Neural Stem Cell Culture: Protocols for Neurosphere Formation

Neuraalsete tüvirakkude kultuur: Neurosfääride moodustamise protokollid

Neuronaalsed tüvirakud (NSC) omavad märkimisväärset võimet eneseuuendumiseks ja diferentseerumiseks kolmeks peamiseks neuronaalseks liiniks: neuronid, astrotsüüdid ja oligodendrotsüüdid. Neurosfääride katse, mis töötati välja 1990ndate alguses, on endiselt põhiline meetod NSCde isoleerimiseks, laiendamiseks ja iseloomustamiseks embrüonaalsetest ja täiskasvanud närvikudedest. See kolmemõõtmeline suspensioonikultuurisüsteem rikastab tüve/progenitor-omadustega rakke ja pakub platvormi närvisüsteemi arengu uurimiseks, neuroloogiliste haiguste modelleerimiseks ja närvisüsteemi haiguste rakupõhiste ravimeetodite väljatöötamiseks.

Peamised järeldused

• Neurosfäärid moodustuvad neuraalsetest tüvi-/progenitorrakkudest, mida kasvatatakse seerumivabas keskkonnas koos EGFi ja FGF-2'ga
• Neurosfääride sageerimine näitab tüvirakkudele iseloomulikku iseeneslikku uuenemisvõimet
• Neurosfääridest saadud rakud diferentseeruvad mitogeeni äravõtmisel neuroniteks, astrotsüütideks ja oligodendrotsüütideks
• Sfääride suurus ja moodustumise tõhusus annavad NSC omaduste kvantitatiivseid näitajaid
• Rakendused hõlmavad neuronaalse arengu uuringuid, haiguste modelleerimist ja regeneratiivset meditsiini

Neurosfääride moodustamise põhimõtted

Neurosfääride katse kasutab ära neuraalsete tüvirakkude võimet ellu jääda ja paljuneda seerumivabas suspensioonikultuuris, kui neile antakse spetsiifilisi mitogeene. Erinevalt diferentseeritud närvirakkudest, mis vajavad substraadi kinnitumist ja seerumi ellujäämisfaktoreid, paljunevad NSC-d hõljuvate agregaatidena, kui neid kasvatatakse epidermise kasvufaktori (EGF) ja põhilise fibroblastide kasvufaktori (FGF-2/bFGF) abil. Selline selektiivne ellujäämine rikastab tüve/progenitaoriomadustega rakke.

Neurosfääride moodustumine toimub üksikute NSCde kloonilise ekspansiooni ja rakkude agregatsiooni kaudu. Piiratud lahjenduskatsed näitavad, et neurosfäärid võivad tekkida üksikutest rakkudest, mis kinnitab kloonilist päritolu. Standardkultuuritingimused võimaldavad siiski ka kera-sfääride ühinemist, mis nõuab kera moodustamise katsete hoolikat tõlgendamist. Klonaalse tihedusega platsideerimine (ligikaudu 10 rakku/μL) minimeerib fusioonisündmusi.

Neuraalsed tüvirakud ekspresseerivad iseloomulikke markereid, sealhulgas nestiini (vahepealse filamendi valk), Sox2 (tüvelisust säilitav transkriptsioonifaktor) ja Musashi (RNA-dega seonduv valk). Need markerid aitavad identifitseerida NSC-dega rikastatud populatsioone heterogeensetes neurosfäärikultuurides, mis sisaldavad tüvirakke, läbilaskvaid progenitaare ja pühendunumaid eelkäijaid.

Kudede allikad ja dissotsiatsiooniprotokollid

Neuraalseid tüvirakke saab isoleerida embrüonaalsetest, loote- ja täiskasvanud närvikudedest. Embrüonaalsed neurosfäärid pärinevad neuraaltoru või areneva aju piirkondadest, mis annavad väga proliferatiivseid kultuure. Täiskasvanud neurosfäärid subventrikulaarsest tsoonist (SVZ) või hippokampuse hambuline gyrus sisaldavad rahulikumaid NSC-sid, millel on potentsiaalselt erinevad diferentseerumise tendentsid. Allikate valik sõltub teadusuuringute eesmärkidest ja liikide kaalutlustest.

