Gojilna sredstva za celice: pregled

Na področju življenjskih znanosti je ena najpomembnejših metodologij celična kultura. Izraz »celična kultura« pomeni odvzem celic, tkiv ali organov iz živali ali rastline in njihovo naknadno vsaditev v umetno okolje, ki je ugodno za njihovo preživetje in/ali rast. Osnovne okoljske potrebe za optimalni razvoj celic so nadzorovana temperatura, substrat za pritrditev celic, ustrezen gojišče in inkubator, ki vzdržuje optimalno vrednost pH in osmolalnost. Celice morajo imeti te pogoje, da lahko zrastejo do svojega polnega potenciala.

Izbira ustreznega gojišča za gojenje in vitro je tista faza v celični kulturi, ki je hkrati najbolj kritična in najbolj pomembna. Rastno gojišče, znano tudi kot gojišče, je tekočina ali gel, zasnovan za spodbujanje razvoja organizmov na mikroskopski, celični ali rastlinski ravni. Gojišče, ki se uporablja za gojenje celic, pogosto vsebuje zadostno količino energije in snovi, ki uravnavajo celični cikel. Glavne sestavine gojišča so aminokisline, vitamini, anorganske soli, glukoza in serum. Serum se doda gojišču, ker deluje kot vir rastnih faktorjev, hormonov in faktorjev za pritrditev. Poleg zagotavljanja hranilnih snovi gojišče prispeva tudi k ohranjanju ravni pH in osmolalnosti.

Vrste gojišč, ki se uporabljajo v celični kulturi

Tako človeške kot živalske celice je mogoče gojiti v umetnem ali sintetičnem gojišču ali v povsem naravnem gojišču, ki je dopolnjeno z naravnimi elementi. V nadaljevanju vam bomo podali pregled različnih vrst gojišč, ki so trenutno na voljo.

Naravna gojišča

V naravnih gojiščih se nahajajo le biološke tekočine, ki obstajajo v naravnem stanju. Naravna gojišča so zelo koristna in enostavna za gojenje široke palete živalskih celic. Pomanjkanje razumevanja natančnih sestavin, iz katerih so sestavljena naravna gojišča, je glavni dejavnik, ki prispeva k nizki ponovljivosti rezultatov, pridobljenih z uporabo naravnih gojišč.

Umetna gojišča

Priprava umetnih ali sintetičnih gojišč vključuje dodajanje hranil (tako organskih kot anorganskih), serumskih beljakovin, ogljikovih hidratov, kofaktorjev, vitaminov in soli ter plinskih faz O₂ in CO₂ [1].

Razvite so bile različne vrste umetnih gojišč, da bi izpolnile eno ali več naslednjih funkcij: 1) Takojšnje preživetje (uravnotežena solna raztopina z natančno vrednostjo pH in osmotskim tlakom). 2) Podaljšano preživetje (uravnotežena solna raztopina, dopolnjena z različnimi formulacijami organskih kemikalij in/ali seruma). 3) Neomejen razvoj. 4) Specializirane funkcije.

Obstajajo štiri različne klasifikacije umetnih gojišč:

Gojilna sredstva, ki vsebujejo serum

Najpogostejša vrsta dodatka v gojiščih za gojenje živalskih celic je goveji fetalni serum. V gojišče se dodaja kot cenovno ugoden dodatek, da se dosežejo najboljši možni pogoji za rast. Poleg tega, da deluje kot prenašalec ali kelator za hranilne snovi, ki so nestabilne ali netopne v vodi, hormone in rastne faktorje, zaviralce proteaz ter druge snovi, serum tudi veže in nevtralizira škodljive molekule.

Gojilna podlaga brez seruma

Prisotnost seruma v gojiščih ima številne slabosti in lahko povzroči resne napake pri interpretaciji rezultatov v imunoloških raziskavah [2, 3]. Razviti so bili različni gojišča brez seruma [4, 5]. Ta gojišča so na splošno posebej zasnovana za podporo gojenja enega samega tipa celic, kot sta na primer Knockout Serum Replacement in Knockout DMEM podjetja Thermo Fisher Scientific ter gojišče mTESR podjetja Stem Cell Technologies [6] za izvorne celice [7].

