Neural Stem Cell Culture: Protocols for Neurosphere Formation

Neironu cilmes šūnu kultūras: Neirosfēru veidošanās protokoli: neirosfēru veidošanās protokoli

Neironu cilmes šūnām (NSC) piemīt ievērojama pašatjaunošanās un diferenciācijas spēja trijās galvenajās neironu līnijās: neironos, astrocītos un oligodendrocītos. Deviņdesmito gadu sākumā izstrādātais neirosfēru tests joprojām ir pamatmetode NSC izolēšanai, paplašināšanai un raksturošanai no embrionāliem un pieaugušo nervu audiem. Šī trīsdimensiju suspensijas kultūru sistēma bagātina šūnas ar cilmes/progenitoru īpašībām un nodrošina platformu nervu attīstības izpētei, neiroloģisko slimību modelēšanai un uz šūnām balstītu terapiju izstrādāšanai nervu sistēmas traucējumu ārstēšanai.

Galvenie secinājumi

• Nervosfēras veidojas no nervu cilmes/progenitoru šūnām, kas kultivētas barotnē bez seruma ar EGF un FGF-2
• Neurosfēru sērijveida pasāža pierāda cilmes šūnām raksturīgo pašatjaunošanās spēju
• No neirosfērām iegūtās šūnas diferencējas neironos, astrocītos un oligodendrocītos pēc mitogēna atcelšanas
• Sfēru lielums un veidošanās efektivitāte nodrošina NSC īpašību kvantitatīvus rādītājus
• Pielietojums aptver neironu attīstības pētījumus, slimību modelēšanu un reģeneratīvo medicīnu

Neirosfēru veidošanās principi

Veicot neirosfēru testu, tiek izmantota nervu cilmes šūnu spēja izdzīvot un vairoties suspensijas kultūrā bez seruma, ja tām tiek pievienoti specifiski mitogēni. Atšķirībā no diferencētām nervu šūnām, kurām nepieciešama pieķeršanās substrātam un izdzīvošanas faktori serumā, NSC proliferē kā peldoši agregāti, ja tās kultivē ar epidermas augšanas faktoru (EGF) un fibroblastu bāzes augšanas faktoru (FGF-2/bFGF). Šī selektīvā izdzīvošana bagātina šūnas ar cilmes/progenitoru īpašībām.

Neirosfēru veidošanās notiek, klonāli paplašinoties atsevišķām NSC, apvienojumā ar šūnu agregāciju. Eksperimenti ar ierobežotu atšķaidīšanu pierāda, ka neirosfēras var veidoties no atsevišķām šūnām, apstiprinot klonu izcelsmi. Tomēr standarta kultūras apstākļi ļauj arī sfēru un sfēru saplūšanu, tāpēc sfēru veidošanās testi ir rūpīgi jāinterpretē. Klonālo šūnu blīvuma palielināšana (aptuveni 10 šūnu/μL) samazina saplūšanas gadījumu skaitu.

Neironu cilmes šūnas ekspresē raksturīgos marķierus, tostarp nestīnu (starpposma filamentu proteīnu), Sox2 (transkripcijas faktoru, kas uztur cilmes stāvokli) un Musashi (RNS saistošu proteīnu). Šie marķieri palīdz identificēt NSC bagātinātas populācijas heterogēnās neirosfēru kultūrās, kas satur cilmes šūnas, tranzītamplificējošus progenitorus un vairāk iesaistītos prekursorus.

Audu avoti un disociācijas protokoli

Neironu cilmes šūnas var izolēt no embrionāliem, augļa un pieaugušo nervu audiem. Embrionālās neirosfēras iegūst no nervu caurulītes vai smadzeņu attīstošajiem reģioniem, un tās ir augsti proliferatīvas kultūras. Pieaugušo neirosfēras no subventrikulārās zonas (SVZ) vai hipokampa dentāta žirnekļa satur mierīgākas NSC ar potenciāli atšķirīgu diferenciācijas tendenci. Avotu izvēle ir atkarīga no pētniecības mērķiem un sugas apsvērumiem.

Mehāniskā disociācija līdz minimumam samazina šūnu virsmas receptoru, kas svarīgi NSC izdzīvošanai un signalizācijai, enzīmu bojājumus. Audus sasmalcina un triturē caur arvien mazāka urbuma pipetēm, lai iegūtu atsevišķu šūnu suspensijas. Enzimātiskā disociācija, izmantojot tripsīnu vai akutāzi, palielina iznākumu, bet var ietekmēt lodīšu veidošanās kinētiku. DNāzes I pievienošana novērš sablīvēšanos no DNS, ko izdala bojātās šūnas.