Mehaaniline dissotsiatsioon minimeerib rakupinna retseptorite ensümaatilist kahjustamist, mis on olulised NSCde ellujäämiseks ja signaalimise jaoks. Kude peenestatakse ja purustatakse läbi järjest väiksema läbimõõduga pipettide, et tekitada üksikute rakkude suspensioone. Ensümaatiline dissotsiatsioon trüpsiini või Accutase abil suurendab saagist, kuid võib mõjutada sfääride moodustumise kineetikat. DNaas I lisamine takistab kahjustatud rakkude poolt vabanenud DNA klumpimist.

Neurobioloogiliste uuringute jaoks pakuvad väljakujunenud närvirakuliinid täiendavaid mudeleid. PC-12 rakud, mis on saadud roti feokromotsütoomist, diferentseeruvad sümpaatilise neuroni sarnasteks rakkudeks, kui neid töödeldakse närvi kasvufaktoriga. Neuro-2a rakud pakuvad neuroblastoomi mudeleid neuroteaduslike rakenduste jaoks. U87MG rakud kujutavad endast glioblastoomi mudeleid ajukasvaja uurimiseks.

Neurosfääri kultuurikeskkonna koostis

Standardneurosfäärikeskkond koosneb DMEM/F12 (1:1), millele on lisatud B27 või N2 lisandeid, mis annavad insuliini, transferriini, seleeni ja muid närvirakkude ellujäämist toetavaid tegureid. Olulised on seerumivabad tingimused; isegi madalad seerumikontsentratsioonid soodustavad diferentseerumist ja pärsivad sfääride moodustumist. Keskkonda täiendatakse igal söötmisel värskelt mitogeenidega.

EGF (20 ng/ml) on neurosfääride kasvatamisel peamine mitogeen, mis aktiveerib EGFR-signaali, mis soodustab NSC-de proliferatsiooni. FGF-2 (20 ng/ml) sünergiseerib EGFiga ja võib toetada erinevaid progenitaatoripopulatsioone. Mõned protokollid sisaldavad hepariini (2-5 μg/ml), et stabiliseerida FGF-2 ja suurendada selle bioaktiivsust. Nende mitogeenide eemaldamine käivitab diferentseerumise.

DMEM/Ham's F12 keskkond on neurosfääride kasvatamise põhirakenduseks. B27 ja N2 lisandid, mis sisaldavad määratletud toitaineid ja ellujäämisfaktoreid, asendavad seerumit. Freeze Medium CM-1 võimaldab neurosfääride või dissotsieerunud NSC-de krüokonserveerimist, samas kui seerumivabad valikud toetavad kliinilise kvaliteediga protokolle.

Iseseisev hindamine

Seeriapassaaž annab funktsionaalse tõestuse iseenesliku uuenemisvõime kohta. Esmased neurosfäärid dissotsieeritakse üksikuteks rakkudeks, paljundatakse kindlaksmääratud tihedusega ja kasvatatakse kuni sekundaarse neurosfääri moodustumiseni. Sfääride jätkuv moodustumine mitme passage'i jooksul (tavaliselt 3-5 või rohkem) kinnitab iseeneslikult uuenevate tüvirakkude olemasolu. Sfääride vähenev moodustumine viitab eellaste ammendumisele.

Sfääride moodustamise tõhusus (SFE) määrab neurosfääride moodustamiseks võimeliste rakkude osakaalu. Esmase koe SFE on tavaliselt 0,1-1%, samas kui passiivsete neurosfääride SFE on suurem (1-10%), mis näitab NSC-de rikastumist. SFE annab kvantitatiivse mõõdiku NSC omaduste võrdlemiseks erinevate tingimuste või genotüüpide vahel.

Piiratud lahjendusanalüüsiga määratakse NSC-de sagedus neurosfääride kultuurides. Rakke kasvatatakse järjest väiksema tihedusega ja puuraukude puhul hinnatakse sfääride moodustumist. Poissoni statistika hindab sfääri moodustavate rakkude sagedust, eristades neurosfäärikultuure, millel on sarnased lahtised omadused, kuid erinev NSC-de sisaldus.

Diferentseerimisprotokollid

Neurosfääride diferentseerimine nõuab mitogeeni äravõtmist ja kinnitussubstraadi pakkumist. Dissotsieerunud neurosfäärirakud, mis on paigutatud polü-D-lüsiiniga või lamiiniga kaetud pindadele seerumit sisaldavas või määratletud söötmes, tekitavad neuronite, astrotsüütide ja oligodendrotsüütide segakultuure. Standardne diferentseerumine eelistab tavaliselt astrotsüütide tootmist, mis peegeldab täiskasvanud NSCde arenguprogrammi.

