Середовища для культивування клітин: огляд

У галузі наук про життя однією з найважливіших методик є культивування клітин. Термін «культивування клітин» означає вилучення клітин, тканин або органів з організму тварини чи рослини та подальше їх імплантування в штучне середовище, сприятливе для їх виживання та/або росту. Основними вимогами до середовища для оптимального розвитку клітин є контрольована температура, субстрат для прикріплення клітин, відповідне середовище для культивування та інкубатор, що підтримує оптимальний рН та осмоляльність. Клітини повинні мати ці умови, щоб розвиватися на повну силу.

Вибір відповідного середовища для культивування in vitro є етапом клітинної культури, який є одночасно найкритичнішим і найважливішим. Середовище для росту, також відоме як культуральне середовище, — це рідина або гель, розроблений для стимулювання розвитку організмів на мікроскопічному, клітинному або рослинному рівні. Середовище, що використовується для культивування клітин, часто містить достатній запас енергії та речовин, які регулюють клітинний цикл. Основними компонентами культурального середовища є амінокислоти, вітаміни, неорганічні солі, глюкоза та сироватка. Сироватку додають до середовища, оскільки вона виступає джерелом факторів росту, гормонів та факторів прикріплення. Окрім забезпечення поживними речовинами, середовище також сприяє підтримці рівнів рН та осмоляльності.

Типи середовищ, що використовуються в клітинній культурі

Як клітини людини, так і клітини тварин можна культивувати як у штучному або синтетичному середовищі, так і в повністю природному середовищі, доповненому природними елементами. Далі ми надамо вам огляд різних типів середовищ, доступних на сьогодні.

Природні середовища

У природних середовищах містяться лише біологічні рідини, що існують у природному стані. Природні середовища є дуже корисними та зручними для культивування широкого спектру типів тваринних клітин. Недостатнє розуміння точного складу природних середовищ є основним фактором, що зумовлює низьку відтворюваність результатів, отриманих з використанням природних середовищ.

Штучні середовища

Приготування штучних або синтетичних середовищ передбачає додавання поживних речовин (як органічних, так і неорганічних), сироваткових білків, вуглеводів, кофакторів, вітамінів і солей, а також газових фаз O₂ і CO₂ [1].

Було розроблено різні типи штучних середовищ для виконання однієї або кількох із таких функцій: 1) Негайне виживання (збалансований сольовий розчин із точним значенням рН та осмотичним тиском). 2) Тривале виживання (збалансований сольовий розчин, доповнений різними сумішами органічних сполук та/або сироватки). 3) Необмежений розвиток. 4) Спеціалізовані функції.

Існує чотири окремі класифікації штучних середовищ:

Середовища, що містять сироватку

Найпоширенішим видом добавки у середовищах, що використовуються для культивування тваринних клітин, є фетальна бичача сироватка. Її додають до культурального середовища як недорогу добавку для досягнення найкращих можливих умов росту. Окрім того, що сироватка виконує роль переносника або хелатора для нестабільних або нерозчинних у воді поживних речовин, гормонів та факторів росту, інгібіторів протеаз та інших речовин, вона також зв’язує та нейтралізує шкідливі молекули.

Безсироваткові середовища

Наявність сироватки в середовищах має низку недоліків і може спричинити серйозні помилки в інтерпретації результатів імунологічних досліджень [2, 3]. Було створено цілу низку різних безсироваткових середовищ [4, 5]. Зазвичай ці середовища спеціально розроблені для культивування одного типу клітин, наприклад, Knockout Serum Replacement та Knockout DMEM від Thermo Fisher Scientific, а також середовище mTESR від Stem Cell Technologies [6] для стовбурових клітин [7].

Крім того, ці середовища містять визначені кількості очищених факторів росту, ліпопротеїнів та інших білків, які зазвичай забезпечуються саме сироваткою [8]. Ці середовища часто називають «визначеними культуральними середовищами», оскільки складники, з яких вони складаються, добре вивчені.

Хімічно визначені середовища

Ці середовища містять надчисті неорганічні та органічні компоненти, які не зазнали жодного виду забруднення. Вони також можуть містити добавки у вигляді чистих білків, таких як фактори росту.

 Генетична модифікація бактерій або дріжджів у поєднанні з додаванням певних жирних кислот, вітамінів, холестерину та амінокислот призводить до синтезу їхніх складових [9].

Безбілкові середовища

Безбілкові середовища — це середовища, які взагалі не містять білка, а замість цього містять лише небілкові елементи. У порівнянні з середовищами з додаванням сироватки використання середовищ без додавання білка сприяє більшій проліферації клітин та експресії білків, а також полегшує очищення будь-якого продукту, отриманого в подальшому процесі [10–12]. Білок не входить до складу таких середовищ, як MEM та RPMI-1640. Однак за необхідності можна додавати білкові добавки.

