Kultivačné médiá: Prehľad

V oblasti prírodných vied patrí medzi najdôležitejšie metodiky kultivácia buniek. Pod pojmom „kultivácia buniek“ sa rozumie odber buniek, tkanív alebo orgánov zo zvieraťa alebo rastliny a ich následná implantácia do umelého prostredia, ktoré je priaznivé pre ich prežitie a/alebo rast. Základnými environmentálnymi požiadavkami pre optimálny vývoj buniek sú kontrolovaná teplota, substrát pre priľnutie buniek, vhodné kultivačné médium a inkubátor, ktorý udržiava optimálne pH a osmolalitu. Bunky musia mať tieto podmienky, aby mohli rásť na plný potenciál.

Výber vhodného rastového média pre kultiváciu in vitro je fázou v bunkovej kultúre, ktorá je zároveň najkritickejšia aj najdôležitejšia. Rastové médium, známe aj ako kultivačné médium, je kvapalina alebo gél vyvinutý na podporu vývoja organizmov v mikroskopickom, bunkovom alebo rastlinnom meradle. Médium používané na kultiváciu buniek často obsahuje dostatočný prísun energie a látok, ktoré regulujú bunkový cyklus. Medzi hlavné zložky kultivačného média patria aminokyseliny, vitamíny, anorganické soli, glukóza a sérum. Sérum sa do média pridáva, pretože slúži ako zdroj rastových faktorov, hormónov a adhéznych faktorov. Okrem dodávania živín prispieva médium aj k udržiavaniu úrovne pH a osmolality.

Druhy médií používaných v bunkovej kultúre

Ľudské aj živočíšne bunky je možné kultivovať buď v umelom alebo syntetickom médiu, alebo v úplne prírodnom médiu, ktoré je doplnené prírodnými prvkami. V nasledujúcom texte vám poskytneme prehľad rôznych typov médií, ktoré sú v súčasnosti k dispozícii.

Prírodné kultivačné médiá

V prírodných médiách sa nachádzajú iba biologické tekutiny, ktoré existujú v ich prirodzenom stave. Prírodné médiá sú veľmi užitočné a vhodné na kultiváciu širokej škály typov živočíšnych buniek. Nedostatočné poznanie presných zložiek, z ktorých sa prírodné médiá skladajú, je hlavným faktorom prispievajúcim k nízkej opakovateľnosti výsledkov získaných pri použití prírodných médií.

Umelé živné prostredia

Príprava umelých alebo syntetických médií zahŕňa pridávanie živín (organických aj anorganických), sérových proteínov, sacharidov, kofaktorov, vitamínov a solí, ako aj plynných fáz O₂ a CO₂ [1].

Boli vyvinuté rôzne typy umelých médií s cieľom splniť jednu alebo viaceré z nasledujúcich funkcií: 1) Okamžité prežitie (vyvážený soľný roztok s presným pH a osmotickým tlakom). 2) Predĺžené prežitie (vyvážený soľný roztok doplnený rôznymi zložkami organických chemikálií a/alebo séra). 3) Neobmedzený vývoj. 4) Špecializované funkcie.

Existujú štyri odlišné klasifikácie umelých médií:

Kultivačné médiá obsahujúce sérum

Najčastejším doplnkom v kultivačných médiách používaných na kultiváciu živočíšnych buniek je fetálne bovinné sérum. Pridáva sa do kultivačného média ako lacný doplnok s cieľom dosiahnuť čo najlepšie podmienky rastu. Okrem toho, že pôsobí ako transportér alebo chelátor živín, ktoré sú nestále alebo nerozpustné vo vode, hormónov a rastových faktorov, inhibítorov proteáz a iných látok, sérum tiež viaže a neutralizuje škodlivé molekuly.

Prostredie bez séra

Prítomnosť séra v kultivačných médiách má viacero nevýhod a môže spôsobiť závažné chyby pri interpretácii výsledkov v imunologickom výskume [2, 3]. Bolo vyvinutých množstvo rôznych bezsérumových médií [4, 5]. Tieto kultivačné médiá sú vo všeobecnosti špecificky formulované na podporu kultivácie jediného typu buniek, ako napríklad Knockout Serum Replacement a Knockout DMEM od spoločnosti Thermo Fisher Scientific a médium mTESR od spoločnosti Stem Cell Technologies [6] určené pre kmeňové bunky [7].

