Wprowadzenie

Linia komórkowa MC38 — znana również jako MCA-38, MCA 38, MCA38, MC-38, MC-38 B/6, Mouse Colon 38, Colon 38, Colon-38, Colon38, Murine Carcinoma-38 oraz C38 (numer katalogowy w bazie Cellosaurus: CVCL_B288) — jest jednym z najczęściej stosowanych modeli mysich w badaniach nad rakiem jelita grubego oraz w dziedzinie immunoonkologii. Nowotwór macierzysty wywołano za pomocą substancji rakotwórczej 1,2-dimetylohydrazyny (DMH) u myszy rasy C57BL/6; opisali to Corbett i współpracownicy w 1975 roku [1]; linia komórkowa została następnie wyhodowana przez Tana, Holyoke’a i Goldrosena w 1976 roku [2]. Dzięki syngenicznej zgodności z myszami C57BL/6, wysokiemu obciążeniu mutacyjnym oraz wrażliwości na inhibitory punktów kontrolnych układu odpornościowego komórki MC38 stały się nieodzownym narzędziem do badań nad nowotworami jelita grubego, szczepionkami przeciwnowotworowymi, odpowiedzi limfocytów T CD8-dodatnich, makrofagów związanych z nowotworem oraz biologii szlaku receptora programowanej śmierci komórkowej 1 (PD-1). Model ten nadal stanowi podstawę postępów w immunoterapii nowotworów, terapii genowej oraz odkrywaniu neoantygenów.

Najważniejsze wnioski

• MC38 to mysia linia komórkowa gruczolakoraka okrężnicy, syngeniczna ze szczepem myszy C57BL/6, wyhodowana z guza wywołanego DMH.
• Linia komórkowa charakteryzuje się wysokim obciążeniem mutacyjnym i wykazuje ekspresję neoantygenów rozpoznawanych przez limfocyty T CD8-dodatnie — jednak to, które neoantygeny są obecne, zależy od podlinii (patrz poniżej).
• Linia komórkowa MC38 wykazuje wrażliwość na inhibitory punktów kontrolnych układu odpornościowego, co sprawia, że jest ona powszechnie stosowanym modelem w badaniach nad szlakiem PD-1/PD-L1.
• Model ten znalazł szerokie zastosowanie w pracach nad szczepionkami przeciwnowotworowymi, terapii genowej opartej na cytokinach oraz badaniach z zakresu immunologii nowotworów.
• Między podliniami MC38 pochodzącymi z różnych banków istnieją znaczne różnice genomowe i transkryptomiczne. Dobrze znane neoepitopy Rpl18 i Adpgk występują w podlinii z Leiden (MC38-L), ale nie występują w podlinii Kerafast/NCI (MC38-K), która w związku z tym nie jest rozpoznawana przez odpowiednie komórki T. Niezbędne jest staranne dobieranie źródeł i dokumentowanie pochodzenia. [3]
• Dostępnych jest wiele genetycznie zmodyfikowanych linii pochodnych (z wyłączonymi genami, reporterowych, o nadekspresji), co zwiększa wszechstronność eksperymentalną tego modelu.

Czym jest MC38?

MC38 to przeszczepialna linia komórkowa gruczolakoraka jelita grubego pochodzenia myszego, sklasyfikowana w bazie danych Cellosaurus jako linia komórkowa nowotworowa (CVCL_B288). Linia ta pochodzi od samicy myszy C57BL/6 w nieokreślonym wieku, u której stwierdzono gruczolakoraka jelita grubego (gruczolakorak jelita grubego myszy, NCIt C120044). Corbett i współpracownicy wywołali 82 guzy jelita grubego u czterech wsobnych szczepów myszy w ramach systematycznych wysiłków mających na celu stworzenie przeszczepialnych modeli nowotworów jelita grubego do badań chemioterapii; cztery guzy przetrwały pierwszy przeszczep i przeszły do kolejnych pasażów [1]. Tan, Holyoke i Goldrosen opisali następnie metody selektywnej hodowli linii MCA-38 in vitro, zauważając, że elementy fibroblastopodobne można usunąć poprzez działanie trypsyny, uzyskując w ten sposób stabilną populację komórek nabłonkowych [2]. W serwisie Cellosaurus podano, że czas podwojenia dla szczepu MC38 wynosi 24,3 godziny [4], a linia ta jest utrzymywana jako hodowla adhezyjna. Charakterystyka omiczna obejmowała sekwencjonowanie całego eksomu, transkryptomikę za pomocą mikromacierzy i sekwencjonowania RNA (RNA-seq), proteomikę peptydomów MHC klasy I, analizę macierzy SNP oraz sekwencjonowanie genomu mitochondrialnego. (Cellosaurus rejestruje wpis dotyczący peptydomu pod ogólną nazwą „peptydom HLA klasy I”; komórki mysie prezentują peptydy na cząsteczkach H-2, a nie HLA.)

Informacje dotyczące hodowli komórek MC38

Uwaga dotycząca warunków specyficznych dla podlinii: powyższa pożywka odpowiada warunkom hodowli opisanym dla podlinii pochodzącej z Kerafast/NCI (MC38-K). Podlinia z Leiden (MC38-L) jest hodowana w pożywce IMDM z dodatkiem 8% FBS, 2 mM L-glutaminy i 50 µM 2-merkaptoetanolu [3]. Użytkownicy powinni przestrzegać warunków określonych przez dostawcę.

