Neural Stem Cell Culture: Protocols for Neurosphere Formation

การเพาะเลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิดประสาท: ระเบียบวิธีสำหรับการสร้างนิวโรสเฟียร์

เซลล์ต้นกำเนิดประสาท (NSCs) มีศักยภาพที่น่าทึ่งในการสร้างตัวเองใหม่และเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์ประสาทชนิดหลักสามประเภท ได้แก่ เซลล์ประสาท (neurons), เซลล์อะสโตรไซต์ (astrocytes), และเซลล์โอลิโกเดนโดรไซต์ (oligodendrocytes)การทดสอบนิวโรสเฟียร์ ซึ่งพัฒนาขึ้นในช่วงต้นทศวรรษ 1990 ยังคงเป็นเทคนิคพื้นฐานสำหรับการแยก ขยาย และจำแนกลักษณะของเซลล์ต้นกำเนิดประสาท (NSCs) จากเนื้อเยื่อประสาทของตัวอ่อนและในผู้ใหญ่ ระบบการเพาะเลี้ยงแบบแขวนลอยสามมิตินี้ช่วยเพิ่มจำนวนเซลล์ที่มีคุณสมบัติเป็นเซลล์ต้นกำเนิดหรือเซลล์ต้นกำเนิดระยะแรกเริ่ม และให้แพลตฟอร์มสำหรับการศึกษาการพัฒนาของระบบประสาท การสร้างแบบจำลองโรคทางระบบประสาท และการพัฒนาวิธีการรักษาที่ใช้เซลล์สำหรับความผิดปกติของระบบประสาท

ประเด็นสำคัญ

• นิวโรสเฟียร์เกิดขึ้นจากเซลล์ต้นกำเนิด/เซลล์ต้นกำเนิดประสาทที่เพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อปราศจากเซรั่มที่มี EGF และ FGF-2
• การเพาะเลี้ยงเซลล์ประสาทแบบต่อเนื่องแสดงให้เห็นถึงศักยภาพในการสร้างตัวเองใหม่ซึ่งเป็นลักษณะเฉพาะของเซลล์ต้นกำเนิด
• เซลล์ที่แยกได้จากนิวโรสเฟียร์จะเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์ประสาท, อะสโตรไซต์, และโอลิโกเดนโดรไซต์เมื่อมีการถอนตัวสารกระตุ้นการแบ่งเซลล์
• ขนาดของทรงกลมและประสิทธิภาพการก่อตัวให้ค่าเมตริกเชิงปริมาณของคุณสมบัติของ NSC
• การประยุกต์ใช้ครอบคลุมการวิจัยการพัฒนาของระบบประสาท, การจำลองโรค, และการแพทย์ฟื้นฟู

หลักการของการก่อตัวของนิวโรสเฟียร์

การทดสอบนิวโรสเฟียร์ใช้ประโยชน์จากความสามารถของเซลล์ต้นกำเนิดประสาทในการอยู่รอดและเพิ่มจำนวนในวัฒนธรรมแขวนลอยที่ปราศจากซีรัมเมื่อได้รับสารกระตุ้นการแบ่งเซลล์เฉพาะ แตกต่างจากเซลล์ประสาทที่แตกต่างซึ่งต้องการการยึดเกาะกับสารตั้งต้นและปัจจัยการอยู่รอดในซีรัม เซลล์ต้นกำเนิดประสาท (NSCs) จะเพิ่มจำนวนเป็นกลุ่มลอยเมื่อเพาะเลี้ยงด้วยปัจจัยการเจริญเติบโตของผิวหนัง (EGF) และปัจจัยการเจริญเติบโตของไฟโบรบลาสต์พื้นฐาน (FGF-2/bFGF) การอยู่รอดที่เลือกสรรนี้ช่วยเพิ่มความเข้มข้นของเซลล์ที่มีคุณสมบัติเป็นเซลล์ต้นกำเนิด/เซลล์ต้นกำเนิด

การสร้างนิวโรสเฟียร์เกิดขึ้นผ่านการขยายตัวของเซลล์ต้นกำเนิดประสาท (NSCs) แต่ละเซลล์แบบโคลนิกควบคู่กับการรวมตัวของเซลล์ การทดลองด้วยการเจือจางแบบจำกัดแสดงให้เห็นว่านิวโรสเฟียร์สามารถเกิดขึ้นได้จากเซลล์เดี่ยวเพียงเซลล์เดียว ยืนยันถึงต้นกำเนิดแบบโคลนิก อย่างไรก็ตาม สภาวะการเพาะเลี้ยงมาตรฐานยังอนุญาตให้เกิดการหลอมรวมระหว่างสเฟียร์กับสเฟียร์ได้ จึงจำเป็นต้องตีความผลการทดสอบการสร้างสเฟียร์อย่างระมัดระวัง การเพาะเลี้ยงแบบควบคุมความหนาแน่นของโคลน (ประมาณ 10 เซลล์ต่อไมโครลิตร) สามารถลดเหตุการณ์การหลอมรวมดังกล่าวได้

