Introducción

El Células Bend.3 La línea —también conocida por los sinónimos bEND.3, b.End3, bEnd3, BEND-3, BEND3 y «células endoteliales derivadas del cerebro.3»— es una línea celular endotelial microvascular del cerebro de ratón transformada que se ha convertido en una de las herramientas in vitro más utilizadas en la biología neurovascular. La línea se estableció a partir de tejido de endotelioma cerebral murino tras su transformación con el antígeno T medio del virus del polioma, una manipulación que le confiere una capacidad proliferativa estable e indefinida, al tiempo que conserva las características endoteliales clave. Desde su caracterización a principios de la década de 1990, bEnd.3 ha servido como un sustituto accesible y reproducible para estudiar la barrera hematoencefálica (BHE), la isquemia cerebral, el accidente cerebrovascular, la lesión por reperfusión, la angiogénesis y, de manera más amplia, la biología de las células endoteliales. Su utilidad para modelar la alteración de la BHE en el contexto del accidente cerebrovascular isquémico, la enfermedad de Alzheimer y la lesión cerebral traumática lo ha convertido en una herramienta ampliamente adoptada tanto en la investigación básica como en la traslacional en neurociencia.

Puntos clave

• bEnd.3 es una línea celular de células endoteliales microvasculares del cerebro de ratón transformada, derivada de tejido cerebral de ratón BALB/c y transformada con el antígeno T medio del virus del polioma (número de acceso de Cellosaurus: CVCL_0170).
• Se utiliza ampliamente como modelo in vitro de la barrera hematoencefálica para estudiar el accidente cerebrovascular isquémico, la lesión por reperfusión, la enfermedad de Alzheimer y la neuroinflamación.
• Las células expresan marcadores clave asociados a la barrera hematoencefálica (BHE), entre ellos las proteínas de las uniones estrechas claudina-5, ocludina y ZO-1, así como eNOS y PECAM-1.
• Las células bEnd.3 expresan marcadores endoteliales linfáticos como LYVE-1 y VEGFR-3, lo que amplía su relevancia para la investigación en biología vascular.
• La línea celular tiene un tiempo de duplicación de 26 a 30 horas, lo que la hace ideal para trabajos experimentales a gran escala.
• La estanqueidad de la barrera es limitada: solo se alcanzó una resistencia eléctrica transendotelial máxima de aproximadamente 130 Ω·cm² en el cocultivo astroglial, y la línea distingue mal entre los marcadores de permeabilidad paracelular y transcelular.
• Se ha demostrado que las células bEnd.3 contribuyen al mantenimiento de las células madre pluripotentes humanas al actuar como células alimentadoras, lo que amplía sus aplicaciones en la biología de las células madre.

¿Qué es bEnd.3?

bEnd.3 se obtuvo a partir de tejido cerebral de un ratón BALB/c de 6 semanas de edad, de sexo no especificado (número de acceso de Cellosaurus: CVCL_0170). Las células de endotelioma originales se generaron mediante la transformación de células endoteliales murinas con el antígeno T medio (mT) del virus del polioma. Un estudio pionero de 1990 realizado por Montesano, Pepper y sus colegas demostró que las células de endotelioma que expresan mT presentan una actividad proteolítica notablemente aumentada —en particular, niveles elevados del activador del plasminógeno de tipo uroquinasa junto con una producción reducida del inhibidor del activador del plasminógeno — y forman grandes estructuras quísticas similares a hemangiomas dentro de los geles de fibrina, lo que explica la profunda alteración que el oncogén provoca en el desarrollo vascular normal [1]. Esta base mecánica ayudó a definir el fenotipo transformado que sustenta el comportamiento biológico y la utilidad de bEnd.3 en entornos experimentales.

Los estudios de caracterización posteriores han definido en detalle el perfil morfológico y molecular de la línea celular. Omidi y sus colegas informaron que las células bEnd.3 presentan una morfología escamosa distintiva en forma de huso en cultivo y expresan proteínas asociadas a vesículas, entre ellas clatrina, caveolina-1, flotilina y dinamina II, lo cual concuerda con un mecanismo activo de tráfico vesicular [2]. El mismo estudio confirmó la presencia de transcritos de los elementos de las uniones estrechas ZO-1, JAM, ocludina, claudina-1 y claudina-5, así como la captación funcional de glucosa mediada por GLUT-1 y el eflujo de la glicoproteína P. En cocultivo con astrocitos C6, las monocapas alcanzaron una resistencia eléctrica transendotelial máxima de aproximadamente 130 Ω·cm², aunque los autores también observaron que las células no discriminaban de manera significativa entre los marcadores de permeabilidad paracelular y transcelular. Yuen y sus colegas informaron posteriormente que las células bEnd.3 también expresan los marcadores endoteliales linfáticos LYVE-1 y VEGFR-3, así como los marcadores de progenitores Sca-1 y CD133, y forman tubos de tipo capilar tras la estimulación con TNF-alfa —un descubrimiento que amplió la importancia biológica de la línea celular más allá de la investigación vascular sanguínea clásica [3].