Zalety ogniw MC38

Jedną z głównych zalet Komórki MC38 jest ich syngeniczna zgodność z powszechnie dostępnym szczepem myszy C57BL/6. Zgodność ta pozwala badaczom analizować interakcje między nowotworem a układem odpornościowym u gospodarza o pełnej kompetencji immunologicznej, unikając czynników zakłócających związanych z niedoborem odporności, które ograniczają wartość translacyjną modeli przeszczepów ksenogenicznych. Nienaruszony układ odpornościowy umożliwia rygorystyczną ocenę odpowiedzi limfocytów T CD8-dodatnich, biologii makrofagów związanych z nowotworem, aktywności komórek NK oraz pełnego spektrum adaptacyjnej i wrodzonej odporności przeciwnowotworowej.

Ponieważ guz rodzicielski został wywołany chemicznie za pomocą DMH, linia komórkowa MC38 charakteryzuje się wysokim obciążeniem mutacyjnym nowotworu i wykazuje ekspresję immunogennych neoantygenów, co potwierdzono w drodze sekwencjonowania całego eksomu oraz analizy peptydomów MHC klasy I [5]. Dzięki temu bogatemu w neoantygeny tłu model wykazuje wrażliwość na inhibitory punktów kontrolnych układu odpornościowego, które działają na szlak receptora programowanej śmierci komórkowej 1 [3], co jest jednym z powodów, dla których często wykorzystuje się ją jako analog hipermutowanej podgrupy ludzkich nowotworów jelita grubego, które reagują na tego typu terapie. Reaktywność tej linii komórkowej na immunoterapię sprawiła, że stała się ona jednym ze standardowych narzędzi przedklinicznych służących do oceny nowych kombinacji inhibitorów punktów kontrolnych układu odpornościowego oraz szczepionek przeciwnowotworowych. Należy zauważyć, że obecność konkretnych neoantygenów zależy od zastosowanej podlinii [3].

Rozbudowany ekosystem zmodyfikowanych linii pochodnych MC38 jeszcze bardziej zwiększa użyteczność tego modelu. Linie z wyłączonymi genami, ukierunkowane na regulatory odpornościowe, takie jak PD-L1 (Cd274), B2m i CD47, a także linie reporterowe wyrażające lucyferazę lub białka fluorescencyjne, są skatalogowane w Cellosaurus jako pochodne CVCL_B288 i stanowią gotowe narzędzia do badań mechanistycznych oraz obrazowania in vivo. Czas podwojenia populacji wynosi około 24 godzin [4] sprzyja wydajnej realizacji eksperymentów oraz ułatwia manipulację genetyczną linii komórkowej — za pomocą lentiwirusa [12], retrowirus [10], oraz elektroporacja [3] — zostało wykazane w wielu opublikowanych badaniach.

Ograniczenia komórek MC38

Istotnym ograniczeniem modelu MC38 jest udokumentowana heterogeniczność między podliniami pochodzącymi z różnych źródeł. W badaniu przeprowadzonym w 2023 roku przez Schrörsa i współpracowników przeprowadzono porównawcze sekwencjonowanie eksomu i transkryptomu komórek MC38 pochodzących z Kerafast (źródło: NCI/NIH, MC38-K) oraz z kolekcji Centrum Medycznego Uniwersytetu w Leiden (MC38-L) i wykazało istotne różnice w profilach mutacyjnych, ploidii oraz ekspresji neoantygenów [3]. Szczep MC38-L zawierał około 1,3 razy więcej wariantów pojedynczych nukleotydów oraz niewielkich insercji i delecji niż szczep MC38-K, tylko 35,3% wariantów niesynonimicznych i 5,4% zdarzeń związanych z genami fuzyjnymi było wspólnych, a wnioskowana ploidia wynosiła dwa dla MC38-K w porównaniu z pięcioma dla MC38-L. Co istotne, dobrze scharakteryzowane neoepitopy Rpl18 i Adpgk były nieobecne w szczepie MC38-K, więc komórki T wyhodowane przeciwko nim rozpoznawały i niszczyły komórki MC38-L, ale nie MC38-K. Wyniki uzyskane na jednej podlinii MC38 mogą zatem nie być powtarzalne w przypadku komórek pochodzących z innego źródła.

W szerszym ujęciu analiza profilu za pomocą mikromacierzy SNP ujawniła problem aneuploidii i zanieczyszczenia krzyżowego wśród powszechnie stosowanych linii komórkowych myszy; linia MC38 była jedną z 99 linii uwzględnionych w tym panelu, z których 15 znacznie odbiegało od zgłoszonego podłoża genetycznego [6]. W badaniu nie odnotowano żadnych konkretnych przypadków niepowodzeń w weryfikacji autentyczności szczepu MC38, jednak wykazano, że samo profilowanie STR może nie pozwolić na rozróżnienie podlinii wywodzących się z tej samej linii wsobnej i nie ujawnia zmian kariotypowych. Naukowcy pracujący ze szczepem MC38 powinni stosować rygorystyczne metody weryfikacji autentyczności oraz dokumentować dokładne pochodzenie komórek wykorzystywanych w każdym badaniu.