เซลล์ต้นกำเนิดประสาทแสดงตัวบ่งชี้เฉพาะรวมถึง nestin (โปรตีนเส้นใยกลาง), Sox2 (ปัจจัยการถอดรหัสที่รักษาสภาวะต้นกำเนิด), และ Musashi (โปรตีนจับ RNA) ตัวบ่งชี้เหล่านี้ช่วยในการระบุประชากรที่อุดมไปด้วย NSC ภายในวัฒนธรรมเซลล์ประสาทที่ไม่เป็นเนื้อเดียวกันซึ่งประกอบด้วยเซลล์ต้นกำเนิด, เซลล์ต้นกำเนิดที่เพิ่มจำนวนชั่วคราว, และเซลล์ต้นกำเนิดที่พัฒนาไปมากขึ้น

แหล่งที่มาของเนื้อเยื่อและวิธีการแยกเนื้อเยื่อ

เซลล์ต้นกำเนิดประสาทสามารถแยกได้จากเนื้อเยื่อประสาทของตัวอ่อน ตัวอ่อนในครรภ์ และผู้ใหญ่ เซลล์ประสาททรงกลมจากตัวอ่อนมีต้นกำเนิดจากท่อประสาทหรือบริเวณสมองที่กำลังพัฒนา ทำให้เกิดวัฒนธรรมที่มีการแบ่งตัวสูง เซลล์ประสาททรงกลมจากผู้ใหญ่จากบริเวณใต้ช่องว่างของสมอง (SVZ) หรือบริเวณเดนเทตไจรัสของฮิปโปแคมปัสมีเซลล์ต้นกำเนิดประสาท (NSCs) ที่อยู่ในภาวะสงบมากกว่าซึ่งอาจมีแนวโน้มในการเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์ชนิดอื่นที่แตกต่างกัน การเลือกแหล่งที่มาขึ้นอยู่กับเป้าหมายการวิจัยและการพิจารณาเกี่ยวกับสายพันธุ์

การแยกทางกลช่วยลดความเสียหายของเอนไซม์ต่อตัวรับบนพื้นผิวเซลล์ที่สำคัญต่อการอยู่รอดและการส่งสัญญาณของเซลล์ประสาทต้นกำเนิด (NSC) เนื้อเยื่อจะถูกสับและบดผ่านหลอดปิเปตที่มีขนาดเล็กลงเรื่อยๆ เพื่อสร้างสารแขวนลอยเซลล์เดี่ยว การแยกด้วยเอนไซม์โดยใช้ทริปซินหรือAccutaseเพิ่มปริมาณเซลล์ที่ได้แต่อาจส่งผลต่ออัตราการก่อตัวของสเฟียร์ การเติม DNase I ช่วยป้องกันการจับตัวเป็นก้อนจาก DNA ที่ถูกปล่อยออกมาจากเซลล์ที่เสียหาย

สำหรับการวิจัยทางประสาทชีววิทยา สายเซลล์ประสาทที่พัฒนาขึ้นแล้วให้แบบจำลองที่เสริมกันเซลล์ PC-12ที่ได้มาจากเนื้องอกเฟโอโครโมไซโตมาของหนูสามารถเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์คล้ายเซลล์ประสาทซิมพาเทติกได้เมื่อได้รับการรักษาด้วยปัจจัยการเจริญเติบโตของเส้นประสาทเซลล์ Neuro-2aให้แบบจำลองเนื้องอกประสาทสำหรับงานประยุกต์ทางประสาทวิทยาเซลล์ U87MGเป็นแบบจำลองเนื้องอกกลีโอโบลาสโตมาสำหรับการวิจัยเนื้องอกสมอง

