Neural Stem Cell Culture: Protocols for Neurosphere Formation

Kultura nevralnih matičnih celic: Protokoli za tvorbo nevrosfer

Nevronske matične celice (NSC) imajo izjemno sposobnost samoobnavljanja in diferenciacije v tri glavne nevronske linije: nevrone, astrocite in oligodendrocite. Test nevrosfere, ki je bil razvit v zgodnjih devetdesetih letih prejšnjega stoletja, ostaja temeljna tehnika za izolacijo, širjenje in karakterizacijo NSC iz embrionalnih in odraslih živčnih tkiv. Ta tridimenzionalni sistem suspenzijskih kultur obogati celice z lastnostmi matičnih/progenitornih celic in zagotavlja platformo za preučevanje razvoja živčevja, modeliranje nevroloških bolezni in razvoj celičnih terapij za bolezni živčnega sistema.

Ključne ugotovitve

• Nevrosfere nastanejo iz nevronskih matičnih/progenitornih celic, gojenih v gojišču brez seruma z EGF in FGF-2
• Zaporedni prehodi nevrosfer kažejo sposobnost samoobnavljanja, značilno za matične celice
• Celice, pridobljene iz nevrosfer, se diferencirajo v nevrone, astrocite in oligodendrocite po umiku mitogena
• Velikost krogle in učinkovitost oblikovanja zagotavljata kvantitativno merjenje lastnosti NSC
• Uporaba zajema raziskave nevronskega razvoja, modeliranje bolezni in regenerativno medicino

Načela oblikovanja nevrosfer

Test nevrosfere izkorišča sposobnost živčnih matičnih celic, da preživijo in se razmnožujejo v suspenzijski kulturi brez seruma, če so jim dani posebni mitogeni. Za razliko od diferenciranih nevronskih celic, ki potrebujejo pritrditev na substrat in dejavnike preživetja v serumu, se NSC razmnožujejo kot plavajoči agregati, če jih gojimo z epidermalnim rastnim faktorjem (EGF) in osnovnim fibroblastnim rastnim faktorjem (FGF-2/bFGF). To selektivno preživetje obogati celice z lastnostmi matičnih/progenitornih celic.

Nevrosfere nastajajo s klonsko širitvijo posameznih NSC v kombinaciji z združevanjem celic. Poskusi z omejenim redčenjem dokazujejo, da lahko nevrosfere nastanejo iz posameznih celic, kar potrjuje klonski izvor. Vendar pa standardni pogoji gojenja omogočajo tudi zlitje krogle s kroglo, kar zahteva skrbno razlago testov tvorbe krogel. Klonska gostota (približno 10 celic/μL) zmanjšuje število primerov zlitja.

Nevronske matične celice izražajo značilne označevalce, vključno z nestinom (beljakovina vmesnih filamentov), Sox2 (transkripcijski faktor, ki ohranja matičnost) in Musashi (beljakovina, ki veže RNA). Ti označevalci pomagajo prepoznati populacije, obogatene z NSC, v heterogenih kulturah nevrosfer, ki vsebujejo matične celice, prehodne progenitorje in bolj angažirane predhodnike.

Viri tkiv in protokoli disociacije

Nevronske matične celice lahko izoliramo iz embrionalnih, fetalnih in odraslih nevronskih tkiv. Embrionalne nevrosfere izvirajo iz nevralne cevi ali razvijajočih se možganskih predelov in dajejo zelo proliferativne kulture. Odrasle nevrosfere iz subventrikularne cone (SVZ) ali hipokampalnega dentatnega girusa vsebujejo bolj mirujoče NSC s potencialno različnimi diferenciacijskimi nagnjenji. Izbira vira je odvisna od raziskovalnih ciljev in vrste.

Mehanska disociacija zmanjša encimske poškodbe receptorjev na površini celic, ki so pomembni za preživetje in signalizacijo NSC. Tkivo se zmelje in triturira s postopoma manjšimi pipetami, da se ustvarijo enocelične suspenzije. Encimska disociacija z uporabo tripsina ali akutase poveča izkoristek, vendar lahko vpliva na kinetiko nastajanja kroglic. Dodajanje DNaze I preprečuje zlepljanje zaradi DNK, ki se sprosti iz poškodovanih celic.

