Milieux de culture cellulaire : aperçu général

Dans le domaine des sciences de la vie, la culture cellulaire constitue l’une des méthodologies les plus importantes. Le terme « culture cellulaire » désigne le prélèvement de cellules, de tissus ou d’organes sur un animal ou une plante, puis leur implantation dans un environnement artificiel propice à leur survie et/ou à leur croissance. Les conditions environnementales fondamentales pour un développement cellulaire optimal sont une température contrôlée, un substrat permettant l’adhérence des cellules, un milieu de culture adéquat et un incubateur maintenant un pH et une osmolalité optimaux. Les cellules doivent bénéficier de ces conditions pour se développer pleinement.

Le choix d’un milieu de croissance adapté à la culture in vitro constitue l’étape à la fois la plus critique et la plus essentielle de la culture cellulaire. Un milieu de croissance, également appelé milieu de culture, est un liquide ou un gel formulé pour favoriser le développement d’organismes à l’échelle microscopique, cellulaire ou végétale. Le milieu utilisé pour la culture cellulaire contient souvent un apport suffisant en énergie et en substances régulant le cycle cellulaire. Les principaux composants d’un milieu de culture sont les acides aminés, les vitamines, les sels inorganiques, le glucose et le sérum. Le sérum est ajouté au milieu car il sert de source de facteurs de croissance, d’hormones et de facteurs d’adhésion. Outre l’apport de nutriments, le milieu contribue également au maintien des niveaux de pH et d’osmolalité.

Types de milieux utilisés en culture cellulaire

Les cellules humaines et animales peuvent être cultivées soit dans un milieu artificiel ou synthétique, soit dans un milieu entièrement naturel enrichi d’éléments naturels. Nous vous présentons ci-après un aperçu des différents types de milieux actuellement disponibles.

Milieux naturels

Les milieux naturels ne contiennent que des fluides biologiques présents à l’état naturel. Ils sont très utiles et faciles à utiliser pour la culture d’une grande variété de types de cellules animales. Le manque de connaissances sur la composition exacte des milieux naturels est le principal facteur contribuant à la faible reproductibilité des résultats obtenus avec ces derniers.

Milieux artificiels

La préparation de milieux artificiels ou synthétiques implique l’ajout de nutriments (organiques et inorganiques), de protéines sériques, de glucides, de cofacteurs, de vitamines et de sels, ainsi que de phases gazeuses d’O₂ et de CO₂ [1].

Divers types de milieux artificiels ont été mis au point afin de remplir une ou plusieurs des fonctions suivantes : 1) Survie immédiate (une solution saline équilibrée présentant un pH et une pression osmotique précis). 2) Survie prolongée (une solution saline équilibrée enrichie de différentes formulations de composés organiques et/ou de sérum). 3) Développement indéfini. 4) Fonctions spécialisées.

Il existe quatre classifications distinctes pour les milieux artificiels :

Milieux contenant du sérum

Le type de complément le plus fréquemment utilisé dans les milieux destinés à la culture de cellules animales est le sérum fœtal bovin. Il est ajouté au milieu de culture en tant que complément peu coûteux afin d’obtenir les meilleures conditions de croissance possibles. Outre son rôle de transporteur ou de chélateur pour les nutriments instables ou insolubles dans l’eau, les hormones et les facteurs de croissance, les inhibiteurs de protéases et d’autres substances, le sérum se lie également aux molécules nocives et les neutralise.

Milieux sans sérum

La présence de sérum dans les milieux de culture présente un certain nombre d’inconvénients et peut entraîner des erreurs d’interprétation majeures dans la recherche immunologique [2, 3]. Divers milieux sans sérum ont été mis au point [4, 5]. Ces milieux sont généralement formulés spécifiquement pour permettre la culture d’un seul type de cellule, comme le Knockout Serum Replacement et le Knockout DMEM de Thermo Fisher Scientific, ainsi que le milieu mTESR de Stem Cell Technologies [6], destinés aux cellules souches [7].

De plus, ces milieux intègrent des quantités définies de facteurs de croissance purifiés, de lipoprotéines et d’autres protéines, qui sont habituellement fournies par le sérum [8]. Ces milieux sont souvent qualifiés de « milieux de culture définis », car les composants qui les constituent sont bien connus.