Poleg tega ta gojišča vsebujejo določene količine prečiščenih rastnih faktorjev, lipoproteinov in drugih beljakovin, ki jih sicer običajno zagotavlja serum [8]. Ta gojišča se pogosto imenujejo »definirana gojišča«, saj so sestavine, iz katerih so sestavljena, dobro razumljive.

Kemično opredeljena gojišča

Ta gojišča vsebujejo ultračiste anorganske in organske sestavine, ki niso bile onesnažene z nobeno vrsto kontaminacije. Lahko vsebujejo tudi dodatke čistih beljakovin, kot so rastni faktorji.

 Genska modifikacija bakterij ali kvasovk skupaj z dodajanjem določenih maščobnih kislin, vitaminov, holesterola in aminokislin omogoča proizvodnjo njihovih sestavnih delov [9].

Gojilna podlaga brez beljakovin

Gojilna sredstva brez beljakovin so tista, ki sploh ne vsebujejo beljakovin, temveč le nebeljakovinske sestavine. V primerjavi z gojilnimi sredstvi z dodanim serumom uporaba gojilnih sredstev brez dodanih beljakovin spodbuja večjo celično proliferacijo in izražanje beljakovin ter olajša čiščenje katerega koli proizvoda, nastalega v nadaljnjem procesu [10–12]. Beljakovine niso vključene v formulacije, kot sta MEM in RPMI-1640. Vendar se lahko po potrebi doda beljakovinski dodatek.

Kulturni mediji in njihove osnovne sestavine

Komercialna gojišča so na voljo v obliki prahu ali tekočine in pogosto vsebujejo različne hranilne snovi, kot so aminokisline, glukoza, soli, vitamini in druga prehranska dopolnila. 

Potrebe po teh sestavinah se razlikujejo za vsako celično linijo, te razlike pa so razlog za veliko število različnih formulacij gojišč. Vsaka sestavina ima določeno funkcijo, ki bo opisana v naslednjih odstavkih:

Puferski sistemi

Za ohranjanje optimalnih pogojev rasti je treba nadzorovati pH, kar se pogosto izvaja z enim od dveh pufrskih sistemov:

Naravni pufrski sistem

Razmerje CO₂/H₂CO₃ v atmosferi je enako razmerju v gojišču, kar ustvarja naravni pufrski mehanizem. Da bi ohranili svoj naravni pufrski mehanizem, je treba kulture gojiti v zračnem okolju z 5–10 % CO₂, kar se pogosto doseže z uporabo inkubatorja s CO₂. Ena od največjih prednosti uporabe naravnega pufra je njegova cenovna dostopnost in varnost.

HEPES

Kemično pufriranje z uporabo zwitteriona HEPES ima večjo pufrsko sposobnost v območju pH 7,2–7,4 in ne potrebuje reguliranega plinskega okolja. Za določene vrste celic je lahko večji odmerek HEPES škodljiv. Gojilna sredstva, ki vsebujejo HEPES, so prav tako veliko bolj občutljiva na fototoksične učinke fluorescenčne svetlobe [13].

Fenol rdeča

Indikator pH fenol rdeča je pogosto vključen v komercialno dostopna gojišča, kar omogoča neprekinjeno spremljanje pH. Med razmnoževanjem celic presnovki, ki jih te celice proizvajajo, povzročijo spremembo pH in s tem tudi spremembo barve gojišča. Fenol rdeča ima dvojni učinek na barvo gojišča: pri kislem pH se obarva rumeno, pri alkalnem pH pa vijolično. Pri pH 7,4, ki je optimalna vrednost za celično kulturo, se gojišče obarva fluorescenčno rdeče.

Vendar ima fenol rdeča nekaj pomanjkljivosti: prvič, fenol rdeča lahko posnema delovanje številnih steroidnih hormonov, predvsem estrogena [14]. Zato se pri preučevanju celic, občutljivih na estrogen, kot je tkivo dojke, priporoča gojišče brez fenol rdeče. Prisotnost fenol rdeče v nekaterih formulacijah brez seruma moti ravnovesje natrija in kalija. Dodajanje seruma ali govejega hipofiznega hormona v gojišča lahko nevtralizira ta učinek [15]. Tretjič, prisotnost fenol rdeče ovira detekcijo v eksperimentih s pretočno citometrijo.