Ventajas de bEnd.3

Una de las ventajas más importantes de bEnd.3 es su accesibilidad y su facilidad de reproducción. A diferencia de las células endoteliales microvasculares cerebrales primarias, que requieren laboriosos procedimientos de aislamiento y presentan una capacidad limitada de pases, bEnd.3 es una línea inmortalizada que puede multiplicarse de manera confiable en distintos laboratorios. Con un tiempo de duplicación de 26 a 30 horas, las células son ideales para experimentos que requieren grandes cantidades de células uniformes. Su expresión estable de marcadores endoteliales —incluidas las proteínas de uniones estrechas claudina-5, ocludina, y ZO-1, así como eNOS y PECAM-1— las convierte en un sustituto práctico del endotelio microvascular cerebral en una amplia gama de condiciones experimentales, siempre y cuando se tomen en cuenta las advertencias sobre la función de barrera que se describen a continuación.

La versatilidad de bEnd.3 abarca múltiples disciplinas de investigación. Se han realizado estudios en los que se ha utilizado esta línea para modelar la alteración de la barrera hematoencefálica (BHE) durante el accidente cerebrovascular isquémico y la lesión por reperfusión, investigar la neuroinflamación desencadenada por moléculas de adhesión, analizar la expresión génica angiogénica y explorar la comunicación intercelular mediada por conexinas. Además, Joubin y sus colegas demostraron que las células bEnd.3 pueden mantener a las células madre pluripotentes humanas en un estado indiferenciado, funcionando como células alimentadoras que pueden ser modificadas genéticamente —una capacidad que no se reproduce fácilmente con cultivos primarios de vida corta— [4]. Esta amplia gama de aplicaciones pone de manifiesto la utilidad de la línea celular en los campos de la neurociencia, la biología vascular, la farmacología y la investigación con células madre.

Limitaciones de bEnd.3

A pesar de su uso generalizado, bEnd.3 presenta importantes limitaciones cuando se emplea como modelo de la barrera hematoencefálica (BHE). Omidi y sus colegas midieron una resistencia eléctrica transendotelial máxima de solo unos 130 Ω·cm², y ese valor requirió un cocultivo con astrocitos C6; lo que es aún más crítico, las monocapas mostraron poca distinción entre las sondas transcelulares y paracelulares, y los coeficientes de permeabilidad para el propranolol y la sacarosa difirieron solo marginalmente [2]. Los autores concluyeron que esta línea celular no es adecuada para evaluar la permeabilidad transendotelial, aunque sigue siendo valiosa para los estudios sobre los mecanismos de transporte de la barrera hematoencefálica. Por lo tanto, los datos de permeabilidad obtenidos en este sistema deben interpretarse con precaución y, cuando sea posible, complementarse con sistemas de cocultivo o con validación in vivo.

La organización de las uniones estrechas en sí misma es una debilidad relacionada. Song y Pachter compararon bEnd.3 con células endoteliales microvasculares cerebrales primarias de ratón recién purificadas y descubrieron que, mientras que las células primarias concentraban claudina-5, ocludina y ZO-1 a lo largo de las fronteras intercelulares y separaban la ocludina y la ZO-1 del armazón citosquelético resistente a los detergentes, las células bEnd.3 mostraban una localización citoplasmática difusa de la ocludina y la ZO-1 y retenían estas proteínas predominantemente en la fracción soluble [5]. Por lo tanto, la expresión de una proteína de unión estrecha en bEnd.3 no implica, por sí sola, un ensamblaje correcto de las uniones.

La transformación de bEnd.3, derivada de la expresión del oncogén mT, también podría generar artefactos fenotípicos que no están presentes en el endotelio cerebral normal. La actividad proteolítica elevada —una característica definitoria de las células de endotelioma que expresan mT— [1] — y la expresión de marcadores linfáticos como LYVE-1 y VEGFR-3 sugiere que la línea celular no reproduce completamente el endotelio vascular sanguíneo normal [3]. Además, en esta línea celular no se especifica el sexo de los donantes, lo que limita la aplicabilidad de los hallazgos a cuestiones de investigación estratificadas por sexo. Estas consideraciones no restan valor a la línea celular, pero sí resaltan la importancia de comprender su contexto biológico específico.