Milieux chimiquement définis

Ces milieux contiennent des composants inorganiques et organiques ultra-purs qui n’ont subi aucune forme de contamination. Ils peuvent également comporter des ajouts de protéines pures, telles que des facteurs de croissance.

 La modification génétique de bactéries ou de levures, associée à l’ajout d’acides gras spécifiques, de vitamines, de cholestérol et d’acides aminés, permet d’obtenir leurs composants [9].

Milieux sans protéines

Les milieux sans protéines sont ceux qui ne contiennent absolument aucune protéine et ne comprennent que des éléments non protéiques. Par rapport aux milieux enrichis en sérum, l’utilisation de milieux sans protéines favorise une plus grande prolifération cellulaire et une meilleure expression protéique, et facilite la purification de tout produit généré lors d’un processus en aval [10-12]. Les formulations telles que le MEM et le RPMI-1640 ne contiennent pas de protéines. Toutefois, un supplément protéique peut être ajouté si nécessaire.

Les milieux de culture et leurs composants de base

Les milieux de culture commerciaux sont disponibles sous forme de poudre ou de liquide et contiennent souvent divers nutriments tels que des acides aminés, du glucose, des sels, des vitamines et d’autres compléments alimentaires. 

Les besoins en ces composants varient selon chaque lignée cellulaire, et ces variations expliquent la grande diversité des formulations de milieux de culture. Chaque composant remplit une fonction spécifique, qui sera décrite dans les paragraphes suivants :

Systèmes tampons

Pour maintenir des conditions de croissance optimales, le pH doit être contrôlé, ce qui est souvent réalisé à l’aide de l’un des deux systèmes tampons suivants :

Système tampon naturel

Le rapport CO₂/H₂CO₃ dans l’atmosphère est identique à celui du milieu, ce qui crée un mécanisme tampon naturel. Afin de préserver ce mécanisme tampon naturel, les cultures doivent être maintenues dans un environnement contenant 5 à 10 % de CO₂, ce qui est souvent obtenu à l’aide d’un incubateur à CO₂. L’un des principaux avantages de l’utilisation d’un tampon naturel réside dans son faible coût et sa sécurité.

HEPES

La tamponnage chimique utilisant le zwitterion HEPES présente une plus grande capacité tampon dans la plage de pH comprise entre 7,2 et 7,4 et ne nécessite pas d’environnement gazeux régulé. Pour certains types de cellules, une dose trop importante d’HEPES peut s’avérer nocive. Les milieux contenant de l’HEPES sont par ailleurs beaucoup plus sensibles aux effets phototoxiques de la lumière fluorescente [13].

Rouge de phénol

L’indicateur de pH « rouge de phénol » est souvent inclus dans les milieux de culture disponibles dans le commerce, ce qui permet une surveillance continue du pH. À mesure que les cellules se multiplient, les métabolites qu’elles produisent entraînent une variation du pH et, par conséquent, un changement de couleur du milieu. Le rouge de phénol a un double effet sur la couleur du milieu : il le fait virer au jaune à un pH acide et au violet à un pH alcalin. Un pH de 7,4, valeur optimale pour la culture cellulaire, donne au milieu une couleur rouge fluorescente.

Mais le rouge de phénol présente quelques inconvénients : tout d’abord, il est capable de mimer l’action d’un certain nombre d’hormones stéroïdiennes, principalement les œstrogènes [14]. Par conséquent, lors de l’étude de cellules sensibles aux œstrogènes, comme les tissus mammaires, il est recommandé d’utiliser un milieu exempt de rouge de phénol. L’équilibre sodium-potassium est perturbé par la présence de rouge de phénol dans plusieurs formulations sans sérum. L’ajout de sérum ou d’hormone hypophysaire bovine au milieu peut contrebalancer cet effet [15]. Troisièmement, la détection lors d’expériences de cytométrie en flux est entravée par la présence de rouge de phénol.

Sels inorganiques

Les milieux contenant des sels inorganiques, tels que les ions sodium, potassium et calcium, contribuent à maintenir l’équilibre osmotique et à réguler le potentiel membranaire.