สูตรอาหารเพาะเลี้ยงเซลล์นิวโรสเฟียร์

มาตรฐานของอาหารเลี้ยงเซลล์นีโอสเฟียร์ประกอบด้วย DMEM/F12 (1:1) ที่เสริมด้วย B27 หรือ N2 supplements ซึ่งให้อินซูลิน, ทรานส์เฟอร์ริน, ซีลีเนียม, และปัจจัยอื่น ๆ ที่ช่วยในการรอดชีวิตของเซลล์ประสาท สภาพที่ไม่มีซีรัมเป็นสิ่งจำเป็นอย่างยิ่ง; แม้แต่ความเข้มข้นของซีรัมต่ำก็ส่งเสริมการแยกตัวและยับยั้งการก่อตัวของนีโอสเฟียร์ อาหารเลี้ยงเซลล์จะถูกเสริมด้วย mitogens ใหม่ทุกครั้งที่มีการให้อาหาร

EGF (20 ng/mL) ทำหน้าที่เป็นสารกระตุ้นการแบ่งตัวของเซลล์หลักสำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ประสาททรงกลม โดยกระตุ้นการส่งสัญญาณ EGFR ที่ส่งเสริมการเพิ่มจำนวนของเซลล์ต้นกำเนิดประสาท (NSC) FGF-2 (20 ng/mL) ร่วมทำงานกับ EGF และอาจสนับสนุนประชากรเซลล์ต้นกำเนิดที่แตกต่างกัน บางโปรโตคอลรวมถึงเฮพาริน (2-5 μg/mL) เพื่อรักษาเสถียรภาพของ FGF-2 และเพิ่มประสิทธิภาพทางชีวภาพ การกำจัดสารกระตุ้นการแบ่งตัวเหล่านี้จะกระตุ้นการเปลี่ยนสภาพ

DMEM/Ham's F12 Mediumเป็นสูตรพื้นฐานสำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ประสาทแบบ neurosphere B27 และ N2 supplements ที่มีสารอาหารที่กำหนดและปัจจัยการอยู่รอดทดแทนซีรัมFreeze Medium CM-1ช่วยให้สามารถแช่แข็งเซลล์ประสาทหรือเซลล์ประสาทต้นกำเนิด (NSCs) ที่แยกตัวได้ ในขณะที่ตัวเลือกที่ปราศจากซีรัมรองรับโปรโตคอลระดับคลินิก

การประเมินการฟื้นฟูตนเอง

การเพาะเลี้ยงต่อเนื่องหลายรุ่น (Serial passaging) เป็นการสาธิตความสามารถในการสร้างตัวเองใหม่ (self-renewal) ในเชิงหน้าที่ เซลล์นิวโรสเฟียร์ปฐมภูมิจะถูกแยกเป็นเซลล์เดี่ยว ปลูกถ่ายลงจานเพาะเลี้ยงใหม่ที่ความหนาแน่นที่กำหนด และเพาะเลี้ยงจนเกิดนิวโรสเฟียร์ทุติยภูมิ การเกิดนิวโรสเฟียร์อย่างต่อเนื่องผ่านการเพาะเลี้ยงหลายรุ่น (โดยทั่วไป 3-5 รุ่นหรือมากกว่า) ยืนยันการมีอยู่ของเซลล์ต้นกำเนิดที่สามารถสร้างตัวเองใหม่ได้ การลดลงของการเกิดนิวโรสเฟียร์บ่งชี้ถึงการหมดไปของเซลล์ต้นกำเนิด (progenitor exhaustion)

ประสิทธิภาพการสร้างทรงกลม (SFE) วัดสัดส่วนของเซลล์ที่เคลือบซึ่งสามารถสร้างนิวโรสเฟียร์ได้ เนื้อเยื่อปฐมภูมิโดยทั่วไปจะให้ SFE อยู่ที่ 0.1-1% ในขณะที่นิวโรสเฟียร์ที่ผ่านการเพาะเลี้ยงหลายรุ่นจะแสดง SFE ที่สูงกว่า (1-10%) ซึ่งสะท้อนถึงการเพิ่มความเข้มข้นของเซลล์ต้นกำเนิดประสาท (NSC) SFE เป็นตัวชี้วัดเชิงปริมาณสำหรับการเปรียบเทียบคุณสมบัติของ NSC ในสภาวะหรือสายพันธุ์ที่แตกต่างกัน

การวิเคราะห์การเจือจางแบบจำกัด (Limiting Dilution Analysis) ใช้เพื่อกำหนดความถี่ของ NSC ภายในวัฒนธรรมเซลล์ประสาทในสเฟียร์ (neurosphere cultures) โดยเพาะเลี้ยงเซลล์ที่ความหนาแน่นลดลงทีละน้อย และทำการประเมินหลุมเพาะเลี้ยงเพื่อหาการก่อตัวของสเฟียร์ สถิติแบบพัวซอง (Poisson statistics) จะใช้ประมาณความถี่ของเซลล์ที่เริ่มต้นการก่อตัวของสเฟียร์ โดยแยกความแตกต่างระหว่างวัฒนธรรมเซลล์ประสาทในสเฟียร์ที่มีคุณสมบัติโดยรวมคล้ายคลึงกันแต่มีปริมาณ NSC แตกต่างกัน

