Sejtkultúra-táptalajok: Áttekintés

Az élettudományok területén az egyik legfontosabb módszer a sejtkultúra. A „sejtkultúra” kifejezés alatt azt értjük, hogy sejteket, szöveteket vagy szerveket veszünk ki egy állatból vagy növényből, majd azokat olyan mesterséges környezetbe ültetjük át, amely kedvező a túlélésükhöz és/vagy növekedésükhöz. Az optimális sejtfejlődés alapvető környezeti feltételei a szabályozott hőmérséklet, a sejtek tapadásához szükséges szubsztrátum, a megfelelő tenyészközeg, valamint az optimális pH-értéket és ozmolalitást fenntartó inkubátor. A sejteknek ezekre a feltételekre van szükségük ahhoz, hogy teljes potenciáljukat kihasználva növekedhessenek.

A megfelelő tenyészközeg kiválasztása az in vitro tenyésztéshez a sejtkultúra legkritikusabb és egyben legfontosabb szakasza. A tenyésztőközeg – más néven tenyésztőtáp – olyan folyadék vagy gél, amelyet úgy állítottak össze, hogy elősegítse a szervezetek fejlődését mikroszkopikus, sejt- vagy növényi szinten. A sejtek tenyésztéséhez használt közeg gyakran megfelelő mennyiségű energiát és olyan anyagokat tartalmaz, amelyek szabályozzák a sejtciklust. A tenyésztőközeg fő összetevői közé tartoznak az aminosavak, a vitaminok, a szervetlen sók, a glükóz és a szérum. A szérumot azért adják a közeghez, mert növekedési faktorok, hormonok és tapadási faktorok forrásaként szolgál. A tápanyagok biztosítása mellett a közeg hozzájárul a pH-érték és az ozmolalitás szintjének fenntartásához is.

A sejtkultúrában használt táptalajok típusai

Mind az emberi, mind az állati sejtek tenyészthetők mesterséges vagy szintetikus táptalajon, illetve természetes elemekkel kiegészített, teljesen természetes táptalajon. Az alábbiakban áttekintést adunk a jelenleg rendelkezésre álló különböző táptalajtípusokról.

Természetes táptalajok

A természetes táptalajokban kizárólag természetes állapotban előforduló biológiai folyadékok találhatók. A természetes táptalajok nagyon hasznosak és könnyen alkalmazhatók számos különböző állati sejttípus tenyésztéséhez. A természetes táptalajokat alkotó pontos összetevők ismeretének hiánya az elsődleges tényező, amely hozzájárul a természetes táptalajok használatával kapott eredmények alacsony megismételhetőségéhez.

Mesterséges táptalajok

A mesterséges vagy szintetikus táptalajok előállításához tápanyagok (szerves és szervetlen egyaránt), szérumfehérjék, szénhidrátok, kofaktorok, vitaminok és sók, valamint O2 és CO2 gázfázisok hozzáadása szükséges [1].

Különböző típusú mesterséges táptalajokat fejlesztettek ki a következő funkciók közül egy vagy több teljesítése érdekében: 1) Azonnali túlélés (kiegyensúlyozott sóoldat pontos pH-értékkel és ozmotikus nyomással). 2) Hosszabb idejű túlélés (kiegyensúlyozott sóoldat, amelyet különböző összetételű szerves vegyi anyagokkal és/vagy szérummal egészítenek ki). 3) Határidő nélküli fejlődés. 4) Speciális funkciók.

A mesterséges táptalajok négy különböző osztályba sorolhatók:

Szérumtartalmú táptalajok

Az állati sejtek tenyésztéséhez használt táptalajokban leggyakrabban előforduló kiegészítő a borjúszérum. Ezt olcsó kiegészítőként adják a tenyésztőtáptalajhoz a lehető legjobb növekedési feltételek elérése érdekében. A szérum nemcsak a labilis vagy vízben oldhatatlan tápanyagok, hormonok és növekedési faktorok, proteázgátlók és egyéb anyagok szállítójaként vagy kelátképzőjeként működik, hanem a káros molekulákat is megköti és semlegesíti.

Szérummentes táptalaj

A szérum jelenléte a táptalajban számos hátránnyal jár, és az immunológiai kutatásokban súlyos értelmezési hibákhoz vezethet [2, 3]. Számos különböző szérummentes táptalajt fejlesztettek ki [4, 5]. Ezeket a táptalajokat általában egy adott sejttípus tenyésztésének támogatására fejlesztették ki, például a Thermo Fisher Scientific Knockout Serum Replacement és Knockout DMEM táptalajait, valamint a Stem Cell Technologies mTESR táptalaját [6] az őssejtek számára [7].