Культуральні середовища та їхні основні компоненти

Комерційні культуральні середовища можна придбати у вигляді порошку або рідини; вони часто містять різноманітні поживні речовини, такі як амінокислоти, глюкоза, солі, вітаміни та інші харчові добавки. 

Потреби в цих компонентах різняться для кожної клітинної лінії, і саме ці відмінності зумовлюють велику кількість різних рецептур середовищ. Кожен компонент виконує певну функцію, про що йтиметься в наступних параграфах:

Буферні системи

Для підтримання оптимальних умов росту необхідно контролювати рН, що часто здійснюється за допомогою однієї з двох буферних систем:

Природна буферна система

Співвідношення CO₂/H₂CO₃ в атмосфері дорівнює співвідношенню в середовищі, що створює природний буферний механізм. Щоб зберегти цей природний буферний механізм, культури необхідно утримувати в повітряному середовищі з вмістом CO₂ 5–10 %, чого часто досягають за допомогою CO₂-інкубатора. Однією з головних переваг використання природного буфера є його дешевизна та безпечність.

HEPES

Хімічне буферування з використанням цвіттеріону HEPES має більшу буферну здатність у діапазоні pH 7,2–7,4 і не потребує регульованого газового середовища. Для певних типів клітин більша доза HEPES може бути шкідливою. Середовища, що містять HEPES, також набагато чутливіші до фототоксичного впливу флуоресцентного світла [13].

Феноловий червоний

Індикатор рН феноловий червоний часто входить до складу комерційно доступних культуральних середовищ, що дозволяє здійснювати постійний моніторинг рН. У міру розмноження клітин метаболіти, що виробляються ними, спричиняють зміну рН і, відповідно, зміну кольору середовища. Феноловий червоний має подвійний вплив на колір середовища: при кислому рН воно стає жовтим, а при лужному — фіолетовим. рН 7,4 — оптимальне значення для культивування клітин — надає середовищу флуоресцентного червоного забарвлення.

Однак феноловий червоний має кілька недоліків: по-перше, він здатний імітувати дію низки стероїдних гормонів, насамперед естрогену [14]. Тому під час дослідження естрогенчутливих клітин, таких як тканина молочної залози, рекомендується використовувати середовище без фенолового червоного. Наявність фенолового червоного в деяких безсироваткових сумішах порушує натрій-калієвий баланс. Додавання до середовища сироватки або гормону гіпофіза великої рогатої худоби може нейтралізувати цей ефект [15]. По-третє, наявність фенолового червоного ускладнює виявлення клітин під час експериментів із проточною цитометрією.

Неорганічні солі

Середовища, що містять неорганічні солі, такі як іони натрію, калію та кальцію, сприяють підтримці осмотичної рівноваги та регулюють мембранний потенціал.

Амінокислоти

Оскільки амінокислоти є основними компонентами білків, вони є невід’ємною складовою кожного середовища для росту клітин, яке коли-небудь було розроблено. Оскільки клітини не здатні самостійно синтезувати певні амінокислоти, важливо, щоб культуральне середовище містило незамінні амінокислоти. Вони необхідні для проліферації клітин, а концентрація, в якій вони присутні, визначає максимальну щільність клітин, якої можна досягти. Зокрема, L-глутамін, незамінна амінокислота, відіграє особливо важливу роль.

L-глутамін виконує функцію вторинного джерела енергії для метаболізму та забезпечує азотом для синтезу NAD, NADPH та нуклеотидів. Оскільки L-глутамін є нестабільною амінокислотою, яка з часом перетворюється на форму, яку клітини не можуть використовувати, його необхідно додавати до середовища.

Крім того, до середовища можна додавати незамінні амінокислоти, щоб поповнити запаси тих, що були витрачені під час процесу росту. Додавання незамінних амінокислот до середовища для росту прискорює ріст клітин та підвищує їх життєздатність.

Вуглеводи

Вуглеводи у вигляді цукрів є основним джерелом енергії. Багато середовищ, окрім більш поширених цукрів — глюкози та галактози, — містять також мальтозу та фруктозу.

Білки та пептиди

Альбумін, трансферин та фібронектин — це найпоширеніші білки та пептиди. Вони мають особливе значення в середовищах, що не містять сироватки. Альбумін, трансферин, апротинін, фетуїн та фібронектин — це лише деякі з білків, які можна знайти в сироватці, що є багатим джерелом білка.

Альбумін — це основний білок крові, функція якого полягає у зв’язуванні та транспортуванні різних речовин, зокрема води, солей, вільних жирних кислот, гормонів та вітамінів, між різними органами та клітинами. Здатність альбуміну зв’язуватися з хімічними речовинами робить його ефективним засобом для видалення шкідливих сполук із середовища, в якому культивуються клітини.