Za nevrobiološke raziskave so uveljavljene linije nevronskih celic dopolnilni modeli. Celice PC-12, pridobljene iz podganjega feokromocitoma, se po obdelavi z živčnim rastnim faktorjem diferencirajo v simpatičnim nevronom podobne celice. Celice Neuro-2a zagotavljajo modele nevroblastoma za uporabo v nevroznanosti. Celice U87MG predstavljajo modele glioblastoma za raziskave možganskih tumorjev.

Formulacija gojišča za gojenje nevrosfer

Standardno gojišče za nevrosfere je sestavljeno iz DMEM/F12 (1:1), dopolnjenega z dodatki B27 ali N2, ki zagotavljajo inzulin, transferin, selen in druge dejavnike, ki podpirajo preživetje nevronskih celic. Pogoji brez seruma so nujni; že nizke koncentracije seruma spodbujajo diferenciacijo in zavirajo nastajanje sfer. Medij se ob vsakem hranjenju sveže dopolni z mitogeni.

EGF (20 ng/ml) je glavni mitogen za gojenje nevrosfer, saj aktivira signalizacijo EGFR, ki spodbuja proliferacijo NSC. FGF-2 (20 ng/ml) deluje sinergično z EGF in lahko podpira različne populacije progenitorjev. Nekateri protokoli vključujejo heparin (2-5 μg/ml), ki stabilizira FGF-2 in poveča njegovo biološko aktivnost. Odstranitev teh mitogenov sproži diferenciacijo.

Medij DMEM/Ham's F12 je osnovna formulacija za gojenje nevrosfer. Dodatka B27 in N2, ki vsebujeta določena hranila in dejavnike preživetja, nadomestita serum. Sredstvo za zamrzovanje CM-1 omogoča kriokonzervacijo nevrosfer ali disociiranih NSC, medtem ko možnosti brez seruma podpirajo protokole klinične kakovosti.

Ocena samoplačniškega podaljšanja

S serijskim podajanjem je mogoče funkcionalno dokazati sposobnost samoobnove. Primarne nevrosfere se ločijo na posamezne celice, razmnožijo z določeno gostoto in gojijo do nastanka sekundarnih nevrosfer. Nadaljnja tvorba sfer v več prehodih (običajno 3-5 ali več) potrjuje prisotnost samoobnavljajočih se matičnih celic. Upadanje tvorbe kroglic kaže na izčrpanost progenitorjev.

Učinkovitost oblikovanja sfer (SFE) določa delež celic, ki so bile nanesene na podlago in so sposobne ustvariti nevrosfere. Primarno tkivo običajno daje SFE 0,1-1 %, medtem ko pasažirane nevrosfere kažejo višjo SFE (1-10 %), kar odraža obogatitev NSC. SFE zagotavlja kvantitativno merilo za primerjavo lastnosti NSC v različnih pogojih ali genotipih.

Z analizo mejne razredčitve se določi pogostost NSC v kulturah nevrosfer. Celice se razmnožujejo s postopno nižjimi gostotami, vdolbinice pa se ocenjujejo glede tvorbe krogel. Poissonova statistika ocenjuje pogostost celic, ki tvorijo krogle, in razlikuje med kulturami nevrosfer s podobnimi lastnostmi, vendar različno vsebnostjo NSC.

Diferenciacijski protokoli

Diferenciacija nevrosfer zahteva umik mitogena in zagotovitev podlage za pritrditev. Disociirane celice nevrosfere, ki so nanesene na površine, prevlečene s poli-D-lizinom ali lamininom, v gojišču, ki vsebuje serum, ali v definiranem gojišču, tvorijo mešane kulture nevronov, astrocitov in oligodendrocitov. Privzeta diferenciacija običajno daje prednost proizvodnji astrocitov, kar odraža razvojni program odraslih NSC.

