažnumas, taip išskiriant neurosferų kultūras, turinčias panašias tūrines savybes, bet skirtingą NSC kiekį.

Diferencijavimo protokolai

Neurosferų diferenciacijai reikia pašalinti mitogenus ir suteikti prijungimo substratą. Disocijuotos neurosferos ląstelės, paskleistos ant poli-D-lizinu arba lamininu dengtų paviršių serumo turinčioje arba apibrėžtoje terpėje, sukuria mišrias neuronų, astrocitų ir oligodendrocitų kultūras. Numatytoji diferenciacija paprastai yra palankesnė astrocitų gamybai, o tai atspindi suaugusių NSC vystymosi programą.

Neuronų diferenciaciją sustiprina specifinės kultūros sąlygos. Gydymas retinoine rūgštimi skatina neuronų likimą, taip pat neurotrofiniai veiksniai BDNF ir NT-3. Sonic hedgehog kelio aktyvavimas lemia ventralinį neuronų likimą, o dorsalizuojantys signalai (BMP, Wnts) daro įtaką dorsaliniams fenotipams. Susidarantys neuronų potipiai priklauso nuo NSC šaltinio regioninio tapatumo ir indukcijos protokolų.

Oligodendrocitų diferenciacijai reikalingas ilgesnis auginimo laikotarpis (2-4 savaitės) ir specifiniai veiksnių deriniai. PDGF skatina oligodendrocitų progenitorių proliferaciją, o skydliaukės hormonas (T3) ir mitogenų atsisakymas - terminalinę diferenciaciją. Oligodendrocitų gamyba paprastai yra mažiau efektyvi nei neuronų ar astrocitų gamyba iš standartinių neurosferų kultūrų.

Taikymas modeliuojant ligas

Neurosferos, gautos iš ligų modelio gyvūnų arba iš pacientų gautų indukuotų pluripotentinių kamieninių ląstelių (iPSC), leidžia modeliuoti nervų ligas. Genetinių ligų modelių neurosferos pasižymi fenotipais, atspindinčiais ligos patofiziologiją. Taikant šį metodą sukurti neurodegeneracinių ligų, smegenų navikų ir neurologinių raidos sutrikimų modeliai.

Atliekant vaistų atranką naudojant neurosferų sistemas nustatomi junginiai, turintys įtakos NSC proliferacijai, išlikimui ar diferenciacijai. Didelio našumo neurosferų bandymai leidžia patikrinti junginių bibliotekas dėl poveikio nervams. Identifikuoti hitai yra antriniai patvirtinami, įskaitant diferenciacijos tyrimus ir diferencijuotų palikuonių funkcinį apibūdinimą.

Smegenų naviko kamieninės ląstelės formuoja naviko sferas, analogiškas įprastoms neurosferoms, tačiau pasižyminčias pakitusiomis augimo savybėmis. Glioblastomos kamieninės ląstelės pasižymi geresniu sferų formavimusi, atsparumu radiacijai ir gebėjimu inicijuoti naviką. Smegenų naviko kamieninių ląstelių nukreipimas į kamienines ląsteles yra terapinė strategija, padedanti kovoti su naviko atsinaujinimu.

Techniniai aspektai ir trikčių šalinimas

Neurosferos dydis koreliuoja su kultūros trukme ir ląstelių tankiu, tačiau tiesiogiai nerodo NSC kiekio. Didelių sferų branduoliuose gali būti daugiausia diferencijuotų arba mirštančių ląstelių. Optimalus sferos dydis (100-200 μm skersmens) subalansuoja augimą ir sveikų ląstelių išsaugojimą. Reguliarus pasažavimas apsaugo nuo peraugimo.

Ląstelių gyvybingumo stebėsena užtikrina, kad sferos būtų sveikos visos kultūros metu. Trypano mėlynojo išskyrimas arba gyvų ir negyvų ląstelių dažymas leidžia nustatyti, ar kultūrose yra pernelyg daug mirusių ląstelių, o tai rodo, kad sąlygos nėra optimalios. Sveikos neurosferos yra faziškai ryškios, jų ribos lygios; netaisyklingos formos ar tamsūs centrai rodo problemas.

Ląstelių linijų autentiškumo nustatymas patvirtina nervinių ląstelių linijų, naudojamų kartu su neurosferų tyrimais, tapatumą. Mikoplazmos testavimas apsaugo nuo užteršimo, kuris keičia NSC elgseną ir diferenciacijos gebėjimą. Šios kokybės priemonės užtikrina atkuriamus neurosferų tyrimus.

Išvada

Neurosferų kultūra yra galinga platforma, leidžianti tirti neuroninių kamieninių ląstelių biologiją, modeliuoti neurologines ligas ir kurti ląstelėmis pagrįstus gydymo būdus. Standartizuoti sferų formavimo, pasavimo ir diferenciacijos protokolai leidžia atkurti tyrimus įvairiose laboratorijose. Neurosferų metodų integravimas su šiuolaikinėmis priemonėmis, įskaitant genomo redagavimą ir vienos ląstelės analizę, padeda geriau suprasti nervų vystymąsi ir ligas.