โปรโตคอลการแยกแยะ

การแยกแยะของนิวโรสเฟียร์ต้องการการถอนตัวสารกระตุ้นการแบ่งเซลล์และการจัดหาพื้นผิวสำหรับการยึดเกาะ เซลล์นิวโรสเฟียร์ที่แยกออกจากกันและเพาะบนพื้นผิวที่เคลือบด้วยโพลี-ดี-ไลซีนหรือลามินินในอาหารเลี้ยงเซลล์ที่มีซีรัมหรืออาหารเลี้ยงเซลล์ที่กำหนดไว้ จะสร้างวัฒนธรรมผสมของเซลล์ประสาท, อะสโตรไซต์, และโอลิโกเดนโดไซต์ การแยกแยะตามค่าเริ่มต้นมักจะสนับสนุนการผลิตอะสโตรไซต์ ซึ่งสะท้อนถึงโปรแกรมการพัฒนาของเซลล์ต้นกำเนิดประสาทในผู้ใหญ่

การแยกแยะเซลล์ประสาทจะเพิ่มขึ้นภายใต้สภาวะการเพาะเลี้ยงเฉพาะ การรักษาด้วยกรดเรติโนอิกส่งเสริมการกำหนดชะตาของเซลล์ประสาท เช่นเดียวกับปัจจัยการเจริญเติบโตของเซลล์ประสาท BDNF และ NT-3 การกระตุ้นเส้นทางโซนิคเฮดจ์ฮอกจะกำหนดชะตาของเซลล์ประสาทด้านท้อง ในขณะที่สัญญาณที่ทำให้เกิดลักษณะด้านหลัง (BMPs, Wnts) มีอิทธิพลต่อลักษณะด้านหลัง เซลล์ประสาทที่ได้จะขึ้นอยู่กับเอกลักษณ์ของภูมิภาคของเซลล์ต้นกำเนิดประสาท (NSCs) และโปรโตคอลการเหนี่ยวนำ

การแยกเซลล์โอลิโกเดนโดรไซต์ต้องการระยะเวลาการเพาะเลี้ยงที่ยาวนาน (2-4 สัปดาห์) และการรวมตัวของปัจจัยเฉพาะ PDGF ช่วยส่งเสริมการเพิ่มจำนวนของโอลิโกเดนโดรไซต์โปรโตไซต์ ในขณะที่ฮอร์โมนไทรอยด์ (T3) และการถอนตัวของผู้กระตุ้นการแบ่งเซลล์ช่วยส่งเสริมการแยกเซลล์ขั้นสุดท้าย การสร้างโอลิโกเดนโดรไซต์มักมีประสิทธิภาพน้อยกว่าการสร้างเซลล์ประสาทหรือแอสโทรไซต์จากวัฒนธรรมนีโอสเฟียร์มาตรฐาน

การประยุกต์ใช้ในแบบจำลองโรค

นิวโรสเฟียร์จากสัตว์แบบจำลองโรคหรือเซลล์ต้นกำเนิดพลูริโพเทนต์เหนี่ยวนำที่ได้จากผู้ป่วย (iPSCs) ช่วยให้สามารถจำลองโรคทางระบบประสาทได้ นิวโรสเฟียร์จากแบบจำลองโรคทางพันธุกรรมแสดงลักษณะทางฟีโนไทป์ที่สะท้อนพยาธิสรีรวิทยาของโรค วิธีการนี้ได้สร้างแบบจำลองสำหรับโรคทางระบบประสาทเสื่อมถอย เนื้องอกในสมอง และความผิดปกติทางพัฒนาการของระบบประสาท

การคัดกรองยาโดยใช้ระบบนิวโรสเฟียร์สามารถระบุสารประกอบที่มีผลต่อการเพิ่มจำนวน การอยู่รอด หรือการเปลี่ยนสภาพของเซลล์ประสาทต้นกำเนิดชนิดไม่เฉพาะเจาะจง (NSC) ได้ การทดสอบนิวโรสเฟียร์แบบปริมาณสูง (High-throughput) จะคัดกรองคลังสารประกอบเพื่อค้นหาผลกระทบต่อระบบประสาท สารประกอบที่ถูกค้นพบจะผ่านการตรวจสอบยืนยันในขั้นตอนที่สอง ซึ่งรวมถึงการทดสอบการเปลี่ยนสภาพ และการวิเคราะห์คุณสมบัติทางหน้าที่ของเซลล์ลูกหลานที่เปลี่ยนสภาพแล้ว