Terminologia dotycząca immunogenności MC38 wymaga ostrożności. W publikacjach z lat 90. i początku XXI wieku MC38 jest rutynowo opisywany jako nowotwór o „słabej” lub „niewielkiej” immunogenności, ponieważ niezmodyfikowane komórki tego nowotworu wykazują progresywny wzrost u myszy C57BL/6 z prawidłową odpornością [10] [11] [19]. Współczesna literatura z zakresu immunoonkologii podkreśla natomiast wysokie obciążenie mutacyjne tej choroby oraz jej wrażliwość na inhibitory punktów kontrolnych [3]. Oba opisy są trafne w swoim kontekście i czytelnicy nie powinni traktować ich jako sprzecznych.

Jako nowotwór myszy wywołany chemicznie, MC38 nie odzwierciedla sekwencji mutacji sterującej typowej dla ludzkiego raka jelita grubego. W bazie Cellosaurus nie ma żadnego zweryfikowanego wpisu dotyczącego zmienności sekwencji dla tej linii, ale brak adnotacji nie oznacza, że nie występują w niej zmiany kierujące: na przykład Schrörs i współpracownicy wykryli mutację Smad4 w linii MC38-L, której nie stwierdzono w linii MC38-K. [3]. Ponieważ te dwie podlinie różnią się od siebie tak znacznie, należy unikać ogólnikowych stwierdzeń na temat „ogólnego” profilu mutacyjnego MC38, a badacze powinni zweryfikować genotyp swojej własnej linii. Wreszcie, wpis dotyczący Cellosaurus zawiera ostrzeżenie dotyczące opublikowanego genomu mitochondrialnego MCA38: zdeponowana sekwencja (KM820832.1) pochodzi od szczura i została oznaczona jako pochodząca z „izolatu szczurzego 406”, mimo że MC38 ma pochodzenie mysie. [7], co pokazuje, jak ważne jest sprawdzanie opublikowanych danych sekwencyjnych dotyczących tej linii.

Zobacz pełną specyfikację i złóż zamówienie

Zastosowania komórek MC38

Immunoterapia nowotworów i badania nad punktami kontrolnymi układu odpornościowego

Model MC38 stał się fundamentem badań nad inhibitorami punktów kontrolnych układu odpornościowego ze względu na wysokie obciążenie mutacyjne i wrażliwość na blokadę PD-1/PD-L1. Yadav i współpracownicy wykorzystali model MC38 wraz z drugim modelem mysim do opracowania i walidacji procedury łączącej spektrometrię masową z sekwencjonowaniem eksomu w celu przewidywania mutacji nowotworowych o charakterze immunogennym. Spośród ponad 1 300 zidentyfikowanych zmian aminokwasowych przewidywano, że około 13% wiąże się z MHC klasy I, przy czym niewielką część z nich potwierdzono za pomocą spektrometrii masowej; modelowanie strukturalne wykazało, że mutacje wystawione na działanie rozpuszczalnika były mutacjami immunogennymi, a szczepienie myszy potwierdziło, że każdy przewidywany peptyd wywoływał terapeutycznie aktywne odpowiedzi komórek T [5]. To przełomowe badanie ugruntowało pozycję modelu MC38 jako systemu referencyjnego w odkrywaniu neoantygenów i pomogło zdefiniować zasady stosowane obecnie w opracowywaniu spersonalizowanych szczepionek przeciwnowotworowych.

Badania nad regulacją immunologiczną za pośrednictwem glikanów również opierały się na modelu MC38. Cornelissen i współpracownicy wykorzystali CRISPR/Cas9 do wyłączenia genu CMAS, który koduje kluczowy enzym szlaku sialylacji, i całkowicie zniwelowali ekspresję kwasu sialowego na powierzchni komórek [8]. Wbrew oczekiwaniom te całkowicie desializowane komórki MC38 rosły in vivo znacznie szybciej niż komórki kontrolne, wykazywały zmniejszoną częstotliwość występowania komórek T CD8-dodatnich w obrębie guza oraz indukowały apoptozę komórek T CD8-dodatnich w sposób niezależny od antygenu. Niska ekspresja CMAS korelowała również z krótszym czasem przeżycia bez nawrotu w kohorcie pacjentów z rakiem jelita grubego. Praca ta stanowi zatem ostrzeżenie dla strategii terapeutycznych mających na celu pozbawienie guza sialylacji oraz pozycjonuje komórki MC38 jako cenny system do analizy interakcji między glikanami a układem odpornościowym.

Obrazowanie PD-L1 za pomocą nowych znaczników PET stanowi kolejne aktywne zastosowanie. Dwa radiotracery oparte na peptydach liniowych, [^64Cu]/[^68Ga]HKP2201 i jego dimer HKP2202, zostały zweryfikowane w modelach myszach z alloprzeszczepami raka jelita grubego MC38 i czerniaka B16F10, przy czym ekspresję PD-L1 potwierdzono metodą immunofluorescencji i immunohistochemii zarówno w liniach komórkowych, jak i w ich nowotworach [9]. Badania wiązania konkurencyjnego i blokowania potwierdziły specyficzność wobec celu, a obrazowanie PET w połączeniu z analizą biodystrybucji ex vivo wykazało znaczące wychwytywanie przez nowotwór przy szybkim klirensie z krwi i głównych narządów. Alloprzeszczep MC38 stanowił zatem jedną z platform referencyjnych do oceny specyficzności znacznika w translacyjnym rozwoju nieinwazyjnego obrazowania punktów kontrolnych układu odpornościowego.