Neuronite diferentseerumist soodustavad spetsiifilised kultuuritingimused. Retinoiinhappe ravi soodustab neuronite saatust, nagu ka neurotroofsed faktorid BDNF ja NT-3. Sonic hedgehogi raja aktiveerimine suunab ventraalset neuraalset saatust, samas kui dorsaalseid signaale (BMP-d, Wnts) mõjutavad dorsaalseid fenotüüpe. Saadud neuronaalsed alatüübid sõltuvad NSC-ide piirkondlikust identiteedist ja indutseerimisprotokollidest.

Oligodendrotsüütide diferentseerumine nõuab pikemaid kultuuriperioode (2-4 nädalat) ja spetsiifilisi faktorikombinatsioone. PDGF soodustab oligodendrotsüütide progenitoride proliferatsiooni, samas kui kilpnäärmehormoon (T3) ja mitogeenide äravõtmine soodustavad terminaalset diferentseerumist. Oligodendrotsüütide teke on tavaliselt vähem tõhus kui neuronite või astrotsüütide teke standardsetest neurosfäärikultuuridest.

Rakendused haiguste modelleerimisel

Haiguse mudelloomadest või patsiendist saadud indutseeritud pluripotentsetest tüvirakkudest (iPSC) saadud neurosfäärid võimaldavad modelleerida neuronaalseid haigusi. Geneetiliste haiguste mudelitest saadud neurosfääridel on haiguse patofüsioloogiat kajastavad fenotüübid. Selle lähenemisviisi abil on loodud neurodegeneratiivsete haiguste, ajukasvajate ja neuroloogiliste arenguhäirete mudelid.

Neurosfäärisüsteemide abil tehtavate ravimite sõeluuringutega tuvastatakse ühendid, mis mõjutavad NSCde proliferatsiooni, ellujäämist või diferentseerumist. Kõrge läbilaskevõimega neurosfääride testid sõeluvad ühendite raamatukogusid neuronaalse toime suhtes. Identifitseeritud tabamused läbivad teisese valideerimise, sealhulgas diferentseerimisanalüüsid ja diferentseeritud järglaste funktsionaalne iseloomustus.

Ajukasvaja tüvirakud moodustavad normaalsete neurosfääridega analoogseid, kuid kõrvalekalduvate kasvuomadustega kasvusfääre. Glioblastoomi tüvirakud näitavad suurenenud sfääride moodustumist, kiirgusresistentsust ja kasvaja algatamise võimet. Ajukasvaja tüvirakkudele suunatud ravistrateegia kujutab endast ravistrateegiat, mis on suunatud kasvaja taastekkimisele.

Tehnilised kaalutlused ja tõrkeotsing

Neurosfääride suurus korreleerub kultuuri kestuse ja rakutihedusega, kuid ei näita otseselt NSC-de sisaldust. Suured sfäärid võivad sisaldada peamiselt diferentseerunud või surevaid rakke. Optimaalne sfääri suurus (100-200 μm läbimõõt) tasakaalustab kasvu ja tervete rakkude säilitamist. Regulaarne passageerimine hoiab ära liigse kasvu.

Rakkude elujõulisuse jälgimine tagab sfääride tervise kogu kultiveerimise ajal. Trypan sinise välistamine või elus/surnud värvimine tuvastab kultuurid, kus rakkude ülemäärane surm viitab suboptimaalsetele tingimustele. Terved neurosfäärid näevad välja heledad ja siledate piiridega; ebaregulaarne kuju või tumedad keskused viitavad probleemidele.

Rakuliinide autentimine kinnitab neurosfääride uuringutes kasutatavate närvirakuliinide identiteeti. Mükoplasma testimine hoiab ära saastumise, mis muudab NSCde käitumist ja diferentseerumisvõimet. Need kvaliteedimeetmed tagavad neurosfääriuuringute reprodutseeritavuse.

Kokkuvõte

Neurosfäärikultuur pakub võimsat platvormi neuraalsete tüvirakkude bioloogia uurimiseks, neuroloogiliste haiguste modelleerimiseks ja rakupõhiste ravimeetodite väljatöötamiseks. Sfääride moodustamise, passiveerimise ja diferentseerimise standardiseeritud protokollid võimaldavad laboratooriumide vahel korratavaid uuringuid. Neurosfäärimeetodite integreerimine kaasaegsete vahenditega, sealhulgas genoomi redigeerimise ja üksikute rakkude analüüsiga, aitab jätkuvalt edendada arusaamist närvisüsteemi arengust ja haigustest.