Neural Stem Cell Culture: Protocols for Neurosphere Formation

神经干细胞培养：神经球形成规程

神经干细胞（NSCs）具有自我更新和分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞这三大神经系的非凡能力。20 世纪 90 年代初开发的神经球试验仍是从胚胎和成体神经组织中分离、扩增和鉴定 NSCs 的基础技术。这种三维悬浮培养系统可富集具有干细胞/祖细胞特性的细胞，为研究神经发育、神经系统疾病建模和开发神经系统疾病的细胞疗法提供了一个平台。

主要启示

• 神经干/祖细胞在含 EGF 和 FGF-2 的无血清培养基中培养形成神经球
• 神经球的连续传代显示了干细胞特有的自我更新能力
• 神经球衍生细胞在有丝分裂原撤除后分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞
• 球体大小和形成效率提供了 NSC 特性的量化指标
• 应用范围涵盖神经发育研究、疾病建模和再生医学

神经球形成原理

神经球试验利用了神经干细胞在无血清悬浮培养中获得特定有丝分裂原后存活和增殖的能力。与需要基质附着和血清存活因子的分化神经细胞不同，当使用表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2/bFGF）培养时，神经干细胞会以浮游聚集的形式增殖。这种选择性存活方式可富集具有干细胞/祖细胞特性的细胞。

神经球的形成是通过单个神经干细胞的克隆扩增和细胞聚集实现的。极限稀释实验证明神经球可由单个细胞产生，从而证实了克隆起源。然而，标准培养条件也允许球-球融合，因此需要对球形成实验进行仔细解读。克隆密度培养（约 10 个细胞/μL）可将融合事件降至最低。

神经干细胞表达特征性标记，包括nestin（一种中间丝蛋白）、Sox2（一种维持干性的转录因子）和Musashi（一种RNA结合蛋白）。这些标记物有助于在包含干细胞、过渡增殖祖细胞和更稳定的前体的异质神经球培养物中识别富含 NSC 的群体。

组织来源和分离方案

神经干细胞可从胚胎、胎儿和成人神经组织中分离出来。胚胎神经球来自神经管或发育中的大脑区域，可产生高增殖培养物。来自室管膜下区（SVZ）或海马齿状回的成体神经球含有更多静止的 NSCs，可能具有不同的分化偏向。来源选择取决于研究目标和物种考虑。

机械解离可最大限度地减少对细胞表面受体的酶损伤，这些受体对 NSC 的存活和信号传导非常重要。通过孔径逐渐变小的移液管对组织进行碾碎和氚化，生成单细胞悬浮液。使用胰蛋白酶或加速酶进行酶解可提高产量，但可能会影响球形成动力学。添加 DNase I 可防止受损细胞释放的 DNA 产生团块。

对于神经生物学研究，已建立的神经细胞系提供了补充模型。PC-12 细胞来源于大鼠嗜铬细胞瘤，经神经生长因子处理后可分化为交感神经样细胞。Neuro-2a 细胞为神经科学应用提供了神经母细胞瘤模型。U87MG 细胞代表胶质母细胞瘤模型，用于脑肿瘤研究。

神经球培养基配方

标准神经球培养基由 DMEM/F12 （1:1）和 B27 或 N2 补充剂组成，后者可提供胰岛素、转铁蛋白、硒和其他支持神经细胞存活的因子。无血清条件至关重要；即使低浓度血清也会促进分化并抑制球体形成。每次喂养时，培养基都要补充新鲜的有丝分裂原。

表皮生长因子（20 毫微克/毫升）是神经球培养的主要有丝分裂原，可激活表皮生长因子受体信号，促进 NSC 增殖。FGF-2（20纳克/毫升）与EGF协同作用，可支持不同的祖细胞群。有些方案包括肝素（2-5 微克/毫升），以稳定 FGF-2 并增强其生物活性。去除这些有丝分裂原可引发分化。