Okrem toho tieto kultivačné médiá obsahujú definované množstvá purifikovaných rastových faktorov, lipoproteínov a iných proteínov, ktoré by inak typicky poskytovalo sérum [8]. Tieto kultivačné médiá sa často označujú ako „definované kultivačné médiá“, keďže zložky, z ktorých sa skladajú, sú dobre známe.

Chemicky definované kultivačné médiá

Tieto kultivačné médiá obsahujú ultračisté anorganické a organické zložky, ktoré neboli kontaminované žiadnym druhom znečistenia. Môžu tiež obsahovať prísady v podobe čistých proteínov, ako sú rastové faktory.

 Genetická modifikácia baktérií alebo kvasiniek spolu s pridaním konkrétnych mastných kyselín, vitamínov, cholesterolu a aminokyselín vedie k produkcii ich zložiek [9].

Prostredia bez bielkovín

Médiá bez bielkovín sú také, ktoré neobsahujú žiadne bielkoviny a namiesto toho obsahujú iba neproteínové zložky. V porovnaní s médiami s pridaným sérom podporuje použitie médií bez pridaných bielkovín väčšiu proliferáciu buniek a expresiu bielkovín a uľahčuje purifikáciu akéhokoľvek produktu vytvoreného v nadväzujúcom procese [10–12]. Bielkoviny nie sú súčasťou zloženia médií ako MEM a RPMI-1640. V prípade potreby je však možné pridať bielkovinový doplnok.

Kultivačné médiá a ich základné zložky

Komerčné kultivačné médium je možné zakúpiť vo forme prášku alebo kvapaliny a často obsahuje rôzne živiny, ako sú aminokyseliny, glukóza, soli, vitamíny a iné výživové doplnky. 

Potreby týchto zložiek sa líšia pre každú bunkovú líniu a práve tieto rozdiely sú zodpovedné za širokú škálu rôznych zložení médií. Každá zložka plní určitú funkciu, ktorá bude opísaná v nasledujúcich odsekoch:

Pufrovacie systémy

Na udržanie optimálnych podmienok rastu je potrebné regulovať hodnotu pH, čo sa často vykonáva pomocou jedného z dvoch pufrovacích systémov:

Prirodzený pufrovací systém

Pomer CO₂/H₂CO₃ v atmosfére je rovnaký ako v kultivačnom médiu, čím vzniká prirodzený pufrovací mechanizmus. S cieľom zachovať tento prirodzený pufrovací mechanizmus musia byť kultúry udržiavané v prostredí so 5–10 % CO₂, čo sa často dosahuje použitím CO₂ inkubátora. Jednou z najväčších výhod používania prírodného pufru je jeho nízka cena a bezpečnosť.

HEPES

Chemická pufrovanie pomocou zwitteriónu HEPES má väčšiu pufrovaciu schopnosť v rozmedzí pH 7,2–7,4 a nevyžaduje regulované plynné prostredie. Pre niektoré typy buniek môže byť vyššia dávka HEPES škodlivá. Kultivačné médiá obsahujúce HEPES sú tiež oveľa citlivejšie na fototoxické účinky fluorescenčného svetla [13].

Fenolová červená

Indikátor pH fenolová červená je často súčasťou komerčne dostupných kultivačných médií, čo umožňuje nepretržité monitorovanie pH. Pri rozmnožovaní buniek spôsobujú metabolity produkované týmito bunkami zmenu pH a tým aj zmenu farby média. Fenolová červená má dvojitý vplyv na farbu kultivačného média – pri kyslom pH ho zafarbí na žlto a pri zásaditom pH na fialovo. Pri pH 7,4, čo je optimálna hodnota pre bunkovú kultúru, sa médium javí ako fluorescenčne červené.

Fenolová červená má však niekoľko nevýhod: Po prvé, fenolová červená je schopná simulovať pôsobenie viacerých steroidných hormónov, predovšetkým estrogénu [14]. Preto sa pri štúdiu buniek citlivých na estrogén, ako je tkanivo prsníka, odporúča médium bez fenolovej červenej. Prítomnosť fenolovej červenej v niektorých bezsérumových zloženiach narúša rovnováhu sodíka a draslíka. Pridanie séra alebo hormónu z hypofýzy hovädzieho do živného média môže tento účinok vyvážiť [15]. Po tretie, prítomnosť fenolovej červenej sťažuje detekciu v prietokových cytometrických experimentoch.