เซลล์ต้นกำเนิดของเนื้องอกในสมองสร้างกลุ่มก้อนคล้ายกับกลุ่มเซลล์ประสาทปกติ แต่มีคุณสมบัติการเจริญเติบโตที่ผิดปกติ เซลล์ต้นกำเนิดของกลิโอบลาสโตมาแสดงให้เห็นถึงการก่อตัวของกลุ่มก้อนที่เพิ่มขึ้น ความต้านทานต่อรังสี และความสามารถในการเริ่มต้นเนื้องอก การมุ่งเป้าไปที่เซลล์ต้นกำเนิดของเนื้องอกในสมองถือเป็นกลยุทธ์การรักษาที่มุ่งเน้นการป้องกันการกลับมาเป็นซ้ำของเนื้องอก

ข้อพิจารณาทางเทคนิคและการแก้ไขปัญหา

ขนาดของนิวโรสเฟียร์มีความสัมพันธ์กับระยะเวลาการเพาะเลี้ยงและความหนาแน่นของเซลล์ แต่ไม่ได้บ่งชี้ถึงปริมาณเซลล์ต้นกำเนิดประสาท (NSC) โดยตรง นิวโรสเฟียร์ขนาดใหญ่อาจมีเซลล์ที่แตกต่างหรือเซลล์ที่กำลังตายเป็นส่วนใหญ่ในแกนกลาง ขนาดของนิวโรสเฟียร์ที่เหมาะสม (เส้นผ่านศูนย์กลาง 100-200 ไมโครเมตร) จะช่วยสร้างสมดุลระหว่างการเจริญเติบโตกับการคงสภาพเซลล์ที่มีสุขภาพดี การถ่ายเลี้ยงอย่างสม่ำเสมอจะช่วยป้องกันการเจริญเติบโตที่มากเกินไป

การตรวจสอบความมีชีวิตของเซลล์ช่วยให้มั่นใจได้ว่าสุขภาพของสเฟียร์จะคงอยู่ตลอดการเพาะเลี้ยง การทดสอบด้วยสีไตรแพนบลูหรือการย้อมสีแบบมีชีวิต/ตายจะระบุวัฒนธรรมที่มีเซลล์ตายมากเกินไปซึ่งบ่งชี้ถึงสภาวะที่ไม่เหมาะสม สเฟียร์ประสาทที่มีสุขภาพดีจะปรากฏสว่างในเฟสและมีขอบเขตเรียบเนียน รูปร่างที่ไม่สม่ำเสมอหรือมีศูนย์กลางที่มืดบ่งชี้ถึงปัญหา

การตรวจสอบสายเซลล์ยืนยันตัวตนของสายเซลล์ประสาทที่ใช้ในการศึกษา neurosphereการทดสอบเชื้อ Mycoplasmaป้องกันการปนเปื้อนที่เปลี่ยนแปลงพฤติกรรมและความสามารถในการเปลี่ยนแปลงของ NSC มาตรการคุณภาพเหล่านี้รับประกันการวิจัย neurosphere ที่ทำซ้ำได้

สรุป

การเพาะเลี้ยงนิวโรสเฟียร์เป็นแพลตฟอร์มที่ทรงพลังสำหรับการศึกษาชีววิทยาของเซลล์ต้นกำเนิดประสาท การสร้างแบบจำลองโรคทางระบบประสาท และการพัฒนาวิธีการรักษาที่ใช้เซลล์เป็นฐาน โปรโตคอลมาตรฐานสำหรับการสร้างสเฟียร์ การผ่านรุ่น และการเปลี่ยนแปลงลักษณะเฉพาะทางชีวภาพ ช่วยให้สามารถทำวิจัยซ้ำได้ระหว่างห้องปฏิบัติการต่างๆ การบูรณาการเทคนิคนิวโรสเฟียร์กับเครื่องมือสมัยใหม่ รวมถึงการแก้ไขจีโนมและการวิเคราะห์ระดับเซลล์เดี่ยว ยังคงช่วยพัฒนาความเข้าใจเกี่ยวกับการพัฒนาของระบบประสาทและโรคต่างๆ