Terapia genowa cytokinowa i zmodyfikowane pęcherzyki pozakomórkowe

Komórki MC38 są szeroko stosowane jako model o słabej immunogenności do testowania strategii terapii genowej opartej na cytokinach. Hiroishi i współpracownicy wykazali, że transdukcja komórek MC38 genem interferonu alfa (IFN-α) spowodowała odrzucenie zmodyfikowanych komórek u 13 z 15 myszy z prawidłową odpornością, a zmieszanie komórek transdukowanych genem IFN-α i CD80 dało synergiczne efekty przeciwnowotworowe, przy czym odrzucenie wystąpiło u 14 z 15 zwierząt [10]. Eguchi i współpracownicy rozszerzyli te badania, bezpośrednio porównując terapię genową opartą na IFN-α i interleukinie-12 (IL-12) w komórkach MC38, stwierdzając, że IFN-α indukował specyficzne dla nowotworu odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T oraz długotrwałą odporność, podczas gdy IL-12 stymulował przede wszystkim niespecyficzne zabijanie komórek nowotworowych z udziałem zarówno komórek T CD8-dodatnich, jak i komórek NK [11].

Rossowska i współpracownicy wnieśli kluczowy wkład w tę dziedzinę, modyfikując genetycznie komórki MC38 tak, aby uwalniały pęcherzyki pozakomórkowe (EV) zawierające ładunek immunostymulujący [12]. Wykorzystując wektory lentiwirusowe, autorzy wyhodowali podlinie komórek MC38 nadekspresjonujące mysi IL-12, wyrażające shRNA skierowane przeciwko TGF-β1 lub obie te cechy, i wykazali, że modyfikacja genetyczna komórek macierzystych stanowi skuteczny sposób na wprowadzenie interesujących cząsteczek zarówno do egzosomów pochodzących z nowotworu, jak i do mikropęcherzyków. Zmodyfikowane egzosomy hamowały wzrost nowotworu u myszy z podskórnymi guzami MC38, podczas gdy egzosomy z komórek niezmodyfikowanych tego nie robiły. Najtrwalszy efekt wymagano połączenia ze szczepionkami opartymi na komórkach dendrytycznych, które przywróciły odporność przeciwnowotworową i wywołały ogólnoustrojową odpowiedź typu Th1 [12]. W badaniu tym wykazano, że zmodyfikowane egzosomy pochodzące z komórek MC38 pełnią rolę adiuwanta, który może wspierać specyficzną odpowiedź przeciwnowotworową, a nie samodzielnej szczepionki.

W kontekście nowotworu MC38 badano również egzosomy pochodzące z mezenchymalnych komórek zrębu. Xing i współpracownicy wyciszyli gen GARP w mezenchymalnych komórkach zrębu i wykazali, że egzosomy pochodzące z tych komórek (siGARP-MSC) hamowały proliferację, migrację i inwazję komórek MC38 in vitro, zmniejszały wydzielanie IL-6 oraz częściowo dezaktywowały szlak JAK1/STAT3 [13]. Wskazuje to na istnienie osi parakrynnej między komórkami zrębu a komórkami nowotworowymi, którą można by wykorzystać w terapii, choć wyniki te ograniczają się jak dotąd do hodowli komórkowych. Łącznie badania te ilustrują wszechstronność modelu MC38 w ocenie strategii immunoterapeutycznych opartych na komórkach wolnych i pęcherzykach.

Immunologia nowotworów, adhezja i unikanie odpowiedzi immunologicznej

Interakcja między limfocytami T a komórkami nowotworowymi MC38 była przedmiotem szczegółowych badań mechanistycznych. MacKenzie, Hoskin i Blay jako pierwsi opisali, że adhezja limfocytów T aktywowanych przeciwciałem anty-CD3 do komórek MCA-38 odbywała się głównie za pośrednictwem integryny VLA-4 (α4β1), oraz że jest ona stymulowana przez sygnalizację kinazy białkowej tyrozynowej i kinazy białkowej C, a hamowana przez szlaki zależne od cAMP, przy czym mechanizm regulacyjny zlokalizowany jest głównie w komórce efektorowej [14]. Późniejsze badanie tej samej grupy doprecyzowało ten obraz: przeciwciała skierowane przeciwko α4 lub β7, albo przeciwko VCAM-1 na komórkach nowotworowych, hamowały adhezję, podczas gdy przeciwciała anty-β1 tego nie robiły, co pozwoliło zidentyfikować oś α4β7–VCAM-1 jako dominującą. W pracy tej wykazano również, że adenozyna, nukleozyd występujący w zwiększonej ilości w hipoksycznym mikrośrodowisku nowotworowym, hamuje adhezję komórek T poprzez specyficzne blokowanie funkcji α4β7 [15]. Należy zwrócić uwagę, że w obu artykułach tej samej interakcji przypisano różne podjednostki β.

