PLAT-E

A Plat-E (Platinum-E) é uma linhagem celular de empacotamento de retrovírus, criada a partir da linhagem celular renal embrionária humana 293T. Ela foi desenvolvida para fornecer um sistema estável e eficiente para a produção transitória de retrovírus ecotrópicos de alto título. A linha celular foi construída utilizando novas construções de empacotamento nas quais a expressão dos genes estruturais virais — gag-pol e env — é regulada pelo promotor EF1α humano, que é substancialmente mais potente nas células 293T do que o promotor convencional de repetição terminal longa (LTR) do MuLV. Esse projeto garante uma atividade transcricional robusta e permite a produção em alto nível dos componentes virais necessários para a montagem e empacotamento eficientes do retrovírus.

As células Plat-E foram geradas por meio da transfecção estável sequencial das construções pEnv-IRES-puror e pGag-pol-IRES-bsr, que ligam os genes virais a marcadores de resistência a antibióticos por meio de sítios internos de entrada no ribossomo (IRES). Essa configuração garante que apenas as células que expressam os genes virais essenciais também adquiram resistência aos antibióticos, permitindo a seleção de subclones de alta expressão. A linhagem Plat-E resultante produz consistentemente retrovírus com títulos de até 1 × 10⁷ unidades infecciosas por mililitro por pelo menos quatro meses quando cultivada sob seleção dupla com puromicina e blasticidina. Análises de Northern blot, atividade da transcriptase reversa e citometria de fluxo confirmaram que a Plat-E exibe expressão significativamente maior de gag-pol e env do que linhas de empacotamento predecessoras, como a Bosc23 e a Phoenix-E.

A arquitetura da Plat-E minimiza o risco de geração de retrovírus com capacidade de replicação (RCR) ao limitar as construções de empacotamento apenas às regiões codificantes necessárias dos genes estruturais virais e separá-las em plasmídeos diferentes. Esse projeto requer pelo menos três eventos de recombinação para produzir RCR, aumentando assim a biossegurança. O Plat-E tem se mostrado útil em aplicações de transferência gênica, incluindo a transdução eficiente de células primárias, como células T e mastócitos. Seu desempenho e estabilidade a longo prazo o tornam uma plataforma confiável para a produção de vetores retrovirais, tanto na pesquisa básica quanto no desenvolvimento pré-clínico de terapia gênica.

37 °C, 5% de CO₂, atmosfera umidificada.

1. Confirm that the vial remains deeply frozen upon delivery, as cells are shipped on dry ice to maintain optimal temperatures during transit.

2. Upon receipt, either store the cryovial immediately at temperatures below -150°C to ensure the preservation of cellular integrity, or proceed to step 3 if immediate culturing is required.

3. For immediate culturing, swiftly thaw the vial by immersing it in a 37°C water bath with clean water and an antimicrobial agent, agitating gently for 40-60 seconds until a small ice clump remains.

4. Perform all subsequent steps under sterile conditions in a flow hood, disinfecting the cryovial with 70% ethanol before opening.

5. Carefully open the disinfected vial and transfer the cell suspension into a 15 ml centrifuge tube containing 8 ml of room-temperature culture medium, mixing gently.

6. Centrifuge the mixture at 300 x g for 3 minutes to separate the cells and carefully discard the supernatant containing residual freezing medium.

7. Gently resuspend the cell pellet in 10 ml of fresh culture medium. For adherent cells, divide the suspension between two T25 culture flasks; for suspension cultures, transfer all the medium into one T25 flask to promote effective cell interaction and growth.

8. Adhere to established subculture protocols for continued growth and maintenance of the cell line, ensuring reliable experimental outcomes.

A contaminação por micoplasma é descartada por meio de ensaios baseados em PCR e de métodos de detecção de micoplasma baseados em luminescência.

Para garantir que não haja contaminação por bactérias, fungos ou leveduras, as culturas celulares são submetidas a inspeções visuais diárias.

Para preservação a longo prazo, coloque os frascos em nitrogênio líquido em fase de vapor a uma temperatura entre aproximadamente −150 e −196 °C. O armazenamento a −80 °C é aceitável apenas como uma etapa intermediária de curta duração antes da transferência para o nitrogênio líquido.

As linhagens celulares criopreservadas são enviadas em gelo seco, em embalagens isoladas e validadas, com refrigerante suficiente para manter a temperatura em aproximadamente −78 °C durante todo o transporte. Ao receber a remessa, inspecione o recipiente imediatamente e transfira os frascos sem demora para o local de armazenamento adequado.

Na Cytion, garantimos a qualidade e a viabilidade de nossos produtos. Garantimos que nossas células permanecerão viáveis no início da cultura por 60 dias após o envio de nossas instalações. Asseguramos que todos os materiais estão em conformidade com as especificações descritas no Certificado de Análise e/ou na Ficha Técnica do Produto.

Para obter todos os detalhes, consulte nossa Declaração de Garantia.