Anorganske soli

Gojilna sredstva, ki vsebujejo anorganske soli, kot so natrijevi, kalijevi in kalcijevi ioni, pomagajo ohranjati osmoško ravnovesje in uravnavajo membranski potencial.

Aminokisline

Ker so aminokisline osnovne sestavine beljakovin, so bistvena sestavina vsakega gojišča za celice, ki je bilo kdaj koli zasnovano. Ker celice same ne morejo proizvajati nekaterih aminokislin, je pomembno, da gojišče vsebuje esencialne aminokisline. So potrebne za proliferacijo celic, njihova koncentracija pa določa največjo gostoto celic, ki jo je mogoče doseči. Zlasti pomembna je esencialna aminokislina L-glutamin.

L-glutamin deluje kot sekundarni vir energije za presnovo in prispeva dušik k proizvodnji NAD, NADPH in nukleotidov. Ker je L-glutamin nestabilna aminokislina, ki se s časom spremeni v obliko, ki je za celice neuporabna, jo je treba dodati gojišču.

Poleg tega se v gojišče lahko dodajo neesencialne aminokisline, da se nadomestijo tiste, ki so bile porabljene med rastnim procesom. Rast celic se pospeši in njihova vitalnost se poveča, če se gojišče dopolni z neesencialnimi aminokislinami.

Ogljikovi hidrati

Ogljikovi hidrati v obliki sladkorjev so glavni vir energije. Mnoga gojišča poleg bolj običajnih sladkorjev, kot sta glukoza in galaktoza, vsebujejo tudi maltozo in fruktozo.

Beljakovine in peptidi

Albumin, transferin in fibronektin so najpogosteje uporabljene beljakovine in peptidi. Zlasti so pomembni v gojiščih, ki ne vsebujejo seruma. Albumin, transferin, aprotinin, fetuin in fibronektin so nekatere beljakovine, ki jih lahko najdemo v serumu, ki je bogat vir beljakovin.

Albumin je glavna beljakovina v krvi, njegova naloga pa je vezanje in prenos različnih snovi, vključno z vodo, solmi, prostimi maščobnimi kislinami, hormoni in vitamini, med različnimi organi in celicami. Zmožnost albumina, da se veže na kemikalije, ga naredi za učinkovitega kandidata za odstranjevanje škodljivih spojin iz gojišča, v katerem se gojijo celice.

Aprotinin je zaščitno sredstvo v sistemih celičnih kultur, saj je stabilen pri nevtralnem in kislim pH ter odporen na visoke temperature in razgradnjo, ki jo lahko povzročajo proteolitični encimi. Zmožen je zavirati številne serinske proteaze, med drugim tudi tripsin.

Fetuin je glikoprotein, ki ga je mogoče v večjih količinah zaznati v serumu plodov in novorojenčkov v primerjavi s serumom odraslih živali. Poleg tega deluje kot zaviralec serinskih proteaz. Beljakovina fibronektin je bistvena sestavina v procesu celične adhezije. Transferin je beljakovina, ki prenaša železo in je odgovorna za dostavo železa do celičnih membran.

Maščobne kisline in lipidi

Imajo ključno vlogo v brezserumskem gojišču, kadar seruma ni.

Vitamini

Za razvoj in proliferacijo celic so potrebni številni vitamini. Celice ne morejo proizvesti zadostnih količin vitaminov, zato so ti v tkivnih kulturah nujni kot prehranska dopolnila.

V celični kulturi je serum glavni vir vitaminov; vendar se gojišča obogatijo tudi z različnimi vitamini, da so primerna za določen tip celic. Najpogosteje se za spodbujanje rasti uporabljajo vitamini skupine B.

Sledni elementi

Kemični elementi, kot so baker, cink, selen in vmesni produkti trikarboksilne kisline, so znani kot oligoelementi. Oligoelementi se pogosto dodajajo gojiščem, ki ne vsebujejo seruma, da bi nadomestili tiste, ki so običajno prisotni v serumu. Ti elementi so pomembne kemične sestavine, potrebne za zdrav razvoj celic. Mnoge biokemične reakcije so odvisne od določenih mikrohranil, na primer encimska aktivnost.