Neirobioloģiskiem pētījumiem izveidotās nervu šūnu līnijas nodrošina papildu modeļus. PC-12 šūnas, kas iegūtas no žurku feohromocitomas, pēc apstrādes ar nervu augšanas faktoru diferencējas par simpātiskām neironiem līdzīgām šūnām. Neuro-2a šūnas nodrošina neiroblastomas modeļus izmantošanai neirozinātnēs. U87MG šūnas ir glioblastomas modeļi smadzeņu audzēju pētījumiem.

Neurosphere kultūras barotnes sastāvs

Standarta neirosfēru barotne sastāv no DMEM/F12 (1:1), kas papildināta ar B27 vai N2 piedevām, kas nodrošina insulīnu, transferīnu, selēnu un citus neironu šūnu izdzīvošanu veicinošus faktorus. Būtiski ir apstākļi bez seruma; pat zema seruma koncentrācija veicina diferenciāciju un kavē sfēru veidošanos. Katras barošanas laikā barotni papildina ar jauniem mitogēniem.

EGF (20 ng/ml) kalpo kā galvenais mitogēns neirosfēru kultūrā, aktivizējot EGFR signalizāciju, kas veicina NSC proliferāciju. FGF-2 (20 ng/ml) sinerģiski mijiedarbojas ar EGF un var atbalstīt dažādas progenitoru populācijas. Dažos protokolos ir iekļauts heparīns (2-5 μg/ml), lai stabilizētu FGF-2 un palielinātu tā bioloģisko aktivitāti. Šo mitogēnu atcelšana izraisa diferenciāciju.

DMEM/Ham's F12 barotne ir neirosfēru kultūras pamatsastāvs. B27 un N2 piedevas, kas satur noteiktas barības vielas un izdzīvošanas faktorus, aizstāj serumu. Saldēšanas barotne CM-1 nodrošina neirosfēru vai disasociētu NSC kriokonservēšanu, savukārt bezseruma ba rotnes var izmantot klīniskās kvalitātes protokolos.

Pašatjaunošanas novērtējums

Sērijveida pasāža nodrošina funkcionālu pašatjaunošanās spējas demonstrēšanu. Primārās neirosfēras tiek atdalītas līdz atsevišķām šūnām, pavairotas noteiktā blīvumā un kultivētas līdz sekundāro neirosfēru veidošanai. Nepārtraukta sfēru veidošanās vairākkārt (parasti 3 - 5 vai vairāk pasāžas) apstiprina pašatjaunojošos cilmes šūnu klātbūtni. Sfēru veidošanās samazināšanās norāda uz progenitoru izsmelšanu.

Sfēru veidošanās efektivitāte (SFE) kvantitatīvi nosaka to izkliedēto šūnu īpatsvaru, kas spēj ģenerēt neirosfēras. Primārajos audos SFE parasti ir 0,1-1 %, bet pasargātajām neirosfērām ir augstāka SFE (1-10 %), kas atspoguļo NSC bagātināšanos. SFE nodrošina kvantitatīvu rādītāju, lai salīdzinātu NSC īpašības dažādos apstākļos vai genotipos.

Ierobežojošā atšķaidījuma analīze nosaka NSC biežumu neirosfēru kultūrās. Šūnas tiek izkliedētas ar arvien mazāku blīvumu, un iedobēs tiek novērtēta sfēru veidošanās. Poisona statistika novērtē sfēru veidojošo šūnu biežumu, atšķirot neirosfēru kultūras ar līdzīgām tilpuma īpašībām, bet atšķirīgu NSC saturu.

Diferenciācijas protokoli

Neirosfēru diferenciācijai nepieciešama mitogēnu izņemšana un piestiprināšanas substrāta nodrošināšana. Disociētas neirosfēru šūnas, kas izkliedētas uz poli-D-lizīna vai laminīna pārklājuma virsmām serumu saturošā vai noteiktā barotnē, veido jauktas neironu, astrocītu un oligodendrocītu kultūras. Standarta diferenciācija parasti veicina astrocītu veidošanos, atspoguļojot pieaugušo NSC attīstības programmu.