Anorganické soli

Kultivačné médiá obsahujúce anorganické soli, ako sú ióny sodíka, draslíka a vápnika, pomáhajú udržiavať osmotickú rovnováhu a regulovať membránový potenciál.

Aminokyseliny

Keďže aminokyseliny sú základnými zložkami bielkovín, sú nevyhnutnou súčasťou každého kultivačného média pre rast buniek, aké kedy bolo vyvinuté. Keďže bunky nie sú schopné samy produkovať určité aminokyseliny, je dôležité, aby kultivačné médium obsahovalo esenciálne aminokyseliny. Sú nevyhnutné pre proliferáciu buniek a koncentrácia, v akej sú prítomné, určuje maximálnu hustotu buniek, ktorú je možné dosiahnuť. Obzvlášť dôležitá je esenciálna aminokyselina L-glutamín.

L-glutamín funguje ako sekundárny zdroj energie pre metabolizmus a dodáva dusík na produkciu NAD, NADPH a nukleotidov. Vzhľadom na to, že L-glutamín je nestála aminokyselina, ktorá sa časom mení na formu, ktorú bunky nedokážu využiť, musí sa do média dodávať.

Okrem toho je možné do živného média pridať neesenciálne aminokyseliny, aby sa doplnili tie, ktoré sa počas rastového procesu spotrebovali. Pridaním neesenciálnych aminokyselín do rastového média sa urýchli rast buniek a zvýši sa ich životaschopnosť.

Sacharidy

Sacharidy vo forme cukrov sú hlavným zdrojom energie. Mnohé kultivačné médiá obsahujú okrem bežnejších cukrov, ako sú glukóza a galaktóza, aj maltózu a fruktózu.

Bielkoviny a peptidy

Albumín, transferín a fibronektín sú najčastejšie používané bielkoviny a peptidy. Majú osobitný význam v kultivačných médiách, ktoré neobsahujú sérum. Albumín, transferín, aprotinín, fetuín a fibronektín patria medzi bielkoviny, ktoré sa môžu nachádzať v sére, ktoré je bohatým zdrojom bielkovín.

Albumín je hlavná bielkovina nachádzajúca sa v krvi a jeho funkciou je viazať a transportovať rôzne látky, vrátane vody, solí, voľných mastných kyselín, hormónov a vitamínov, medzi rôznymi orgánmi a bunkami. Schopnosť albumínu viazať sa na chemické látky z neho robí účinný prostriedok na odstraňovanie škodlivých zlúčenín z kultivačného média, v ktorom sa bunky kultivujú.

Aprotinín je ochranná látka v systémoch bunkových kultúr, keďže je stabilný pri neutrálnom aj kyslom pH a je odolný voči vysokým teplotám a deštrukcii, ktorú môžu spôsobiť proteolytické enzýmy. Je schopný inhibovať celý rad serínových proteáz, medzi inými aj trypsín.

Fetuín je glykoproteín, ktorý sa môže vyskytovať vo vyšších množstvách v sére plodov a novorodencov v porovnaní so sérom dospelých jedincov. Okrem toho pôsobí ako inhibítor serínových proteáz. Proteín fibronektín je nevyhnutnou zložkou procesu bunkovej adhézie. Transferín je bielkovina, ktorá transportuje železo a zodpovedá za jeho dodávanie do bunkových membrán.

Mastné kyseliny a lipidy

Hrajú kľúčovú úlohu v bezsérovom médiu, keď chýba sérum.

Vitamíny

Pre vývoj a proliferáciu buniek je potrebných množstvo vitamínov. Bunky nedokážu produkovať vitamíny v dostatočnom množstve, a preto sú v tkanivových kultúrach nevyhnutné ako výživové doplnky.

V bunkovej kultúre je sérum primárnym zdrojom vitamínov; kultivačné médiá sa však tiež obohacujú o rôzne vitamíny, aby boli vhodné pre konkrétny typ buniek. Najčastejšie sa na stimuláciu rastu používajú vitamíny skupiny B.