Diferenciacijo nevronov pospešujejo posebni pogoji gojenja. Obravnava z retinojsko kislino spodbuja usodo nevronov, prav tako pa tudi nevrotrofična dejavnika BDNF in NT-3. Aktivacija poti soničnega ježka usmerja ventralno nevronsko usodo, medtem ko hrbtni signali (BMP, Wnts) vplivajo na dorzalne fenotipe. Nastali nevronski podtipi so odvisni od regionalne identitete izvornih NSC in indukcijskih protokolov.

Diferenciacija oligodendrocitov zahteva daljša obdobja gojenja (2-4 tedne) in posebne kombinacije dejavnikov. PDGF spodbuja proliferacijo oligodendrocitnih progenitorjev, medtem ko ščitnični hormon (T3) in odvzem mitogenov spodbujata končno diferenciacijo. Proizvodnja oligodendrocitov je običajno manj učinkovita kot proizvodnja nevronov ali astrocitov iz standardnih kultur nevrosfer.

Uporaba pri modeliranju bolezni

Nevrosfere iz živali, ki so model bolezni, ali induciranih pluripotentnih matičnih celic (iPSC), pridobljenih od bolnikov, omogočajo modeliranje nevronskih bolezni. Nevrosfere iz genetskih modelov bolezni kažejo fenotipe, ki odražajo patofiziologijo bolezni. S tem pristopom so bili ustvarjeni modeli za nevrodegenerativne bolezni, možganske tumorje in nevrorazvojne motnje.

S presejanjem zdravil z uporabo sistemov nevrosfer se ugotavljajo spojine, ki vplivajo na proliferacijo, preživetje ali diferenciacijo NSC. Visoko zmogljivi testi nevrosfer preverjajo knjižnice spojin glede učinkov na živčevje. Identificirani zadetki se sekundarno potrdijo, vključno s testi diferenciacije in funkcionalno karakterizacijo diferenciranih potomcev.

Izvorne celice možganskih tumorjev tvorijo tumorske krogle, ki so podobne normalnim nevrosferam, vendar imajo nenormalne lastnosti rasti. Glioblastomske matične celice izkazujejo povečano tvorbo krogel, odpornost na sevanje in sposobnost sprožanja tumorjev. Usmerjanje na matične celice možganskih tumorjev je terapevtska strategija za preprečevanje ponovitve tumorja.

Tehnični vidiki in odpravljanje težav

Velikost nevrosfere je povezana s trajanjem gojenja in gostoto celic, vendar ne kaže neposredno na vsebnost NSC. Velike krogle lahko vsebujejo predvsem diferencirane ali umirajoče celice v svojih jedrih. Optimalna velikost sfere (premer 100-200 μm) uravnoteži rast z ohranjanjem zdravih celic. Redno izločanje preprečuje prekomerno rast.

Spremljanje vitalnosti celic zagotavlja zdravje kroglic med celotnim gojenjem. Izključitev s tripanovim modrim ali barvanje z živimi/umrlimi celicami identificira kulture s prekomerno celično smrtjo, ki kaže na neoptimalne pogoje. Zdrave nevrosfere so fazno svetle in imajo gladke meje; nepravilne oblike ali temna središča kažejo na težave.

Preverjanje pristnosti celičnih linij potrjuje identiteto nevronskih celičnih linij, ki se uporabljajo v povezavi s študijami nevrosfer. Testiranje mikoplazme preprečuje kontaminacijo, ki spreminja obnašanje NSC in sposobnost diferenciacije. Ti ukrepi kakovosti zagotavljajo ponovljive raziskave nevrosfer.

Zaključek

Kultura nevrosfere zagotavlja zmogljivo platformo za preučevanje biologije nevronskih matičnih celic, modeliranje nevroloških bolezni in razvoj celičnih terapij. Standardizirani protokoli za oblikovanje, prehod in diferenciacijo sfer omogočajo ponovljive raziskave v različnih laboratorijih. Integracija tehnik nevrosfer s sodobnimi orodji, vključno z urejanjem genoma in enocelično analizo, še naprej omogoča boljše razumevanje razvoja živčevja in bolezni.