PLAT-E

Plat-E (Platinum-E) to linia komórkowa służąca do pakowania retrowirusów, wyhodowana na bazie ludzkich embrionalnych komórek nerkowych 293T. Została ona opracowana w celu zapewnienia stabilnego i wydajnego systemu do przejściowej produkcji ekotropowych retrowirusów o wysokim mianie. Linia komórkowa została skonstruowana przy użyciu nowatorskich konstrukcji pakujących, w których ekspresja genów strukturalnych wirusa – gag-pol i env – jest sterowana przez ludzki promotor EF1α, który jest znacznie silniejszy w komórkach 293T niż konwencjonalny promotor długiego powtórzenia terminalnego (LTR) wirusa MuLV. Taka konstrukcja zapewnia silną aktywność transkrypcyjną i umożliwia produkcję na wysokim poziomie składników wirusowych niezbędnych do wydajnego montażu i pakowania retrowirusów.

Komórki Plat-E wyhodowano poprzez sekwencyjną stabilną transfekcję konstrukcji pEnv-IRES-puror i pGag-pol-IRES-bsr, które łączą geny wirusowe z markerami oporności na antybiotyki poprzez wewnętrzne miejsca wejścia rybosomu (IRES). Taka konfiguracja gwarantuje, że tylko komórki wyrażające niezbędne geny wirusowe zyskują również oporność na antybiotyki, co pozwala na selekcję subklonów o wysokiej ekspresji. Powstała linia Plat-E konsekwentnie wytwarza retrowirusy o mianie do 1 × 10⁷ jednostek zakaźnych na mililitr przez co najmniej cztery miesiące, gdy jest hodowana w warunkach podwójnej selekcji z użyciem puromycyny i blastycydyny. Analizy metodą Northern blot, aktywności odwrotnej transkryptazy oraz cytometrii przepływowej potwierdziły, że Plat-E wykazuje znacznie wyższą ekspresję gag-pol i env niż poprzednie linie pakujące, takie jak Bosc23 i Phoenix-E.

Architektura Plat-E minimalizuje ryzyko wytworzenia retrowirusa zdolnego do replikacji (RCR) poprzez ograniczenie konstrukcji pakujących wyłącznie do niezbędnych regionów kodujących genów strukturalnych wirusa i rozdzielenie ich na różne plazmidy. Taka konstrukcja wymaga co najmniej trzech zdarzeń rekombinacji do wytworzenia RCR, co zwiększa bezpieczeństwo biologiczne. Plat-E okazał się przydatny w zastosowaniach związanych z transferem genów, w tym w skutecznej transdukcji komórek pierwotnych, takich jak komórki T i komórki tuczne. Jego wydajność i długoterminowa stabilność sprawiają, że jest to niezawodna platforma do produkcji wektorów retrowirusowych zarówno w badaniach podstawowych, jak i przedklinicznym rozwoju terapii genowej.

37°C, 5%_CO2, nawilżona atmosfera.

1. Confirm that the vial remains deeply frozen upon delivery, as cells are shipped on dry ice to maintain optimal temperatures during transit.

2. Upon receipt, either store the cryovial immediately at temperatures below -150°C to ensure the preservation of cellular integrity, or proceed to step 3 if immediate culturing is required.

3. For immediate culturing, swiftly thaw the vial by immersing it in a 37°C water bath with clean water and an antimicrobial agent, agitating gently for 40-60 seconds until a small ice clump remains.

4. Perform all subsequent steps under sterile conditions in a flow hood, disinfecting the cryovial with 70% ethanol before opening.

5. Carefully open the disinfected vial and transfer the cell suspension into a 15 ml centrifuge tube containing 8 ml of room-temperature culture medium, mixing gently.

6. Centrifuge the mixture at 300 x g for 3 minutes to separate the cells and carefully discard the supernatant containing residual freezing medium.

7. Gently resuspend the cell pellet in 10 ml of fresh culture medium. For adherent cells, divide the suspension between two T25 culture flasks; for suspension cultures, transfer all the medium into one T25 flask to promote effective cell interaction and growth.

8. Adhere to established subculture protocols for continued growth and maintenance of the cell line, ensuring reliable experimental outcomes.

Zanieczyszczenie mykoplazmą jest wykluczane przy użyciu zarówno testów opartych na PCR, jak i metod wykrywania mykoplazmy opartych na luminescencji.

Aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia bakteriami, grzybami lub drożdżami, hodowle komórkowe są poddawane codziennym kontrolom wizualnym.

W celu długotrwałego przechowywania należy umieścić fiolki w ciekłym azocie w fazie lotnej w temperaturze od -150 do -196 °C. Przechowywanie w temperaturze -80 °C jest dopuszczalne tylko jako krótki etap przejściowy przed przeniesieniem do ciekłego azotu.

Linie komórkowe poddane kriokonserwacji są wysyłane w suchym lodzie w zatwierdzonych, izolowanych opakowaniach z wystarczającą ilością czynnika chłodniczego, aby utrzymać temperaturę około -78°C przez cały czas transportu. Po otrzymaniu przesyłki należy natychmiast sprawdzić pojemnik i bezzwłocznie przenieść fiolki do odpowiedniego miejsca przechowywania.

W Cytion gwarantujemy jakość i żywotność naszych produktów. Gwarantujemy, że nasze komórki będą żywotne na początku hodowli przez 60 dni po wysyłce z naszych zakładów. Zapewniamy, że wszystkie materiały są zgodne ze specyfikacjami opisanymi w certyfikacie analizy i/lub karcie produktu

Szczegółowe informacje można znaleźć w naszej <a href=""/Who-we-are/Warranty/"" hreflang=""x-default"">Oświadczeniu gwarancyjnym