Dodatki k gojišču

Celotno gojišče, priporočeno za določene celične linije, potrebuje dodatne sestavine, ki jih v osnovnem gojišču in serumu ni. Ti dodatki podpirajo rast celic in ustrezno presnovno delovanje.

Čeprav so hormoni, rastni faktorji in signalne molekule bistveni za ustrezno proliferacijo določenih celičnih linij, je treba vedno upoštevati naslednje previdnostne ukrepe: Ker lahko dodajanje dodatkov spremeni osmolalnost celotnega gojišča, kar lahko zavira razvoj celic, je vedno priporočljivo preveriti osmolalnost po dodajanju dodatkov. Za večino celičnih linij se optimalna osmolalnost giblje med 260 in 320 mOSM/kg.

Antibiotiki

Antibiotiki se pogosto uporabljajo za zaviranje razvoja bakterijskih in glivičnih onesnaževalcev [16], čeprav niso nujni za rast celic. Ker lahko antibiotiki prikrijejo okužbo z mikoplazmo in odpornimi bakterijami, se njihova rutinska uporaba v celičnih kulturah ne priporoča [17, 18].

Poleg tega lahko antibiotiki motijo presnovo preobčutljivih celic. Pogosto se uporabljajo kombinacije penicilina in streptomicina proizvajalcev MilliporeSigma in Life Technologies. Plasmocin se je uporabljal pri gojenju celičnih linij gliomov TS603, TS516 in BT260 [19], pri čemer se je izkazal za učinkovitega pri odstranjevanju okužbe z mikoplazmo (20).

Serum

V serumu so prisotni albumini, rastni faktorji in zaviralci rasti. Serum je ena najpomembnejših sestavin gojišča za celice, saj zagotavlja aminokisline, beljakovine, vitamine (zlasti maščobotopne vitamine, kot so A, D, E in K), ogljikove hidrate, lipide, hormone, rastne faktorje, minerale in oligoelemente.

Za spodbujanje razvoja gojenih celic se pogosto uporablja serum iz govejih plodov in telet. Plodni serum je bogat vir rastnih faktorjev in je primeren za kloniranje celic ter razvoj občutljivih celic. Zaradi zmanjšanih sposobnosti spodbujanja rasti se teletni serum uporablja v poskusih z zaviranjem stika. Običajna gojišča pogosto vsebujejo od 2 % do 10 % seruma. Dodajanje seruma v gojišče služi naslednjim namenom [21]:

• Serum zagotavlja celicam nujna hranila (tako v raztopini kot vezana na beljakovine).

• Serum vsebuje več rastnih faktorjev in hormonov, ki sodelujejo pri spodbujanju rasti in specializirani celični aktivnosti.

• Vsebuje veliko vezavnih beljakovin, kot sta albumin in transferin, ki v celico prenašajo druge kemikalije. Albumin na primer v celice prenaša maščobe, vitamine, hormone itd.

• Prav tako zagotavlja beljakovine, kot je fibronektin, ki povečujejo adhezijo celic na substrat. Poleg tega proizvaja elemente za širjenje, ki pomagajo pri širitvi celic pred delitvijo.

• Prinaša zaviralce proteaz, ki preprečujejo proteolizo v celicah.

• Vsebuje tudi minerale, kot so Na+, K+, Zn2+ in Fe2+.

• Poveča viskoznost gojišča, s čimer ščiti celice pred mehanskimi poškodbami med mešanjem suspenzijske kulture.

• Deluje tudi kot pufer.