Апротинін є захисним агентом у системах культивування клітин, оскільки він стабільний при нейтральному та кислому рН, а також стійкий до високих температур і руйнування, яке можуть спричиняти протеолітичні ферменти. Він здатний інгібувати низку серинових протеаз, зокрема трипсин.

Фетуїн — це глікопротеїн, який у сироватці крові плодів та новонароджених тварин може виявлятися у більших кількостях порівняно з сироваткою дорослих тварин. Крім того, він діє як інгібітор серинових протеаз. Білок фібронектин є важливим компонентом у процесі клітинної адгезії. Трансферин — це білок, який транспортує залізо та відповідає за доставку заліза до клітинних мембран.

Жирні кислоти та ліпіди

Вони відіграють вирішальну роль у безсироватковому середовищі за відсутності сироватки.

Вітаміни

Для розвитку та проліферації клітин необхідні численні вітаміни. Клітини не можуть синтезувати вітаміни в достатній кількості, тому вони є незамінними в культурах тканин як харчові добавки.

У клітинній культурі сироватка є основним джерелом вітамінів; однак середовища також збагачують різними вітамінами, щоб зробити їх придатними для конкретного типу клітин. Найчастіше для стимуляції росту використовують вітаміни групи В.

Мікроелементи

Хімічні елементи, такі як мідь, цинк, селен та проміжні сполуки трикарбонових кислот, відомі як мікроелементи. Мікроелементи часто додають до середовищ, що не містять сироватки, щоб замінити ті, які зазвичай присутні в сироватці. Ці елементи є важливими хімічними компонентами, необхідними для здорового розвитку клітин. Багато біохімічних реакцій, таких як активність ферментів, залежать від певних мікроелементів.

Добавки до середовища

Повноцінне живильне середовище, рекомендоване для певних клітинних ліній, потребує додаткових компонентів, яких немає у базовому середовищі та сироватці. Ці харчові добавки сприяють росту клітин та нормальному метаболізму.

Хоча гормони, фактори росту та сигнальні молекули є необхідними для належної проліферації певних клітинних ліній, завжди слід дотримуватися таких запобіжних заходів: оскільки додавання добавок може змінити осмоляльність повного живильного середовища, що може гальмувати розвиток клітин, завжди рекомендується перевіряти осмоляльність після додавання добавок. Для більшості клітинних ліній оптимальна осмоляльність становить від 260 до 320 мОсм/кг.

Антибіотики

Антибіотики часто застосовують для пригнічення розвитку бактеріальних та грибкових забруднювачів [16], хоча вони не є необхідними для росту клітин. Оскільки антибіотики можуть маскувати забруднення мікоплазмами та резистентними бактеріями, їхнє рутинне використання для клітинних культур не рекомендується [17, 18].

Крім того, антибіотики можуть порушувати метаболізм гіперчутливих клітин. Часто використовуються комбінації пеніциліну та стрептоміцину, вироблені компаніями MilliporeSigma та Life Technologies. Плазмоцин застосовувався при культивуванні клітинних ліній гліом TS603, TS516 та BT260 [19], і було доведено його ефективність у усуненні мікоплазмового забруднення (20).

Сироватка

У сироватці присутні альбуміни, фактори росту та інгібітори росту. Сироватка є одним із найважливіших компонентів середовища для культивування клітин, оскільки вона забезпечує амінокислоти, білки, вітаміни (особливо жиророзчинні вітаміни, такі як А, D, Е та К), вуглеводи, ліпіди, гормони, фактори росту, мінерали та мікроелементи.

Для стимулювання розвитку культивованих клітин часто використовують сироватку ембріональної та телячої походження. Ембріональна сироватка є багатим джерелом факторів росту і підходить для клонування клітин та розвитку чутливих клітин. Через знижені здатності до стимулювання росту телячу сироватку застосовують у експериментах з інгібування контакту. Звичайні середовища для культивування часто містять від 2 % до 10 % сироватки. Додавання сироватки до культурального середовища має такі цілі [21]:

• Сироватка постачає клітинам необхідні поживні речовини (як у розчині, так і у зв’язаному з білками вигляді).

• Сироватка містить низку факторів росту та гормонів, що беруть участь у стимулюванні росту та спеціалізованій діяльності клітин.

• Вона містить багато зв’язувальних білків, таких як альбумін і трансферин, які транспортують інші хімічні речовини в клітину. Наприклад, альбумін доставляє в клітини жири, вітаміни, гормони тощо.

• Вона також містить білки, такі як фібронектин, які підвищують адгезію клітин до субстрату. Крім того, вона виробляє елементи, що сприяють розширенню клітин перед поділом.

• Вона доставляє інгібітори протеаз, які запобігають протеолізу в клітинах.

• Вона також містить мінерали, такі як Na+, K+, Zn2+ та Fe2+.