Acides aminés

Les acides aminés étant les composants fondamentaux des protéines, ils constituent un élément essentiel de tous les milieux de culture cellulaire jamais conçus. Les cellules étant incapables de produire certaines acides aminés par elles-mêmes, il est important que le milieu de culture contienne des acides aminés essentiels. Ils sont indispensables à la prolifération cellulaire, et leur concentration détermine la densité cellulaire maximale pouvant être atteinte. La L-glutamine, un acide aminé essentiel, revêt notamment une importance particulière.

La L-glutamine sert de source d’énergie secondaire pour le métabolisme et apporte de l’azote nécessaire à la production de NAD, de NADPH et de nucléotides. La L-glutamine étant un acide aminé instable qui, avec le temps, se transforme en une forme que les cellules ne peuvent pas utiliser, elle doit être ajoutée au milieu de culture.

De plus, des acides aminés non essentiels peuvent être ajoutés au milieu de culture afin de reconstituer les réserves de ceux qui ont été consommés au cours du processus de croissance. La croissance des cellules est stimulée et leur viabilité est améliorée lorsque le milieu de culture est enrichi en acides aminés non essentiels.

Glucides

Les glucides, sous forme de sucres, constituent la principale source d’énergie. De nombreux milieux contiennent également du maltose et du fructose, en plus des sucres plus courants que sont le glucose et le galactose.

Protéines et peptides

L’albumine, la transferrine et la fibronectine sont les protéines et peptides les plus couramment utilisés. Ils revêtent une importance particulière dans les milieux ne contenant pas de sérum. L’albumine, la transferrine, l’aprotinine, la fétuine et la fibronectine font partie des protéines que l’on peut trouver dans le sérum, qui constitue une source riche en protéines.

L’albumine est la principale protéine présente dans le sang ; sa fonction consiste à se lier à diverses substances – notamment l’eau, les sels, les acides gras libres, les hormones et les vitamines – et à les transporter entre les différents organes et cellules. La capacité de l’albumine à se lier à des substances chimiques en fait un candidat efficace pour éliminer les composés nocifs du milieu dans lequel les cellules sont cultivées.

L’aprotinine est un agent protecteur dans les systèmes de culture cellulaire, car elle est stable à pH neutre et acide, et résiste aux températures élevées ainsi qu’à la dégradation pouvant être causée par les enzymes protéolytiques. Elle est capable d’inhiber un certain nombre de protéases à sérine, dont la trypsine, entre autres.

La fétuine est une glycoprotéine que l’on peut détecter en quantités plus importantes dans le sérum des fœtus et des nouveau-nés que dans celui des adultes. De plus, elle agit comme un inhibiteur des protéases à sérine. La fibronectine est une protéine qui joue un rôle essentiel dans le processus d’adhésion cellulaire. La transferrine est une protéine qui transporte le fer et qui est chargée de l'acheminer vers les membranes cellulaires.

Acides gras et lipides

Ils jouent un rôle crucial dans les milieux sans sérum, en l'absence de sérum.

Vitamines

De nombreuses vitamines sont nécessaires au développement et à la prolifération cellulaires. Les cellules ne peuvent pas produire de vitamines en quantités suffisantes ; celles-ci sont donc indispensables en culture tissulaire sous forme de compléments alimentaires.

En culture cellulaire, le sérum est la principale source de vitamines ; cependant, les milieux sont également enrichis en diverses vitamines afin de les adapter à un type cellulaire spécifique. Le plus souvent, les vitamines du groupe B sont utilisées pour stimuler la croissance.

Oligo-éléments

Les éléments chimiques tels que le cuivre, le zinc, le sélénium et les intermédiaires de la voie des acides tricarboxyliques sont appelés oligo-éléments. Les oligo-éléments sont souvent ajoutés aux milieux ne contenant pas de sérum afin de remplacer ceux qui sont généralement présents dans le sérum. Ces éléments sont des composants chimiques importants, indispensables au bon développement cellulaire. De nombreuses réactions biochimiques dépendent de certains micronutriments, comme l’activité enzymatique.

Compléments de milieu

Le milieu de croissance complet recommandé pour certaines lignées cellulaires nécessite des composants supplémentaires qui sont absents des milieux de base et du sérum. Ces compléments alimentaires favorisent la croissance cellulaire et un bon fonctionnement métabolique.

