Neural Stem Cell Culture: Protocols for Neurosphere Formation

Neuraalisten kantasolujen viljely: Neurosphere Formation: Neurosphere Formation - Protokollien muodostaminen

Neuraalisilla kantasoluilla (NSC-soluilla) on huomattava kyky uudistua ja erilaistua kolmeksi tärkeimmäksi hermostolinjaksi: neuroneiksi, astrosyyteiksi ja oligodendrosyyteiksi. Neurosphere-assay, joka kehitettiin 1990-luvun alussa, on edelleen perustavanlaatuinen tekniikka NSC:iden eristämisessä, laajentamisessa ja luonnehtimisessa alkion ja aikuisen hermokudoksesta. Tämä kolmiulotteinen suspensioviljelyjärjestelmä rikastaa soluja, joilla on kantasolujen/progenitorien ominaisuuksia, ja se tarjoaa alustan hermoston kehityksen tutkimiseen, neurologisten sairauksien mallintamiseen ja hermoston sairauksien solupohjaisten hoitomuotojen kehittämiseen.

Keskeiset asiat

• Neuropallot muodostuvat neuraalisista kantasoluista/progenitorisoluista, joita viljellään seerumittomassa väliaineessa, jossa on EGF- ja FGF-2-soluja
• Neurosfäärien sarjapassagointi osoittaa kantasoluille ominaisen uudistumiskyvyn
• Neurosfääristä peräisin olevat solut erilaistuvat neuroneiksi, astrosyyteiksi ja oligodendrosyyteiksi mitogeenin vetämisen jälkeen
• Pallon koko ja muodostumistehokkuus tarjoavat kvantitatiivisia mittareita NSC:n ominaisuuksista
• Sovellukset kattavat hermoston kehityksen tutkimuksen, sairauksien mallintamisen ja regeneratiivisen lääketieteen

Neurosfäärien muodostumisen periaatteet

Neurosfäärimäärityksessä hyödynnetään hermokantasolujen kykyä selviytyä ja lisääntyä seerumivapaassa suspensioviljelmässä, kun niille annetaan erityisiä mitogeenejä. Toisin kuin erilaistuneet hermosolut, jotka vaativat substraattiin kiinnittymistä ja seerumin eloonjäämistekijöitä, hermosolut lisääntyvät kelluvina aggregaatteina, kun niitä viljellään epidermisen kasvutekijän (EGF) ja perusfibroblastikasvutekijän (FGF-2/bFGF) kanssa. Tämä selektiivinen eloonjääminen rikastuttaa soluja, joilla on kantasolujen/progenitorien ominaisuuksia.

Neurosfäärien muodostuminen tapahtuu yksittäisten NSC-solujen kloonisen laajenemisen ja solujen aggregoitumisen kautta. Rajoittavat laimennuskokeet osoittavat, että neurosfäärit voivat syntyä yksittäisistä soluista, mikä vahvistaa kloonisen alkuperän. Standardiviljelyolosuhteet mahdollistavat kuitenkin myös pallon ja pallon fuusion, mikä edellyttää pallonmuodostuskokeiden huolellista tulkintaa. Klonaalinen tiheysistutus (noin 10 solua/μl) minimoi fuusiotapahtumat.

Neuraaliset kantasolut ilmentävät tyypillisiä merkkiaineita, kuten nestiniä (välijuoste-proteiini), Sox2:ta (kantasolujen toimintaa ylläpitävä transkriptiotekijä) ja Musashia (RNA:ta sitova proteiini). Nämä merkkiaineet auttavat tunnistamaan NSC-rikastuneita populaatioita heterogeenisissä neurosfääriviljelmissä, jotka sisältävät kantasoluja, siirtymävaiheessa olevia lisääntymiskykyisiä esiasteita ja sitoutuneempia esiasteita.

Kudoslähteet ja dissosiaatio-protokollat

Neuraalisia kantasoluja voidaan eristää alkion, sikiön ja aikuisen hermokudoksesta. Alkion neurosfäärit ovat peräisin hermostoputken tai kehittyvien aivojen alueilta, ja ne tuottavat erittäin proliferatiivisia viljelmiä. Aikuisten neurosfäärit subventrikulaarisesta vyöhykkeestä (SVZ) tai hippokampuksen dentate gyrus -alueesta sisältävät hiljaisempia NSC-soluja, joilla on mahdollisesti erilaiset erilaistumisviat. Lähteen valinta riippuu tutkimustavoitteista ja lajeihin liittyvistä näkökohdista.