Rolę komórek NK w kontrolowaniu przerzutów do wątroby w przypadku MC38 zbadano zarówno u gospodarzy z prawidłową odpornością, jak i u gospodarzy z niedoborem odporności. Cohen i współpracownicy wstrzyknięli komórki MCA-38 (LD-MCA-38) do żyły jelita krętego i okrężnicy i stwierdzili, że konwencjonalne myszy C57BL/6 zatrzymywały komórki nowotworowe w wątrobie i rozwijały ogniska nowotworowe w tym narządzie, podczas gdy myszy nagie bez grasicy eliminowały około 60% znakowanych komórek w ciągu 24 godzin i nie rozwijały żadnych zmian w wątrobie [16]. Komórki wątroby inne niż miąższowe, pochodzące od myszy nagich lub myszy poddanych działaniu poli(I:C) — ale nie od nieleczonych myszy konwencjonalnych — wykazywały działanie cytotoksyczne wobec LD-MCA-38, a odpowiedzialna za to populacja była nieprzylegająca i wykazywała obecność asialo-GM1 (AsGM1); leczenie przeciwciałami anty-AsGM1 znosiło tę ochronę. Volpe i współpracownicy rozszerzyli te odkrycia, wykazując, że deplecja za pomocą przeciwciał anty-AsGM1 lub anty-NK1.1 znacznie zwiększała liczbę ognisk w wątrobie i skracała czas przeżycia, podczas gdy zmniejszenie liczby komórek T za pomocą przeciwciał anty-Thy1.2 znacząco zmniejszało liczbę ognisk, co wskazuje, że to komórki NK, a nie komórki T, są głównymi efektorami zapobiegającymi przerzutom LD-MCA-38 do wątroby [17]. Johnkoski i współpracownicy wykazali ponadto, że pojedyncze ognisko LD-MCA-38 w wątrobie, wywołane wstrzyknięciem pod torebkę wątrobową, wzmacniało funkcję cytotoksyczną i proliferacyjną komórek nieparenchymalnych wątroby, zwiększało odsetek komórek T CD8-dodatnich i γδ oraz podnosiło poziom interleukiny-6 i czynnika martwicy nowotworów [18].

Szczepionki przeciwnowotworowe i identyfikacja antygenów

Komórki MC38 służą jako niezawodna platforma do opracowywania i porównywania strategii szczepionek opartych na całych komórkach nowotworowych. Hodge i Schlom porównali wektory retrowirusowe i poxwirusowe (wakcynia) pod kątem dostarczania cząsteczki kostymulującej B7-1 do komórek MC38 [19]. Oba wektory indukowały równoważną ekspresję B7-1 na powierzchni komórek oraz zapewniły równą ochronę przed ekspozycją na natywne komórki MC38 14 dni później. Jednak przy ponownym zakażeniu po 40 dniach szczepionka retrowirusowa okazała się mniej skuteczna, a w przypadku ugruntowanych przerzutów do płuc szczepionka oparta na wektorze wirusa krowianki była znacznie lepsza (P = 0,0351; P = 0,024 u myszy uodpornionych na wirusa krowianki; P = 0,0014 w analizie łącznej). W badaniu stwierdzono, że szczepionka oparta na wektorze wirusa ospy zawierająca całe komórki nowotworowe jest co najmniej tak samo skuteczna, a czasami nawet skuteczniejsza niż jej retrowirusowy odpowiednik — odkrycie to miało wpływ na późniejsze zastosowanie kliniczne szczepionek przeciwnowotworowych opartych na wektorze wirusa ospy. Lorenz i współpracownicy wykorzystali komórki MC38 zakażone rekombinowanym wirusem krowianki kodującym mysi LFA-3 (CD48), aby wykazać, że wymuszona ekspresja LFA-3 zwiększała proliferację, adhezję i cytotoksyczność komórek T in vitro oraz całkowicie zapobiegała wzrostowi nowotworu u myszy syngenicznych C57BL/6, zapewniając jednocześnie częściową ochronę przed późniejszym zakażeniem niezainfekowanymi komórkami macierzystymi [20].

Identyfikację antygenów nowotworowych metodą SEREX zastosowano w odniesieniu do linii komórkowej MC38 przez Hamptona i współpracowników, którzy zaszczepili myszy C57BL/6 komórkami MC38, a następnie przebadali bibliotekę ekspresyjną pochodzącą z linii MC38 przy użyciu surowic immunologicznych [21]. Podejście to pozwoliło zidentyfikować endogenne białko otoczki (env) ekotropowego wirusa białaczki oraz mysie białko ATRX jako potencjalne antygeny nowotworowe, poszerzając repertuar znanych mysich antygenów związanych z nowotworami i dostarczając narzędzi do badań nad mechanizmami działania szczepionek. Takeda i współpracownicy wyhodowali komórki fuzyjne z komórek nowotworowych MC38 i komórek dendrytycznych, w tym komórek dendrytycznych izolowanych od gospodarzy z nowotworem, i wykazali, że szczepienie którymkolwiek z tych preparatów indukowało równie wysoką aktywność cytolityczną splenocytów przeciwko MC38 oraz znacząco hamowało rozwinięte przerzuty płucne MC38 [22].