Ezenkívül ezek a táptalajok meghatározott mennyiségű tisztított növekedési faktort, lipoproteint és egyéb fehérjét tartalmaznak, amelyeket egyébként általában a szérum biztosít [8]. Ezeket a táptalajokat gyakran „meghatározott összetételű tenyésztőtáptalajoknak” nevezik, mivel összetevőik jól ismertek.

Kémiailag meghatározott táptalajok

Ezek a táptalajok olyan ultratiszta szervetlen és szerves összetevőket tartalmaznak, amelyek semmiféle szennyeződéstől mentesek. Tartalmazhatnak továbbá tiszta fehérje-kiegészítőket is, például növekedési faktorokat.

 A baktériumok vagy élesztők genetikai módosítása, valamint bizonyos zsírsavak, vitaminok, koleszterin és aminosavak hozzáadása eredményeként keletkeznek ezek az összetevők [9].

Fehérje-mentes táptalajok

A fehérje-mentes táptalajok olyanok, amelyek egyáltalán nem tartalmaznak fehérjét, hanem kizárólag nem fehérje jellegű elemeket. A szérummal dúsított táptalajokhoz képest a fehérje-mentes táptalajok használata elősegíti a sejtek fokozottabb szaporodását és a fehérje-expressziót, valamint megkönnyíti a későbbi feldolgozási folyamatokban keletkező termékek tisztítását [10–12]. Az olyan készítményekben, mint az MEM és az RPMI-1640, nincs fehérje. Szükség esetén azonban fehérje-kiegészítőt is adagolhatnak.

Tenyésztőközeg és alapvető összetevői

A kereskedelmi forgalomban kapható tenyésztőközeg por vagy folyadék formájában szerezhető be, és gyakran tartalmaz különféle tápanyagokat, például aminosavakat, glükózt, sókat, vitaminokat és egyéb étrend-kiegészítőket. 

Ezen összetevők iránti igény minden sejtvonal esetében eltérő, és ezek a különbségek magyarázzák a táptalajok széles körű összetételét. Minden összetevő egy bizonyos funkciót lát el, amelyeket a következő bekezdésekben ismertetünk:

Pufferrendszerek

Az optimális tenyésztési feltételek fenntartása érdekében a pH-értéket szabályozni kell, ami gyakran kétféle pufferrendszer egyikével történik:

Természetes pufferrendszer

A légkörben a CO2/H2CO3 arány megegyezik a tápközegben mért értékkel, ami természetes puffermechanizmust hoz létre. A természetes puffermechanizmus megőrzése érdekében a tenyészeteket 5–10%-os CO2-tartalmú levegőben kell tartani, amit gyakran CO2-inkubátor használatával érnek el. A természetes puffer használatának egyik legnagyobb előnye, hogy olcsó és biztonságos.

HEPES

A HEPES zwitteriont alkalmazó kémiai pufferelés nagyobb pufferelési képességgel rendelkezik a 7,2–7,4 közötti pH-tartományban, és nem igényel szabályozott gázkörnyezetet. Bizonyos sejttípusok esetében a HEPES nagyobb adagja káros lehet. A HEPES-t tartalmazó táptalajok szintén sokkal érzékenyebbek a fluoreszkáló fény fototoxikus hatásaira [13].

Fenolvörös

A pH-indikátorként szolgáló fenolvörös gyakran megtalálható a kereskedelemben kapható tenyésztőközegben, lehetővé téve a pH folyamatos figyelemmel kísérését. A sejtek szaporodásával az általuk termelt metabolitok a pH-érték eltolódását, és ezáltal a tápközeg színének megváltozását idézik elő. A fenolvörös kettős hatást gyakorol a tápközeg színére: savas pH-értéknél sárgává, lúgos pH-értéknél pedig lilává változtatja azt. A sejtkultúrához optimális pH-érték, a 7,4, a tápközeget fluoreszkáló vörös színűvé teszi.

A fenolvörösnek azonban van néhány hátránya: Először is, a fenolvörös képes számos szteroid hormon, elsősorban az ösztrogén hatását szimulálni [14]. Ezért ösztrogénérzékeny sejtek, például emlőszövet vizsgálata során fenolvörösmentes tápközeg használata ajánlott. Számos szérummentes készítményben a fenolvörös jelenléte megzavarja a nátrium–kálium egyensúlyt. A tápközeghez szérum vagy szarvasmarha agyalapi mirigy hormon hozzáadása ellensúlyozhatja ezt a hatást [15]. Harmadszor, a fenolvörös jelenléte akadályozza a detektálást áramlási citometriás kísérletek során.