Mekaaninen dissosiaatio minimoi entsymaattiset vauriot solujen pintareseptoreille, jotka ovat tärkeitä NSC:n eloonjäämiselle ja signaloinnille. Kudos hienonnetaan ja trituroidaan yhä pienempien pipettien läpi, jotta saadaan aikaan yksittäissolususpensioita. Entsymaattinen dissosiaatio trypsiinillä tai akkutaasilla lisää saantoa, mutta saattaa vaikuttaa pallonmuodostuksen kinetiikkaan. DNaasi I:n lisääminen estää vaurioituneista soluista vapautuvan DNA:n aiheuttaman paakkuuntumisen.

Neurobiologista tutkimusta varten vakiintuneet hermosolulinjat tarjoavat täydentäviä malleja. Rotan feokromosytoomasta peräisin olevat PC-12-solut erilaistuvat sympaattisen neuronin kaltaisiksi soluiksi, kun niitä käsitellään hermokasvutekijällä. Neuro-2a-solut tarjoavat neuroblastooma-malleja neurotieteellisiin sovelluksiin. U87MG-solut edustavat glioblastoomamalleja aivokasvaintutkimusta varten.

Neurosphere-kasvatusmediumin koostumus

Neurosfäärien vakiomuotoinen väliaine koostuu DMEM/F12:sta (1:1), jota on täydennetty B27- tai N2-lisäaineilla, jotka tarjoavat insuliinia, transferriiniä, seleeniä ja muita hermosolujen selviytymistä tukevia tekijöitä. Seerumivapaat olosuhteet ovat välttämättömät; jopa alhaiset seerumipitoisuudet edistävät erilaistumista ja estävät pallonmuodostusta. Väliaine täydennetään tuoreella mitogeeneillä jokaisen ruokinnan yhteydessä.

EGF (20 ng/ml) toimii neurosfääriviljelyn ensisijaisena mitogeenina, joka aktivoi EGFR-signaalin, joka edistää NSC:n proliferaatiota. FGF-2 (20 ng/ml) synergisoi EGF:n kanssa ja voi tukea erilaisia esiasteiden populaatioita. Joihinkin protokolliin sisältyy hepariinia (2-5 μg/ml) FGF-2:n stabiloimiseksi ja sen bioaktiivisuuden lisäämiseksi. Näiden mitogeenien poistaminen käynnistää erilaistumisen.

DMEM/Ham's F12 -medium on perusvalmiste neurosfäärien viljelyyn. B27- ja N2-lisäaineet, jotka sisältävät määriteltyjä ravintoaineita ja eloonjäämistekijöitä, korvaavat seerumin. Freeze Medium CM-1 mahdollistaa neurosfäärien tai dissosioituneiden NSC:iden kryosäilytyksen, ja seerumittomat vaihtoehdot tukevat kliinisen tason protokollia.

Itsensä uudistamisen arviointi

Sarjapassagointi mahdollistaa itsestään uusiutumiskyvyn toiminnallisen osoittamisen. Primaariset neurosfäärit dissosioidaan yksittäisiksi soluiksi, monistetaan määritellyllä tiheydellä ja viljellään, kunnes muodostuu sekundaarisia neurosfäärejä. Pallojen jatkuva muodostuminen useiden läpikäyntien (tyypillisesti 3-5 tai useamman) aikana vahvistaa itseuudistuvien kantasolujen olemassaolon. Pallonmuodostuksen väheneminen osoittaa progenitorien ehtymistä.

Pallonmuodostustehokkuus (SFE) mittaa niiden solujen osuuden, jotka pystyvät muodostamaan neuropalloja. Primaarikudoksen SFE on tyypillisesti 0,1-1 %, kun taas passivoitujen neurosfäärien SFE on korkeampi (1-10 %), mikä kuvastaa NSC:n rikastumista. SFE tarjoaa kvantitatiivisen mittarin NSC-ominaisuuksien vertailemiseksi eri olosuhteissa tai genotyypeissä.

Rajoittava laimennusanalyysi määrittää NSC-tiheyden neurosfääriviljelmissä. Soluja istutetaan asteittain pienemmillä tiheyksillä, ja kuopat pisteytetään pallonmuodostuksen osalta. Poisson-tilastot arvioivat pallon muodostavien solujen esiintymistiheyttä, jolloin voidaan erottaa toisistaan neurosfääriviljelmät, joilla on samanlaiset bulkkiominaisuudet mutta erilainen NSC-pitoisuus.

Erilaistamisprotokollat

Neurosfäärien erilaistuminen edellyttää mitogeenin poistamista ja kiinnityssubstraatin tarjoamista. Dissosioituneet neurosfäärisolut, jotka on sijoitettu poly-D-lysiini- tai laminiinipinnoitetuille pinnoille seerumia sisältävään tai määriteltyyn väliaineeseen, tuottavat neuronien, astrosyyttien ja oligodendrosyyttien sekaviljelmiä. Oletusdifferentiaatio suosii tyypillisesti astrosyyttituotantoa, mikä heijastaa aikuisten NSC-solujen kehitysohjelmaa.