W odrębnym podejściu opartym na terapii genowej wykorzystano odporność na epitop α(1,3)-galaktozylu (αGal). Unfer i współpracownicy poddali myszy z wyłączonym genem α(1,3)-galaktozylotransferazy (αGT) – które, podobnie jak ludzie, nie posiadają tego epitopu i mogą wytwarzać przeciwciała anty-Gal – ekspozycji na komórki raka jelita grubego MC38 wyrażające αGal [23]. Myszy immunizowane erytrocytami króliczymi wytworzyły miana przeciwciał anty-αGal zbliżone do tych obserwowanych w surowicy ludzkiej, głównie IgG1 i IgG3, i wykazały wydłużony czas przeżycia oraz wolniejszy rozwój nowotworu w porównaniu z nieimmunizowanymi myszami z wyłączonym genem oraz myszami typu dzikiego z grupy kontrolnej. Badanie to stanowi potwierdzenie słuszności koncepcji αGT jako genu samobójczego w terapii genowej raka jelita grubego in vivo; lizę komórek transdukowanych αGal, w której pośredniczy komplement, wykazano wcześniej in vitro przy użyciu surowicy ludzkiej.

Nowe strategie terapeutyczne i badania leków

Komórki MC38 wykorzystano do oceny szeregu farmakologicznych i fizycznych metod leczenia raka jelita grubego. Kuriyama i współpracownicy wykazali, że elektropermeabilizacja znacznie zwiększyła wrażliwość mysich komórek raka jelita grubego, w tym linii MC38, na bleomycynę in vitro, choć nie na 5-fluorouracyl ani cisplatynę [24]. W towarzyszących eksperymentach in vivo elektrochemioterapia z użyciem bleomycyny lub cisplatyny doprowadziła do całkowitej regresji podskórnych nowotworów jelita grubego odpowiednio u pięciu i czterech z ośmiu zwierząt, co można przypisać zwiększonemu gromadzeniu się leku w obrębie guza; opublikowany raport nie precyzuje, która z dwóch linii komórkowych została wykorzystana do tych przeszczepów. Manome i współpracownicy wykorzystali komórki MC38, aby wykazać, że ultradźwiękowe wprowadzanie genów pozwala na transfekcję „nagiego” plazmidowego DNA do komórek raka jelita grubego zarówno in vitro, jak i w guzach MC38 rozwijających się u myszy syngenicznych, wykazując tym samym wykonalność mechanicznej sonikacji jako niewirusowej techniki transferu genów [25].

Proleki diklofenaku podstawione karboranem zostały ponownie ocenione z wykorzystaniem modelu MC38. Wśród przeprojektowanej serii amidina o charakterze amfoterycznym zawierająca klaster nido zniweczyła żywotność komórek MC38 już w niskim zakresie mikromolarnym, działając głównie poprzez silne hamowanie podziału komórek i umiarkowaną apoptozę, której towarzyszyło wyczerpanie reaktywnych form tlenu i azotu, podczas gdy sam diklofenak i oksindole podstawione karboranem nie wykazywały cytotoksyczności [26]. Komórki MC38 wykorzystano również w badaniach optogenetycznych: Komórki MC38 i B16F10 wyrażające sterowaną światłem pompę protonową typu „outward” – archaerhodopsynę-3 (AR3) – ulegały apoptycznej śmierci komórkowej po naświetlaniu światłem zielonym, a guzy wyrażające AR3 przeszczepione myszom C57BL/6 wykazywały znaczne zmniejszenie rozmiarów lub zahamowanie wzrostu po naświetlaniu [27]. Park i współpracownicy wykorzystali komórki MC38 jako grupę kontrolną raka jelita grubego w badaniu dotyczącym terapii genowej ukierunkowanej na czerniaka, wykorzystując konstrukcje promotorów/wzmacniaczy specyficzne dla melanocytów, połączone z genem fosforylazy nukleozydów purynowych Escherichia coli; 96% komórek MC38 pozostało żywych po podaniu proleku, co potwierdziło ekspresję ograniczoną do tkanki [28].

Wnioski

Komórki MC38 zajmują centralne miejsce w badaniach nad rakiem jelita grubego i immunoonkologią. Ich syngeniczna zgodność z myszami C57BL/6, wysokie obciążenie mutacyjne, bogaty profil neoantygenów oraz wrażliwość na inhibitory punktów kontrolnych układu odpornościowego sprawiają, że są one jednym z najbardziej informacyjnych modeli przedklinicznych do badania nowotworów jelita grubego, odpowiedzi limfocytów T CD8-dodatnich, makrofagów związanych z nowotworem, szczepionek przeciwnowotworowych oraz biologii szlaku receptora programowanej śmierci komórkowej 1. Dziesięciolecia opublikowanych prac potwierdziły przydatność tego modelu w terapii genowej, biologii adhezji, przerzutach do wątroby oraz ocenie nowych leków, podczas gdy najnowsze badania wykorzystujące pęcherzyki pozakomórkowe, obrazowanie PET i optogenetykę nadal poszerzają jego znaczenie translacyjne. Biorąc pod uwagę udokumentowane różnice między podliniami, w każdym badaniu należy odnotować pochodzenie komórek i zweryfikować ich genotyp. Naukowcy, którzy potrzebują niezawodnego, dobrze scharakteryzowanego myszego modelu raka jelita grubego, mogą zamówić komórki MC38 lub uzyskać informacje na ich temat bezpośrednio na stronie cytion.com.