Stopové prvky

Chemické prvky, ako sú meď, zinok, selén a medziprodukty trikarboxylových kyselín, sa nazývajú stopové prvky. Stopové prvky sa často pridávajú do médií, ktoré neobsahujú sérum, aby nahradili tie, ktoré sa zvyčajne nachádzajú v sére. Tieto prvky sú dôležitými chemickými zložkami, ktoré sú potrebné pre zdravý vývoj buniek. Mnohé biochemické reakcie závisia od určitých mikroživín, napríklad od enzýmovej aktivity.

Doplnky kultivačného média

Kompletné rastové médium odporúčané pre určité bunkové línie vyžaduje dodatočné zložky, ktoré chýbajú v základných médiách a sére. Tieto doplnky podporujú rast buniek a správnu metabolickú funkciu.

Hoci sú hormóny, rastové faktory a signálne molekuly nevyhnutné pre správnu proliferáciu konkrétnych bunkových línií, vždy by sa mali dodržiavať nasledujúce opatrenia: Keďže pridanie doplnkov môže zmeniť osmolalitu kompletného rastového média, čo môže inhibovať vývoj buniek, vždy sa odporúča overiť osmolalitu po pridaní doplnkov. Pre väčšinu bunkových línií sa optimálna osmolalita pohybuje v rozmedzí 260 až 320 mOSM/kg.

Antibiotiká

Antibiotiká sa často používajú na potlačenie rozvoja bakteriálnych a plesňových kontaminantov [16], hoci nie sú nevyhnutné pre rast buniek. Keďže antibiotiká môžu zakryť kontamináciu mykoplazmami a rezistentnými baktériami, ich rutinné používanie sa v bunkových kultúrach neodporúča [17, 18].

Okrem toho môžu antibiotiká narušiť metabolizmus citlivých buniek. Často sa používajú kombinácie penicilínu a streptomycínu od spoločností MilliporeSigma a Life Technologies. Plasmocin sa používal pri kultivácii gliómových bunkových línií TS603, TS516 a BT260 [19] a preukázalo sa, že je účinný pri odstraňovaní kontaminácie mykoplazmami (20).

Sérum

V sére sa nachádzajú albumíny, rastové faktory aj inhibítory rastu. Sérum je jednou z najdôležitejších zložiek kultivačného média, pretože poskytuje aminokyseliny, bielkoviny, vitamíny (najmä vitamíny rozpustné v tukoch, ako sú A, D, E a K), sacharidy, lipidy, hormóny, rastové faktory, minerály a stopové prvky.

Na podporu vývoja kultivovaných buniek sa často využíva sérum z fetálnych a teľacích zdrojov. Fetálne sérum je bohatým zdrojom rastových faktorov a je vhodné na klonovanie buniek a vývoj citlivých buniek. Vzhľadom na svoje znížené schopnosti podporovať rast sa teľacie sérum používa v experimentoch s inhibíciou kontaktu. Bežné rastové médiá často obsahujú 2 % až 10 % séra. Pridanie séra do kultivačného média slúži na nasledujúce účely [21]:

• Sérum dodáva bunkám esenciálne živiny (ako v roztoku, tak viazané na bielkoviny).

• Sérum obsahuje viacero rastových faktorov a hormónov, ktoré sa podieľajú na podpore rastu a špecializovanej činnosti buniek.

• Obsahuje mnoho viažucich proteínov, ako je albumín a transferín, ktoré transportujú iné chemické látky do buniek. Napríklad albumín dodáva do buniek tuky, vitamíny, hormóny atď.

• Poskytuje tiež proteíny, ako je fibronektín, ktoré zvyšujú adhéziu buniek k substrátu. Okrem toho produkuje prvky podporujúce šírenie, ktoré pomáhajú pri expanzii buniek pred delením.

• Dodáva inhibítory proteáz, ktoré zabraňujú proteolýze v bunkách.

• Obsahuje tiež minerály, ako sú Na+, K+, Zn2+ a Fe2+.

• Zvyšuje viskozitu kultivačného média, čím chráni bunky pred mechanickým poškodením počas premiešavania suspenznej kultúry.

• Pôsobí tiež ako pufr.