DMEM/Ham's F12 培养基是神经球培养的基本配方。B27 和 N2 补充剂含有确定的营养物质和存活因子，可替代血清。冷冻培养基 CM-1可用于神经球或离体 NSC 的冷冻保存，而无血清选择则支持临床级方案。

自我更新评估

连续传代可提供自我更新能力的功能性证明。将原代神经球解离成单细胞，以规定的密度进行复制，并培养至继代神经球形成。通过多次传代（通常 3-5 次或更多）持续形成球体，证实存在自我更新干细胞。球形成率下降表明祖细胞耗竭。

球形成效率（SFE）可量化能生成神经球的培养细胞比例。原代组织的球形成效率通常为 0.1-1%，而传代神经球的球形成效率更高（1-10%），这反映了 NSC 的富集。SFE 为比较不同条件或基因型的 NSC 特性提供了量化指标。

极限稀释分析可确定神经球培养物中的 NSC 频率。以逐渐降低的密度培养细胞，并对培养孔的球形形成情况进行评分。泊松统计估算球形启动细胞的频率，从而区分具有相似体积特性但NSC含量不同的神经球培养物。

分化程序

神经球的分化需要有丝分裂原的撤出和附着基质的提供。解离的神经球细胞在含血清培养基或特定培养基中被置于聚-D-赖氨酸或层粘蛋白涂层表面，产生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的混合培养物。默认分化通常倾向于产生星形胶质细胞，这反映了成体 NSC 的发育程序。

特定的培养条件可促进神经元分化。视黄酸处理能促进神经元的命运，神经营养因子BDNF和NT-3也是如此。音速刺猬通路的激活会引导腹侧神经的命运，而背侧信号（BMPs、Wnts）则会影响背侧表型。由此产生的神经元亚型取决于源 NSCs 的区域特性和诱导方案。

少突胶质细胞的分化需要延长培养期（2-4 周）和特定的因子组合。PDGF能促进少突胶质细胞祖细胞增殖，而甲状腺激素（T3）和有丝分裂原的撤除则能促进终末分化。少突胶质细胞的生成效率通常低于标准神经球培养的神经元或星形胶质细胞。

在疾病模型中的应用

来自疾病模型动物或患者诱导多能干细胞（iPSC）的神经球可用于神经疾病建模。遗传疾病模型的神经球表现出反映疾病病理生理学的表型。这种方法已经产生了神经退行性疾病、脑肿瘤和神经发育障碍的模型。

利用神经球系统进行药物筛选，可确定影响 NSC 增殖、存活或分化的化合物。高通量神经球试验筛选出对神经有影响的化合物库。对识别出的新药进行二次验证，包括分化试验和分化后代的功能鉴定。

脑肿瘤干细胞形成的肿瘤球类似于正常神经球，但具有异常生长特性。胶质母细胞瘤干细胞具有更强的球体形成能力、抗辐射能力和肿瘤诱发能力。以脑肿瘤干细胞为靶点是解决肿瘤复发的一种治疗策略。

技术注意事项和故障排除

神经球的大小与培养时间和细胞密度相关，但并不直接表示NSC的含量。大球的核心可能主要含有已分化或濒死的细胞。最佳的球体大小（直径 100-200 μm）可在生长与维持健康细胞之间取得平衡。定期传代可防止过度生长。

细胞活力监测可确保整个培养过程中球体的健康。胰蓝排除法或活/死染色法可识别细胞过度死亡的培养物，这表明培养条件不理想。健康的神经球看起来相位明亮，边界光滑；形状不规则或中心发暗则表明存在问题。

细胞系鉴定可确认神经球研究中使用的神经细胞系的身份。支原体检测可防止改变 NSC 行为和分化能力的污染。这些质量措施确保了神经球研究的可重复性。

结论

神经球培养为研究神经干细胞生物学、神经疾病建模和开发基于细胞的疗法提供了一个强大的平台。神经球形成、通过和分化的标准化方案使不同实验室的研究具有可重复性。将神经球技术与基因组编辑和单细胞分析等现代工具相结合，可继续推进对神经发育和疾病的了解。