Szervetlen sók

A szervetlen sókat, például nátrium-, kálium- és kalciumionokat tartalmazó táptalajok elősegítik az ozmotikus egyensúly fenntartását és szabályozzák a membránpotenciált.

Aminosavak

Mivel az aminosavak a fehérjék alapvető alkotóelemei, minden eddig kifejlesztett sejttenyésztő tápközeg elengedhetetlen alkotóelemei. Mivel a sejtek bizonyos aminosavakat nem képesek önállóan előállítani, fontos, hogy a tenyésztőközeg tartalmazza az esszenciális aminosavakat. Ezek szükségesek a sejtek szaporodásához, és jelenlétük koncentrációja határozza meg az elérhető maximális sejtsűrűséget. Különösen fontos az L-glutamin, egy esszenciális aminosav.

Az L-glutamin az anyagcsere másodlagos energiaforrásaként működik, és nitrogént biztosít a NAD, a NADPH és a nukleotidok előállításához. Mivel az L-glutamin egy instabil aminosav, amely idővel olyan formává alakul át, amelyet a sejtek már nem tudnak hasznosítani, ezért azt a tápközegbe kell adagolni.

Ezen felül nem esszenciális aminosavakat is be lehet juttatni a tápközegbe, hogy pótolják a növekedési folyamat során felhasználtakat. A sejtek növekedése felgyorsul, és életképességük javul, ha a tápközeget nem esszenciális aminosavakkal egészítik ki.

Szénhidrátok

A cukor formájában előforduló szénhidrátok jelentik a fő energiaforrást. Számos táptalaj a glükóz és a galaktóz mellett maltózt és fruktózt is tartalmaz.

Fehérjék és peptidek

Az albumin, a transzferrin és a fibronektin a leggyakrabban használt fehérjék és peptidek. Különösen fontosak a szérumot nem tartalmazó táptalajokban. Az albumin, a transzferrin, az aprotinin, a fetuin és a fibronektin a szérumban előforduló fehérjék közé tartoznak, amely gazdag fehérjeforrás.

Az albumin a vérben található fő fehérje, amelynek feladata különböző anyagok – többek között víz, sók, szabad zsírsavak, hormonok és vitaminok – megkötése és szállítása a különböző szervek és sejtek között. Az albumin kémiai anyagokhoz való kötődési képessége miatt hatékonyan alkalmazható a sejtek tenyésztésére szolgáló táptalajból a káros vegyületek eltávolítására.

Az aprotinin védőanyagként szolgál a sejtkultúra-rendszerekben, mivel semleges és savas pH-érték mellett is stabil, valamint ellenáll a magas hőmérsékletnek és a proteolitikus enzimek által okozott lebomlásnak. Képes számos szerinproteáz gátlására, többek között a tripszinre is.

A fetuin egy glikoprotein, amely a felnőtt állatok szérumához képest nagyobb mennyiségben mutatható ki a magzati és újszülött állatok szérumában. Ezen felül szerinproteáz-gátlóként is hat. A fibronektin fehérje a sejtadhézió folyamatának elengedhetetlen alkotóeleme. A transzferrin egy fehérje, amely a vasat szállítja, és felelős a vas sejtmembránokba történő eljuttatásáért.

Zsírsavak és lipidek

A szérum hiányában döntő szerepet játszanak a szérummentes táptalajban.

Vitaminok

Számos vitamin szükséges a sejtek fejlődéséhez és szaporodásához. A sejtek nem képesek megfelelő mennyiségben előállítani a vitaminokat, ezért a szövetkultúrában étrend-kiegészítőként elengedhetetlenek.

A sejtkultúrában a szérum a vitaminok elsődleges forrása; a táptalajokat azonban különféle vitaminokkal is dúsítják, hogy azok egy adott sejttípus számára megfelelőek legyenek. A növekedés serkentésére leggyakrabban a B-csoportba tartozó vitaminokat használják.

Nyomelemek

Az olyan kémiai elemek, mint a réz, a cink, a szelén és a trikarbonsav-köztes termékek, nyomelemek néven ismertek. A nyomelemeket gyakran adják hozzá a szérumot nem tartalmazó táptalajokhoz, hogy pótolják a szérumban általában jelen lévőket. Ezek az elemek fontos kémiai összetevők, amelyek szükségesek az egészséges sejtfejlődéshez. Számos biokémiai reakció – például az enzimaktivitás – bizonyos mikrotápanyagoktól függ.