Neironu diferenciāciju pastiprina specifiski kultūras apstākļi. Retīnskābes iedarbība veicina neironu likteni, tāpat kā neirotrofiskie faktori BDNF un NT-3. Sonic hedgehog ceļa aktivizācija virza ventrālo neironu likteni, savukārt dorsalizējošie signāli (BMP, Wnts) ietekmē dorsālos fenotipus. Rezultātā radušies neironu apakštipi ir atkarīgi no NSC avota reģionālās identitātes un indukcijas protokoliem.

Oligodendrocītu diferenciācijai ir nepieciešams ilgāks kultivēšanas periods (2-4 nedēļas) un specifiskas faktoru kombinācijas. PDGF veicina oligodendrocītu progenitoru proliferāciju, savukārt vairogdziedzera hormons (T3) un mitogēnu atcelšana veicina terminālo diferenciāciju. Oligodendrocītu veidošanās parasti ir mazāk efektīva nekā neironu vai astrocītu veidošanās no standarta neirosfēru kultūrām.

Pielietojums slimību modelēšanā

Nervosfēras no slimību modeļa dzīvniekiem vai no pacientu iegūtām inducētām pluripotentām cilmes šūnām (iPSC) ļauj modelēt neironu slimības. No ģenētisko slimību modeļiem iegūtās neirosfēras uzrāda fenotipus, kas atspoguļo slimības patofizioloģiju. Izmantojot šo pieeju, ir izveidoti neirodeģeneratīvo slimību, smadzeņu audzēju un neiroloģiskās attīstības traucējumu modeļi.

Veicot zāļu skrīningu, izmantojot neirosfēru sistēmas, identificē savienojumus, kas ietekmē NSC proliferāciju, izdzīvošanu vai diferenciāciju. Augstas veiktspējas neirosfēru testi pārbauda savienojumu bibliotēkas, lai noteiktu to ietekmi uz nerviem. Identificētie trāpījumi tiek pakļauti sekundārai validācijai, tostarp diferenciācijas testiem un diferencēto pēcnācēju funkcionālajai raksturošanai.

Smadzeņu audzēju cilmes šūnas veido audzēju sfēras, kas ir analogas normālām neirosfērām, bet ar novirzītām augšanas īpašībām. Glioblastomas cilmes šūnas uzrāda pastiprinātu sfēru veidošanos, izturību pret starojumu un audzēju ierosināšanas spēju. Smadzeņu audzēju cilmes šūnu mērķtiecīga izmantošana ir terapeitiska stratēģija, kas vērsta uz audzēju recidīvu.

Tehniskie apsvērumi un problēmu novēršana

Neirosfēru lielums korelē ar kultūras ilgumu un šūnu blīvumu, bet tieši nenorāda NSC saturu. Lielās sfērās var būt galvenokārt diferencētas vai mirstošas šūnas. Optimālais sfēru izmērs (100-200 μm diametrs) līdzsvaro augšanu un veselu šūnu saglabāšanu. Regulāra pasāža novērš pārmērīgu augšanu.

Šūnu dzīvotspējas uzraudzība nodrošina lodīšu veselību visā kultivēšanas laikā. Trypana zilā izslēgšana vai dzīvu/nedzīvu šūnu iekrāsošana identificē kultūras ar pārmērīgu šūnu bojāeju, kas norāda uz suboptimāliem apstākļiem. Veselas neirosfēras ir fāziski gaišas un ar gludām robežām; neregulāras formas vai tumši centri liecina par problēmām.

Šūnu līniju autentiskuma noteikšana apstiprina to neironu šūnu līniju identitāti, kas izmantotas saistībā ar neirosfēru pētījumiem. Mikoplazmas testēšana novērš piesārņojumu, kas maina NSC uzvedību un diferenciācijas spēju. Šie kvalitātes pasākumi nodrošina reproducējamus neirosfēru pētījumus.

Secinājumi

Nervosfēru kultūras nodrošina spēcīgu platformu neironu cilmes šūnu bioloģijas pētījumiem, neiroloģisko slimību modelēšanai un uz šūnām balstītu terapiju izstrādei. Standartizēti sfēru veidošanās, pasāžas un diferenciācijas protokoli ļauj veikt reproducējamus pētījumus dažādās laboratorijās. Neirosfēru metožu integrācija ar moderniem instrumentiem, tostarp genoma rediģēšanu un vienas šūnas analīzi, turpina uzlabot izpratni par nervu attīstību un slimībām.