• Він підвищує в'язкість середовища, тим самим захищаючи клітини від механічних пошкоджень під час перемішування суспензійної культури.

• Він також виконує буферну функцію.

Література

[1] Morgan J, Morton H, Parker R. Nutrition of animal cells in tissue culture; initial studies on a synthetic medium. Proc Soc Exp Biol Med. 1950;73:1-8

[2] Kerbel R, Blakeslee D. Швидка адсорбція компонента сироватки плода теляти клітинами ссавців у культурі. Потенційне джерело артефактів у дослідженнях антисироваток до клітинно-специфічних антигенів. Immunology. 1976;31:881-91

[3] Сула К., Драбер П., Ноуза К. Додавання сироватки до середовища, що використовується для приготування клітинних суспензій, як можливе джерело артефактів у клітинно-опосередкованих реакціях, досліджуваних за допомогою тесту на підколінних лімфатичних вузлах. J Immunogenet. 1980;7:483-9

[4] Маріані Е., Маріані А., Монако М., Лаллі Е., Вітале М., Фаччіні А. Комерційні безсироваткові середовища: ріст гібридом та виробництво моноклональних антитіл. J Immunol Methods. 1991;145:175–83

[5] Barnes D, Sato G. Методи культивування клітин у безсироватковому середовищі. Anal Biochem. 1980;102:255-70

[6] Ю Х., Лу С., Гасіор К., Сінг Д., Васкес Санчес С., Тапіа О. та ін. Шаперони HSP70 транспортують ТДП-43 без РНК у анізотропні внутрішньоядерні рідкі сферичні оболонки. Science. 2021;371:

[7] Мехарена Х., Марко А., Діліп В., Локшин Е., Акацу Г., Муллаху Дж. та ін. Старіння, індуковане синдромом Дауна, порушує архітектуру ядра нейральних прогеніторів. Cell Stem Cell. 2022;29:116–130.e7

[8] Іскоув Н., Мелчерс Ф. Повна заміна сироватки альбуміном, трансферином та соєвими ліпідами в культурах В-лімфоцитів, що реагують на ліпополісахариди. J Exp Med. 1978;147:923-33

[9] Stoll T, Muhlethaler K, von Stockar U, Marison I. Систематичне вдосконалення хімічно визначеного безбілкового середовища для росту гібридом та виробництва моноклональних антитіл. J Biotechnol. 1996;45:111-23

[10] Дарфлер Ф. Безбілкова середа для росту гібридом та інших клітин імунної системи. In Vitro Cell Dev Biol. 1990;26:769-78

[11] Барнс Д., Сато Г. Безсироваткова клітинна культура: уніфікований підхід. Cell. 1980;22:649–55

[12] Гамільтон В., Хем Р. Клональний ріст клітинних ліній китайського хом’яка в безбілкових середовищах. In Vitro. 1977;13:537–47

[13] Зіглер Дж., Лепе Зуніга Дж., Вістіка Б., Гері І. Аналіз цитотоксичних ефектів культивувального середовища, що містить HEPES, підданого впливу світла. In Vitro Cell Dev Biol. 1985;21:282-7

[14] Бертуа І., Каценелленбоген Ж., Каценелленбоген Б. Феноловий червоний у середовищах для культивування тканин є слабким естрогеном: наслідки для дослідження естрогенчутливих клітин у культурі. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:2496-500

[15] Karmiol S. Розробка безсироваткових середовищ. У: Master JRW, ред. Культура тваринних клітин, 3-тє вид. Оксфорд: Oxford University Press; 2000.

[16] Перлман Д. Застосування антибіотиків у середовищах для культивування клітин. Methods Enzymol. 1979;58:110-6

[17] McGarrity G. Поширення та контроль мікоплазмової інфекції клітинних культур. In Vitro. 1976;12:643–8

[18] Мастерс Дж., Стейсі Г. Заміна середовища та пасажування клітинних ліній. Nat Protoc. 2007;2:2276–84

[19] Чакраборти А., Лаукка Т., Миллікоскі М., Рінгель А., Букер М., Толсторуков М. та ін. Гістонова деметилаза KDM6A безпосередньо реагує на кисень, регулюючи хроматин та долю клітин. Science. 2019;363:1217-1222

[20] Молла Каземіха В., Азарі С., Аманзаде А., Бонакдар С., Шоджаї Могадам М., Хабібі Анбухі М. та ін. Ефективність препарату Plasmocin™ щодо різних ліній клітин ссавців, інфікованих молікутами, у порівнянні з антибіотиками, що зазвичай застосовуються в клітинних культурах: місцевий досвід. Cytotechnology. 2011;63:609–20

[21] Краг Хансен У. Молекулярні аспекти зв’язування ліганду з сироватковим альбуміном. Pharmacol Rev. 1981;33:17-53