Tápközeg-kiegészítők

Az egyes sejtvonalak számára javasolt teljes növekedési táptalajhoz olyan kiegészítő összetevőkre van szükség, amelyek nem találhatók meg az alap-táptalajban és a szérumban. Ezek a táplálékkiegészítők támogatják a sejtek növekedését és a megfelelő anyagcserét.

Bár a hormonok, a növekedési faktorok és a jelátviteli molekulák elengedhetetlenek bizonyos sejtvonalak megfelelő szaporodásához, mindig be kell tartani a következő óvintézkedéseket: Mivel a kiegészítők hozzáadása megváltoztathatja a teljes tenyészközeg ozmolalitását, ami gátolhatja a sejtek fejlődését, ezért a kiegészítők hozzáadása után mindig célszerű ellenőrizni az ozmolalitást. A sejtvonalak többségénél az optimális ozmolalitás 260 és 320 mOSM/kg között mozog.

Antibiotikumok

Az antibiotikumokat gyakran alkalmazzák a baktériumok és gombák okozta szennyeződések gátlására [16], bár a sejtnövekedéshez nem elengedhetetlenek. Mivel az antibiotikumok elrejthetik a mikoplazma és az antibiotikum-rezisztens baktériumok által okozott szennyeződéseket, rutinszerű alkalmazásuk nem javasolt a sejtkultúrákban [17, 18].

Ezen felül az antibiotikumok megzavarhatják az érzékeny sejtek anyagcseréjét. Gyakran használják a MilliporeSigma és a Life Technologies által gyártott penicillin–streptomicin kombinációkat. A Plasmocint a TS603, TS516 és BT260 glióma sejtvonalak tenyésztésében alkalmazták [19], és kimutatták, hogy hatékony a mikoplazma-fertőzés eltávolításában (20).

Szérum

A szérumban albuminok, növekedési faktorok és növekedésgátlók egyaránt jelen vannak. A szérum a sejtkultúra-táptalaj egyik legfontosabb alkotóeleme, mivel aminosavakat, fehérjéket, vitaminokat (különösen zsírban oldódó vitaminokat, mint az A-, D-, E- és K-vitamin), szénhidrátokat, lipideket, hormonokat, növekedési faktorokat, ásványi anyagokat és nyomelemeket biztosít.

A tenyésztett sejtek fejlődésének elősegítésére gyakran használnak magzati és borjú származású szérumot. A magzati szérum bőséges növekedési faktor-forrás, és alkalmas sejtklónozásra, valamint érzékeny sejtek tenyésztésére. Csökkent növekedésserkentő képessége miatt a borjúszérumot kontaktgátlási kísérletekben alkalmazzák. A szokásos tenyésztőközegek gyakran 2–10% szérumot tartalmaznak. A szérum hozzáadása a tenyésztőközeghez a következő célokat szolgálja [21]:

• A szérum biztosítja a sejtek számára az alapvető tápanyagokat (oldatban és fehérjékhez kötve egyaránt).

• A szérumban számos, a növekedés elősegítésében és a speciális sejtaktivitásban részt vevő növekedési faktor és hormon található.

• Számos kötőfehérjét tartalmaz, például albumint és transzferint, amelyek más vegyi anyagokat szállítanak a sejtbe. Az albumin például zsírokat, vitaminokat, hormonokat stb. juttat a sejtekbe.

• Emellett olyan fehérjéket is biztosít, mint a fibronektin, amelyek fokozzák a sejtek tapadását a szubsztrátumhoz. Ezen felül olyan terjedési elemeket termel, amelyek elősegítik a sejtek osztódás előtti terjeszkedését.

• Proteázgátlókat juttat a sejtekbe, amelyek megakadályozzák a proteolízist.

• Emellett olyan ásványi anyagokat is tartalmaz, mint a Na+, K+, Zn2+ és Fe2+.

• Növeli a táptalaj viszkozitását, így védve a sejteket a szuszpenziós tenyésztés során fellépő keverés okozta mechanikai sérülésektől.

• Pufferként is működik.