Kluczowe publikacje

1. Corbett TH, Griswold DP Jr, Roberts BJ i in. (1975) Związki indukcji nowotworów w rozwoju przeszczepialnych nowotworów jelita grubego u myszy do badań chemioterapii, wraz z uwagą na temat struktury czynników rakotwórczych. Cancer Research 35:2434–2439. PMID: 1149045
2. Tan MH, Holyoke ED, Goldrosen MH (1976) Mysie gruczolakoraki jelita grubego: metody selektywnej hodowli in vitro. Journal of the National Cancer Institute 56:871–873. PMID: 1255804 · DOI: 10.1093/jnci/56.4.871
3. Schrörs B, Hos BJ, Yildiz IG i in. (2023) Linie komórkowe nowotworów jelita grubego MC38 pochodzące z dwóch różnych źródeł wykazują istotne różnice w transkryptomie, mutomie i ekspresji neoantygenów. „Frontiers in Immunology” 14:1102282. PMID: 36969213 · DOI: 10.3389/fimmu.2023.1102282
4. Morimoto-Tomita M, Ohashi Y, Matsubara A i in. (2005) Komórki mysiego raka okrężnicy, wyhodowane w celu uzyskania wysokiej częstości występowania eksperymentalnych przerzutów do wątroby, wykazują przyspieszony i niezależny od przylegania wzrost. Clinical & Experimental Metastasis 22:513–521. PMID: 16320114 · DOI: 10.1007/s10585-005-3585-0
5. Yadav M, Jhunjhunwala S, Phung QT i in. (2014) Przewidywanie immunogennych mutacji nowotworowych poprzez połączenie spektrometrii masowej i sekwencjonowania eksomu. Nature 515:572–576. PMID: 25428506 · DOI: 10.1038/nature14001
6. Didion JP, Buus RJ, Naghashfar Z i in. (2014) Profilowanie macierzy SNP linii komórkowych myszy pozwala zidentyfikować ich szczepy pochodzenia oraz ujawnia zanieczyszczenie krzyżowe i powszechną aneuploidię. BMC Genomics 15:847. PMID: 25277546 · DOI: 10.1186/1471-2164-15-847
7. Zhang CF, Yu XJ, Wang BY i in. (2016) Sekwencja całego genomu mitochondrialnego linii komórkowej MCA38 pochodzącej z raka jelita grubego szczura. Mitochondrial DNA Part A 27:2034–2035. PMID: 25434994 · DOI: 10.3109/19401736.2014.974176 — zob. uwagę ostrzegawczą w wpisie Cellosaurus CVCL_B288.
8. Cornelissen LAM, Blanas A, van der Horst JC i in. (2019) Zakłócenie metabolizmu kwasu sialowego stymuluje wzrost guza poprzez nasilenie apoptozy limfocytów T CD8+. International Journal of Cancer 144:2290–2302. PMID: 30578646 · DOI: 10.1002/ijc.32084
9. Zhang L, Zhang S, Wu J i in. (2023) Liniowe znaczniki PET na bazie peptydów do obrazowania PD-L1 w nowotworach. Molecular Pharmaceutics 20:4256–4267. PMID: 37368947 · DOI: 10.1021/acs.molpharmaceut.3c00382
10. Hiroishi K, Tüting T, Tahara H, Lotze MT (1999) Terapia genowa interferonem alfa w połączeniu z transdukcją CD80 zmniejsza nowotworowość i wzrost istniejącego guza w modelach nowotworowych o słabej immunogenności. Gene Therapy 6:1988–1994. PMID: 10637450 · DOI: 10.1038/sj.gt.3301034
11. Eguchi J, Hiroishi K, Ishii S, Mitamura K (2003) Terapia genowa nowotworów z wykorzystaniem interferonu alfa i interleukiny-12: interferon alfa indukuje specyficzne dla nowotworu odpowiedzi immunologiczne, podczas gdy interleukina-12 stymuluje niespecyficzne niszczenie komórek nowotworowych. Cancer Immunology, Immunotherapy 52:378–386. PMID: 12739068 · DOI: 10.1007/s00262-002-0367-2
12. Rossowska J, Anger N, Wegierek K i in. (2019) Potencjał przeciwnowotworowy pęcherzyków pozakomórkowych uwalnianych przez genetycznie zmodyfikowane mysie komórki raka jelita grubego z nadekspresją interleukiny-12 i shRNA dla TGF-β1. Frontiers in Immunology 10:211. PMID: 30814999 · DOI: 10.3389/fimmu.2019.00211
13. Xing H, Liang C, Xu X i in. (2020) Mezenchymalne komórki zrębu/komórki podobne do komórek macierzystych o obniżonej ekspresji GARP hamują proliferację i inwazję mysich komórek raka okrężnicy (MC38) poprzez egzosomy. Journal of Cellular and Molecular Medicine 24:13984–13990. PMID: 33155413 · DOI: 10.1111/jcmm.16008
14. MacKenzie WM, Hoskin DW, Blay J (1999) Adhezja mysich limfocytów T aktywowanych przeciwciałem anty-CD3 do syngenicznych komórek gruczolakoraka okrężnicy jest regulowana w różny sposób przez szlaki zależne od kinazy białkowej tyrozynowej, kinazy białkowej C oraz cAMP w komórce efektorowej. „Biochemical and Biophysical Research Communications” 255:460–465. PMID: 10049731 · DOI: 10.1006/bbrc.1999.0232