Bien que les hormones, les facteurs de croissance et les molécules de signalisation soient essentiels à la prolifération adéquate de certaines lignées cellulaires, les précautions suivantes doivent toujours être prises : l’ajout de compléments pouvant modifier l’osmolalité du milieu de culture complet, ce qui peut inhiber le développement cellulaire, il est toujours conseillé de vérifier l’osmolalité après l’ajout des compléments. Pour la plupart des lignées cellulaires, l’osmolalité optimale se situe entre 260 et 320 mOSM/kg.

Antibiotiques

Les antibiotiques sont souvent utilisés pour inhiber le développement de contaminants bactériens et fongiques [16], bien qu’ils ne soient pas indispensables à la croissance cellulaire. Étant donné que les antibiotiques peuvent masquer une contamination par des mycoplasmes et des bactéries résistantes, leur utilisation systématique n’est pas recommandée pour la culture cellulaire [17, 18].

De plus, les antibiotiques peuvent perturber le métabolisme des cellules hypersensibles. Les associations pénicilline-streptomycine fabriquées par MilliporeSigma et Life Technologies sont couramment utilisées. La plasmocine a été utilisée dans la culture des lignées cellulaires de gliome TS603, TS516 et BT260 [19], et s’est révélée efficace pour éliminer la contamination par les mycoplasmes (20).

Sérum

Le sérum contient des albumines, des facteurs de croissance et des inhibiteurs de croissance. Le sérum est l’un des composants les plus importants du milieu de culture cellulaire, car il apporte des acides aminés, des protéines, des vitamines (en particulier les vitamines liposolubles telles que A, D, E et K), des glucides, des lipides, des hormones, des facteurs de croissance, des minéraux et des oligo-éléments.

Le sérum d’origine fœtale et de veau est souvent utilisé pour favoriser le développement des cellules en culture. Le sérum fœtal est une source abondante de facteurs de croissance et convient au clonage cellulaire ainsi qu’au développement de cellules sensibles. En raison de ses capacités réduites à favoriser la croissance, le sérum de veau est utilisé dans les expériences d’inhibition par contact. Les milieux de culture normaux contiennent souvent entre 2 % et 10 % de sérum. L’ajout de sérum au milieu de culture répond aux objectifs suivants [21] :

• Le sérum apporte les nutriments essentiels aux cellules (à la fois en solution et liés à des protéines).

• Le sérum contient plusieurs facteurs de croissance et hormones impliqués dans la stimulation de la croissance et l’activité cellulaire spécialisée.

• Il fournit de nombreuses protéines de liaison, telles que l’albumine et la transferrine, qui transportent d’autres substances chimiques à l’intérieur de la cellule. Par exemple, l’albumine achemine les lipides, les vitamines, les hormones, etc. vers les cellules.

• Il fournit également des protéines, telles que la fibronectine, qui renforcent l’adhésion des cellules au substrat. De plus, il produit des éléments favorisant l’étalement qui contribuent à l’expansion cellulaire avant la division.

• Il fournit des inhibiteurs de protéases qui empêchent la protéolyse dans les cellules.

• Il contient également des minéraux tels que Na+, K+, Zn2+ et Fe2+.

• Il augmente la viscosité du milieu, protégeant ainsi les cellules des lésions mécaniques lors de l’agitation en culture en suspension.

• Elle fait également office de tampon.

Références

[1] Morgan J, Morton H, Parker R. Nutrition des cellules animales en culture tissulaire ; études préliminaires sur un milieu synthétique. Proc Soc Exp Biol Med. 1950 ; 73 : 1-8

[2] Kerbel R, Blakeslee D. Adsorption rapide d’un composant du sérum fœtal de veau par des cellules mammifères en culture. Une source potentielle d’artefacts dans les études sur les antisérums dirigés contre des antigènes spécifiques aux cellules. Immunology. 1976 ; 31 : 881-91

[3] Sula K, Draber P, Nouza K. L’ajout de sérum au milieu utilisé pour la préparation de suspensions cellulaires comme source possible d’artefacts dans les réactions à médiation cellulaire étudiées au moyen du test du ganglion lymphatique poplité. J Immunogenet. 1980 ; 7 : 483-9