Hivatkozások

[1] Morgan J, Morton H, Parker R. Állati sejtek táplálkozása szövetkultúrában; kezdeti vizsgálatok szintetikus táptalajon. Proc Soc Exp Biol Med. 1950;73:1-8

[2] Kerbel R, Blakeslee D. A magzati borjú szérum egyik komponensének gyors adszorpciója tenyésztett emlőssejtek által. Lehetséges artefaktusforrás a sejtspecifikus antigének elleni antiszérumok vizsgálatában. Immunology. 1976;31:881-91

[3] Sula K, Draber P, Nouza K. A sejtszuszpenziók előállításához használt tápközeghez adott szérum mint lehetséges artefaktusforrás a popliteális nyirokcsomó-teszt segítségével vizsgált sejtmediált reakciókban. J Immunogenet. 1980;7:483-9

[4] Mariani E, Mariani A, Monaco M, Lalli E, Vitale M, Facchini A. Kereskedelmi forgalomban kapható szérummentes táptalajok: hibridómák tenyésztése és monoklonális antitestek előállítása. J Immunol Methods. 1991;145:175-83

[5] Barnes D, Sato G. Módszerek tenyésztett sejtek szérummentes tápközegben történő szaporítására. Anal Biochem. 1980;102:255-70

[6] Yu H, Lu S, Gasior K, Singh D, Vazquez Sanchez S, Tapia O, et al. A HSP70 chaperonok az RNS-mentes TDP-43-at anizotróp, sejtmagon belüli folyékony gömb alakú héjakba kísérik. Science. 2021;371:

[7] Meharena H, Marco A, Dileep V, Lockshin E, Akatsu G, Mullahoo J, et al. A Down-szindróma által kiváltott szeneszcencia megzavarja az idegsejt-elősejtek sejtmag-szerkezetét. Cell Stem Cell. 2022;29:116–130.e7

[8] Iscove N, Melchers F. A szérum teljes helyettesítése albuminnal, transzferrinnel és szójabab-lipiddel lipopoliszacharidra reagáló B-limfociták tenyészetében. J Exp Med. 1978;147:923-33

[9] Stoll T, Muhlethaler K, von Stockar U, Marison I. A hibridómák tenyésztésére és monoklonális antitestek előállítására szolgáló, kémiailag definiált, fehérje-mentes tápközeg szisztematikus fejlesztése. J Biotechnol. 1996;45:111-23

[10] Darfler F. Fehérje-mentes táptalaj hibridómák és az immunrendszer egyéb sejtjeinek tenyésztéséhez. In Vitro Cell Dev Biol. 1990;26:769-78

[11] Barnes D, Sato G. Szérummentes sejtkultúra: egységes megközelítés. Cell. 1980;22:649-55

[12] Hamilton W, Ham R. Kínai hörcsög sejtvonalak klonális szaporodása fehérje-mentes táptalajon. In Vitro. 1977;13:537-47

[13] Zigler J, Lepe Zuniga J, Vistica B, Gery I. A fénynek kitett, HEPES-tartalmú tenyésztőközeg citotoxikus hatásainak elemzése. In Vitro Cell Dev Biol. 1985;21:282-7

[14] Berthois Y, Katzenellenbogen J, Katzenellenbogen B. A szövettenyésztő táptalajokban található fenolvörös gyenge ösztrogén: következmények az ösztrogénre reagáló sejtek tenyészetben történő vizsgálatára nézve. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:2496-500

[15] Karmiol S. Szérummentes táptalajok kifejlesztése. In: Master JRW (szerk.). Animal Cell culture, 3. kiadás. Oxford: Oxford University Press; 2000.

[16] Perlman D. Antibiotikumok alkalmazása sejtkultúra-táptalajokban. Methods Enzymol. 1979;58:110-6

[17] McGarrity G. A mikoplazmafertőzés terjedése és ellenőrzése sejtkultúrákban. In Vitro. 1976;12:643-8

[18] Masters J, Stacey G. A tápközeg cseréje és a sejtvonalak átültetése. Nat Protoc. 2007;2:2276–84

[19] Chakraborty A, Laukka T, Myllykoski M, Ringel A, Booker M, Tolstorukov M, et al. A KDM6A hiszton-demetiláz közvetlenül érzékeli az oxigént a kromatin és a sejtek sorsának szabályozása érdekében. Science. 2019;363:1217-1222

[20] Molla Kazemiha V, Azari S, Amanzadeh A, Bonakdar S, Shojaei Moghadam M, Habibi Anbouhi M, et al. A Plasmocin™ hatékonysága különböző, mollicutákkal fertőzött emlős sejtvonalakon, összehasonlítva a sejtkultúrában általánosan használt antibiotikumokkal: helyi tapasztalatok. Cytotechnology. 2011;63:609-20

[21] Kragh Hansen U. A ligandum szérumalbuminhoz való kötődésének molekuláris aspektusai. Pharmacol Rev. 1981;33:17-53