Neuronaalista erilaistumista tehostavat erityiset viljelyolosuhteet. Retinohappokäsittely edistää neuronien kohtaloa, samoin kuin neurotrofiset tekijät BDNF ja NT-3. Sonic hedgehog -reitin aktivoituminen ohjaa ventraalista hermostollista kohtaloa, kun taas dorsaaliset signaalit (BMP:t, Wnts) vaikuttavat dorsaalisiin fenotyyppeihin. Tuloksena syntyvät neuronien alatyypit riippuvat lähteenä olevien NSC:iden alueellisesta identiteetistä ja induktioprotokolloista.

Oligodendrosyyttien erilaistuminen edellyttää pitkiä viljelyjaksoja (2-4 viikkoa) ja erityisiä tekijäyhdistelmiä. PDGF edistää oligodendrosyyttien progenitorien proliferaatiota, kun taas kilpirauhashormoni (T3) ja mitogeenien poistaminen edistävät terminaalista erilaistumista. Oligodendrosyyttien tuottaminen on tyypillisesti tehottomampaa kuin neuronien tai astrosyyttien tuottaminen tavanomaisista neurosfääriviljelmistä.

Sovellukset sairauksien mallintamisessa

Sairausmallieläimistä tai potilaista peräisin olevista indusoiduista pluripotenteista kantasoluista (iPSC) saadut neurosfäärit mahdollistavat hermosairauksien mallintamisen. Geneettisistä tautimalleista saadut neurosfäärit osoittavat taudin patofysiologiaa heijastavia fenotyyppejä. Tällä lähestymistavalla on tuotettu malleja neurodegeneratiivisille sairauksille, aivokasvaimille ja hermoston kehityshäiriöille.

Neurosfäärijärjestelmiä hyödyntävässä lääkeseulonnassa tunnistetaan yhdisteitä, jotka vaikuttavat NSC:n lisääntymiseen, eloonjäämiseen tai erilaistumiseen. Korkean läpimenon neurosfäärikokeissa seulotaan yhdisteiden kirjastoja hermostovaikutusten varalta. Tunnistetut osumat validoidaan toissijaisesti, mukaan lukien erilaistumiskokeet ja erilaistuneiden jälkeläisten toiminnallinen karakterisointi.

Aivokasvainten kantasolut muodostavat kasvainpalloja, jotka ovat analogisia normaalien neuropallojen kanssa, mutta joilla on poikkeavat kasvuominaisuudet. Glioblastooman kantasolut osoittavat tehostettua pallonmuodostusta, säteilynkestävyyttä ja kasvainten käynnistyskykyä. Aivokasvaimen kantasolujen kohdentaminen on terapeuttinen strategia, jolla voidaan puuttua kasvaimen uusiutumiseen.

Tekniset näkökohdat ja vianmääritys

Neurosfäärin koko korreloi viljelyn keston ja solutiheyden kanssa, mutta se ei suoraan kerro NSC-pitoisuudesta. Suuret pallot saattavat sisältää ytimissään pääasiassa erilaistuneita tai kuolevia soluja. Optimaalinen pallokoko (halkaisija 100-200 μm) tasapainottaa kasvun ja terveiden solujen säilyttämisen. Säännöllinen passagointi estää liikakasvun.

Solujen elinkelpoisuuden seurannalla varmistetaan pallojen terveys koko viljelyn ajan. Trypan sinisen poissulkemisella tai elävä/kuollut-värjäyksellä tunnistetaan viljelmät, joissa on liiallinen solukuolema, mikä osoittaa, että olosuhteet eivät ole optimaaliset. Terveet neurosfäärit näyttävät kirkkailta ja niiden rajat ovat tasaiset; epäsäännölliset muodot tai tummat keskukset viittaavat ongelmiin.

Solulinjojen todennus vahvistaa neurosfääritutkimusten yhteydessä käytettyjen hermosolulinjojen identiteetin. Mykoplasmatestaus estää kontaminaation, joka muuttaa NSC:iden käyttäytymistä ja erilaistumiskykyä. Nämä laatutoimenpiteet varmistavat neurosfääritutkimuksen toistettavuuden.

Päätelmät

Neurosfääriviljely tarjoaa tehokkaan alustan neuraalisten kantasolujen biologian tutkimiseen, neurologisten sairauksien mallintamiseen ja solupohjaisten hoitojen kehittämiseen. Standardoidut protokollat pallojen muodostamista, kulkua ja erilaistumista varten mahdollistavat toistettavan tutkimuksen eri laboratorioissa. Neurosfääritekniikoiden yhdistäminen nykyaikaisiin välineisiin, kuten genomin muokkaukseen ja yksittäisten solujen analysointiin, edistää edelleen hermoston kehityksen ja sairauksien ymmärtämistä.