[4] Mariani E, Mariani A, Monaco M, Lalli E, Vitale M, Facchini A. Milieux commerciaux sans sérum : croissance des hybridomes et production d’anticorps monoclonaux. J Immunol Methods. 1991 ; 145 : 175-83

[5] Barnes D, Sato G. Méthodes de culture cellulaire en milieu sans sérum. Anal Biochem. 1980 ; 102 : 255-70

[6] Yu H, Lu S, Gasior K, Singh D, Vazquez Sanchez S, Tapia O, et al. Les chaperons HSP70 acheminent la protéine TDP-43, exempte d’ARN, vers des coques sphériques liquides intranucléaires anisotropes. Science. 2021 ; 371 :

[7] Meharena H, Marco A, Dileep V, Lockshin E, Akatsu G, Mullahoo J, et al. La sénescence induite par le syndrome de Down perturbe l’architecture nucléaire des progéniteurs neuronaux. Cell Stem Cell. 2022 ; 29 : 116-130.e7

[8] Iscove N, Melchers F. Remplacement complet du sérum par de l’albumine, de la transferrine et des lipides de soja dans des cultures de lymphocytes B réactifs aux lipopolysaccharides. J Exp Med. 1978 ; 147 : 923-33

[9] Stoll T, Muhlethaler K, von Stockar U, Marison I. Amélioration systématique d’un milieu chimiquement défini et exempt de protéines pour la croissance d’hybridomes et la production d’anticorps monoclonaux. J Biotechnol. 1996 ; 45 : 111-23

[10] Darfler F. Un milieu sans protéines pour la croissance des hybridomes et d’autres cellules du système immunitaire. In Vitro Cell Dev Biol. 1990 ; 26 : 769-78

[11] Barnes D, Sato G. Culture cellulaire sans sérum : une approche unificatrice. Cell. 1980 ; 22 : 649-55

[12] Hamilton W, Ham R. Croissance clonale de lignées cellulaires de hamster chinois dans des milieux sans protéines. In Vitro. 1977 ; 13 : 537-47

[13] Zigler J, Lepe Zuniga J, Vistica B, Gery I. Analyse des effets cytotoxiques d’un milieu de culture contenant de l’HEPES exposé à la lumière. In Vitro Cell Dev Biol. 1985 ; 21 : 282-7

[14] Berthois Y, Katzenellenbogen J, Katzenellenbogen B. Le rouge de phénol présent dans les milieux de culture tissulaire est un œstrogène faible : implications pour l’étude des cellules sensibles aux œstrogènes en culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986 ; 83 : 2496-500

[15] Karmiol S. Développement de milieux sans sérum. Dans : Master JRW, éd. Culture de cellules animales, 3e éd. Oxford : Oxford University Press ; 2000.

[16] Perlman D. Utilisation d’antibiotiques dans les milieux de culture cellulaire. Methods Enzymol. 1979 ; 58 : 110-6

[17] McGarrity G. Propagation et contrôle de l’infection mycoplasmique des cultures cellulaires. In Vitro. 1976 ; 12 : 643-8

[18] Masters J, Stacey G. Remplacement du milieu et repiquage des lignées cellulaires. Nat Protoc. 2007 ; 2 : 2276-84

[19] Chakraborty A, Laukka T, Myllykoski M, Ringel A, Booker M, Tolstorukov M, et al. L’histone déméthylase KDM6A détecte directement l’oxygène pour réguler la chromatine et le destin cellulaire. Science. 2019 ; 363 : 1217-1222

[20] Molla Kazemiha V, Azari S, Amanzadeh A, Bonakdar S, Shojaei Moghadam M, Habibi Anbouhi M, et al. Efficacité du Plasmocin™ sur diverses lignées cellulaires de mammifères infectées par des mollicutes, comparée à celle des antibiotiques couramment utilisés en culture cellulaire : une expérience locale. Cytotechnology. 2011 ; 63 : 609-20

[21] Kragh Hansen U. Aspects moléculaires de la liaison des ligands à l’albumine sérique. Pharmacol Rev. 1981 ; 33 : 17-53