Referencie

[1] Morgan J, Morton H, Parker R. Výživa živočíšnych buniek v tkanivovej kultúre; počiatočné štúdie na syntetickom médiu. Proc Soc Exp Biol Med. 1950;73:1-8

[2] Kerbel R, Blakeslee D. Rýchla adsorpcia zložky fetálneho teľacieho séra bunkami cicavcov v kultúre. Potenciálny zdroj artefaktov v štúdiách antisér proti bunkovo-špecifickým antigénom. Immunology. 1976;31:881-91

[3] Sula K, Draber P, Nouza K. Pridanie séra do média používaného na prípravu bunkových suspenzií ako možný zdroj artefaktov v bunkovo sprostredkovaných reakciách skúmaných pomocou testu popliteálnej lymfatickej uzliny. J Immunogenet. 1980;7:483-9

[4] Mariani E, Mariani A, Monaco M, Lalli E, Vitale M, Facchini A. Komerčné bezsérumové živné prostredia: rast hybridómov a produkcia monoklonálnych protilátok. J Immunol Methods. 1991;145:175-83

[5] Barnes D, Sato G. Metódy kultivácie buniek v bezsérumovom médiu. Anal Biochem. 1980;102:255-70

[6] Yu H, Lu S, Gasior K, Singh D, Vazquez Sanchez S, Tapia O, et al. Chaperóny HSP70 transportujú TDP-43 bez RNA do anizotropných intranukleárnych tekutých sférických obalov. Science. 2021;371:

[7] Meharena H, Marco A, Dileep V, Lockshin E, Akatsu G, Mullahoo J, a kol. Senescencia vyvolaná Downovým syndrómom narúša architektúru jadra neurálnych progenitorových buniek. Cell Stem Cell. 2022;29:116–130.e7

[8] Iscove N, Melchers F. Úplné nahradenie séra albumínom, transferínom a sójovým lipidom v kultúrach B-lymfocytov reagujúcich na lipopolysacharidy. J Exp Med. 1978;147:923-33

[9] Stoll T, Muhlethaler K, von Stockar U, Marison I. Systematické zdokonaľovanie chemicky definovaného prostredia bez bielkovín pre rast hybridómov a produkciu monoklonálnych protilátok. J Biotechnol. 1996;45:111-23

[10] Darfler F. Bezproteínové médium pre rast hybridóm a iných buniek imunitného systému. In Vitro Cell Dev Biol. 1990;26:769-78

[11] Barnes D, Sato G. Kultivácia buniek bez séra: jednotný prístup. Cell. 1980;22:649-55

[12] Hamilton W, Ham R. Klonálny rast bunkových línií čínskeho škrečka v prostrediach bez bielkovín. In Vitro. 1977;13:537-47

[13] Zigler J, Lepe Zuniga J, Vistica B, Gery I. Analýza cytotoxických účinkov kultivačného média obsahujúceho HEPES vystaveného pôsobeniu svetla. In Vitro Cell Dev Biol. 1985;21:282-7

[14] Berthois Y, Katzenellenbogen J, Katzenellenbogen B. Fenolová červená v kultivačných médiách pre tkanivové kultúry je slabý estrogén: dôsledky pre štúdium buniek citlivých na estrogén v kultúre. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:2496-500

[15] Karmiol S. Vývoj bezsérumových médií. In: Master JRW, editor. Kultivácia živočíšnych buniek, 3. vyd. Oxford: Oxford University Press; 2000.

[16] Perlman D. Použitie antibiotík v kultivačných médiách. Methods Enzymol. 1979;58:110-6

[17] McGarrity G. Šírenie a kontrola mykoplazmatickej infekcie bunkových kultúr. In Vitro. 1976;12:643-8

[18] Masters J, Stacey G. Výmena živného média a pasážovanie bunkových línií. Nat Protoc. 2007;2:2276–84

[19] Chakraborty A, Laukka T, Myllykoski M, Ringel A, Booker M, Tolstorukov M, et al. Histónová demetyláza KDM6A priamo vníma kyslík na reguláciu chromatínu a osudu buniek. Science. 2019;363:1217-1222

[20] Molla Kazemiha V, Azari S, Amanzadeh A, Bonakdar S, Shojaei Moghadam M, Habibi Anbouhi M, et al. Účinnosť prípravku Plasmocin™ na rôznych bunkových líniách cicavcov infikovaných mollicutami v porovnaní s bežne používanými antibiotikami v bunkovej kultúre: miestne skúsenosti. Cytotechnology. 2011;63:609-20

[21] Kragh Hansen U. Molekulárne aspekty väzby liganda na sérový albumín. Pharmacol Rev. 1981;33:17-53