Viri

[1] Morgan J, Morton H, Parker R. Prehrana živalskih celic v tkivni kulturi; začetne študije o sintetičnem gojišču. Proc Soc Exp Biol Med. 1950;73:1–8

[2] Kerbel R, Blakeslee D. Hitra adsorpcija sestavine fetalnega telečjega seruma s strani sesalskih celic v kulturi. Morebitni vir artefaktov v študijah antiserumov proti celično specifičnim antigenom. Immunology. 1976;31:881–91

[3] Sula K, Draber P, Nouza K. Dodajanje seruma v gojišče, uporabljeno za pripravo celičnih suspenzij, kot možen vir artefaktov v celično posredovanih reakcijah, preučevanih s testom poplitealnih limfnih vozlov. J Immunogenet. 1980;7:483–9

[4] Mariani E, Mariani A, Monaco M, Lalli E, Vitale M, Facchini A. Komercialna gojišča brez seruma: rast hibridomov in proizvodnja monoklonskih protiteles. J Immunol Methods. 1991;145:175–83

[5] Barnes D, Sato G. Metode za gojenje celic v gojišču brez seruma. Anal Biochem. 1980;102:255-70

[6] Yu H, Lu S, Gasior K, Singh D, Vazquez Sanchez S, Tapia O, in sod. HSP70 kot šaperon prevaža TDP-43 brez RNA v anizotropne intranuklearne tekoče sferične lupine. Science. 2021;371:

[7] Meharena H, Marco A, Dileep V, Lockshin E, Akatsu G, Mullahoo J, et al. Staranje, povzročeno z Downovim sindromom, moti jedrsko arhitekturo nevralnih progenitornih celic. Cell Stem Cell. 2022;29:116–130.e7

[8] Iscove N, Melchers F. Popolna zamenjava seruma z albuminom, transferinom in sojinimi lipidi v kulturah B-limfocitov, ki se odzivajo na lipopolisaharide. J Exp Med. 1978;147:923–33

[9] Stoll T, Muhlethaler K, von Stockar U, Marison I. Sistematično izboljševanje kemično opredeljenega gojišča brez beljakovin za rast hibridomov in proizvodnjo monoklonskih protiteles. J Biotechnol. 1996;45:111–23

[10] Darfler F. Gojišče brez beljakovin za rast hibridomov in drugih celic imunskega sistema. In Vitro Cell Dev Biol. 1990;26:769–78

[11] Barnes D, Sato G. Brezserumska celična kultura: poenoten pristop. Cell. 1980;22:649–55

[12] Hamilton W, Ham R. Klonska rast celičnih linij kitajskega hrčka v gojiščih brez beljakovin. In Vitro. 1977;13:537–47

[13] Zigler J, Lepe Zuniga J, Vistica B, Gery I. Analiza citotoksičnih učinkov gojišča, ki vsebuje HEPES in je bilo izpostavljeno svetlobi. In Vitro Cell Dev Biol. 1985;21:282–7

[14] Berthois Y, Katzenellenbogen J, Katzenellenbogen B. Fenol rdeča v gojiščih za tkivne kulture je šibek estrogen: posledice za raziskovanje celic, ki se odzivajo na estrogen, v kulturi. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:2496–500

[15] Karmiol S. Razvoj gojišč brez seruma. V: Master JRW, urednik. Animal Cell culture, 3. izdaja. Oxford: Oxford University Press; 2000.

[16] Perlman D. Uporaba antibiotikov v gojiščih za celične kulture. Methods Enzymol. 1979;58:110–6

[17] McGarrity G. Širjenje in obvladovanje mikoplazemske okužbe celičnih kultur. In Vitro. 1976;12:643–8

[18] Masters J, Stacey G. Menjava gojišča in pasiranje celičnih linij. Nat Protoc. 2007;2:2276–84

[19] Chakraborty A, Laukka T, Myllykoski M, Ringel A, Booker M, Tolstorukov M, et al. Histonska demetilaza KDM6A neposredno zazna kisik za nadzor kromatina in usode celic. Science. 2019;363:1217–1222

[20] Molla Kazemiha V, Azari S, Amanzadeh A, Bonakdar S, Shojaei Moghadam M, Habibi Anbouhi M, et al. Učinkovitost zdravila Plasmocin™ na različnih linijah sesalskih celic, okuženih z molikuti, v primerjavi s pogosto uporabljanimi antibiotiki v celičnih kulturah: lokalne izkušnje. Cytotechnology. 2011;63:609–20

[21] Kragh Hansen U. Molekularni vidiki vezave liganda na serumski albumin. Pharmacol Rev. 1981;33:17–53