15. MacKenzie WM, Hoskin DW, Blay J (2002) Adenozyna hamuje adhezję limfocytów T do komórek gruczolakoraka jelita grubego, w której pośredniczy integryna alfa(4)beta(7). Experimental Cell Research 276:90–100. PMID: 11978011 · DOI: 10.1006/excr.2002.5514
16. Cohen SA, Tzung SP, Doerr RJ, Goldrosen MH (1990) Rola komórek wątroby wykazujących obecność asialo-GM1, pochodzących od myszy bez grasicy (athymic nude) lub myszy poddanych działaniu kwasu poliinozynowo-policytydylowego, w hamowaniu eksperymentalnych przerzutów do wątroby pochodzących z jelita grubego. Cancer Research 50:1834–1840. PMID: 2306736
17. Volpe CM, Mehta N, Kim U i in. (1999) Komórki NK AsGM1+ zapobiegają przerzutom atakujących komórek nowotworowych LD-MCA-38 u myszy nagich. The Journal of Surgical Research 84:157–161. PMID: 10357913 · DOI: 10.1006/jsre.1999.5631
18. Johnkoski JA, Tzung SP, Doerr RJ, Cohen SA (1992) Przerzuty do wątroby zmieniają funkcję immunologiczną komórek nieparenchymalnych wątroby myszy. „Archives of Surgery” 127:1325–1329. PMID: 1444795 · DOI: 10.1001/archsurg.1992.01420110073015
19. Hodge JW, Schlom J (1999) Badania porównawcze wektora retrowirusowego i wirusa ospy w szczepionkach zawierających całe komórki nowotworowe. Cancer Research 59:5106–5111. PMID: 10537283
20. Lorenz MG, Kantor JA, Schlom J, Hodge JW (1999) Indukcja odporności przeciwnowotworowej wywołanej przez komórki nowotworowe wyrażające mysi analog LFA-3 za pośrednictwem rekombinowanego wirusa krowianki. Human Gene Therapy 10:623–631. PMID: 10094205 · DOI: 10.1089/10430349950018698
21. Hampton TA, Conry RM, Khazaeli MB i in. (2000) Analiza SEREX w celu identyfikacji antygenów nowotworowych w mysim modelu gruczolakoraka. Cancer Gene Therapy 7:446–455. PMID: 10766351 · DOI: 10.1038/sj.cgt.7700124
22. Takeda A, Homma S, Okamoto T i in. (2003) Fuzje niedojrzałych komórek dendrytycznych z komórkami nowotworowymi wywołują silną odporność przeciwnowotworową. European Journal of Clinical Investigation 33:897–904. PMID: 14511362 · DOI: 10.1046/j.1365-2362.2003.01194.x
23. Unfer RC, Hellrung D, Link CJ Jr (2003) Odporność na epitop alfa(1,3)-galaktozylowy zapewnia ochronę u myszy poddanych ekspozycji na komórki raka jelita grubego wyrażające alfa(1,3)-galaktozylotransferazę: nowy gen samobójczy do genoterapii nowotworów. Cancer Research 63:987–993. PMID: 12615713
24. Kuriyama S, Matsumoto M, Mitoro A i in. (2000) Elektrochemioterapia raka jelita grubego z wykorzystaniem powszechnie stosowanych środków chemioterapeutycznych w modelu mysim. Digestive Diseases and Sciences 45:1568–1577. PMID: 11007108 · DOI: 10.1023/a:1005565027969
25. Manome Y, Nakamura M, Ohno T, Furuhata H (2000) Ultradźwięki ułatwiają transdukcję „nagiego” plazmidowego DNA do komórek raka jelita grubego in vitro i in vivo. Human Gene Therapy 11:1521–1528. PMID: 10945766 · DOI: 10.1089/10430340050083252
26. Selg C, Gordić V, Krajnović T i in. (2024) Przeprojektowanie i ocena proleków na bazie diklofenaku z podstawnikami karboranowymi oraz ich potencjał przeciwnowotworowy. Scientific Reports 14:30488. PMID: 39681576 · DOI: 10.1038/s41598-024-81414-x
27. Nakao S, Kojima K, Sato K i in. (2025) Optogenetyczna terapia nowotworów z wykorzystaniem sterowanej światłem pompy protonowej typu „outward” – rodopsyny archaerhodopsin-3 (AR3). Journal of the American Chemical Society 147:44131–44140. PMID: 41186408 · DOI: 10.1021/jacs.5c13053
28. Park BJ, Brown CK, Hu Y i in. (1999) Wzmocnienie ekspresji genów specyficznych dla czerniaka przy użyciu tandemowego wzmacniacza specyficznego dla melanocytów skutkuje zwiększoną cytotoksycznością genu fosforylazy nukleozydów purynowych w czerniaku. *Human Gene Therapy* 10:889–898. PMID: 10223723 · DOI: 10.1089/10430349950018292

Dane bibliograficzne i streszczenia pochodzą z serwisu PubMed. Metadane dotyczące linii komórkowej pochodzą z wpisu dotyczącego MC-38 w bazie Cellosaurus (RRID:CVCL_B288).