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Aplicaciones

Modelado de la barrera hematoencefálica y el accidente cerebrovascular isquémico

La aplicación más destacada de bEnd.3 es como modelo in vitro de la barrera hematoencefálica en condiciones isquémicas y posisquémicas. Koto y sus colegas demostraron que la hipoxia (1 % de O₂) alteraba la localización y el nivel de proteína de la claudina-5 en monocapas de bEnd.3, lo que provocaba una disminución medible de la resistencia eléctrica transendotelial, y confirmaron la correspondiente pérdida de claudina-5 en el endotelio microvascular de la retina in vivo [6]. Esto estableció un vínculo mecánico entre la remodelación de las uniones estrechas y la ruptura de la barrera durante la hipoxia neural, y posicionó a bEnd.3 como un sistema manejable para estudiar los eventos moleculares subyacentes al fallo de la BHE en el accidente cerebrovascular.

Un estudio frecuentemente citado de Kim y sus colegas utilizó esta línea celular como modelo in vitro de la BHE expuesta a privación de oxígeno y glucosa (OGD) para simular la isquemia. Dieciocho horas de OGD indujeron disfunción celular, aumento de la permeabilidad, degradación de la ocludina y activación de las vías de autofagia, observándose que la ocludina degradada se colocalizaba con los autofagosomas isquémicos; tanto la pérdida de ocludina como el cambio en la permeabilidad se redujeron notablemente con el inhibidor de la autofagia 3-metiladenina. Los mismos cambios moleculares y su reversión por la 3-metiladenina se reprodujeron posteriormente en los capilares cerebrales de ratas sometidas a oclusión de la arteria cerebral media [7]. Este trabajo estableció un marco mecánico que vincula el flujo autofágico con la pérdida de proteínas de las uniones estrechas y proporcionó importantes conocimientos traslacionales sobre la patología del accidente cerebrovascular.

Investigaciones complementarias demostraron que la agmatina atenúa la expresión de las metaloproteinasas de matriz 2 y 9 en las células endoteliales cerebrales —incluidas las bEnd.3 — sometidas a lesión por privación de oxígeno y glucosa (OGD) y reperfusión, en la que la regulación a la baja de la MMP-9 se produjo en paralelo a la regulación al alza de la eNOS y al mantenimiento de la liberación de óxido nítrico, lo que ofrece un posible mecanismo neuroprotector relevante para las lesiones cerebrales y la lesión por reperfusión [8]. Estudios sobre la apoptosis mediada por la Ang II demostraron además que el hiperosido protege a las células bEnd.3 y preserva la integridad de una monocapa de la barrera hematoencefálica (BHE) in vitro, actuando sobre JAM-A, claudina-5, ZO-1, caveolina-1 y Mfsd2a, lo que sugiere vías terapéuticas para la protección cerebrovascular [9]. Las investigaciones sobre la sobreexpresión de circLphn3 en células bEnd.3 también resaltaron el papel del ARN no codificante en el mantenimiento de la expresión de proteínas de uniones estrechas —incluidas ZO-1, ZO-2 y ocludina— tras una lesión cerebral traumática, actuando circLphn3 como una esponja molecular para el miR-185-5p [10].

Neuroinflamación, toxicología endotelial y enfermedad de Alzheimer

Las células bEnd.3 se han utilizado ampliamente para estudiar la señalización inflamatoria en el endotelio cerebrovascular. Jeong y sus colegas demostraron que el cadmio —un metal pesado omnipresente que se acumula fuera de la barrera hematoencefálica— estimulaba la expresión de ICAM-1 en las células bEnd.3 a través de la activación de NF-κB impulsada por la fosforilación de tirosina de IκBα, en lugar de su degradación, lo que proporcionó una base mecánica para la toxicidad cerebrovascular inducida por el cadmio [11]. De manera similar, Zhang y sus colegas informaron que la proteína C reactiva, en concentraciones de 1 a 75 mg/L, aumentaba la expresión de ICAM-1 y VCAM-1, así como la fuga de LDH en las células bEnd.3, lo que sugiere un papel directo de esta proteína de fase aguda en la lesión de la BHE durante el accidente cerebrovascular isquémico [12].

También se ha investigado la toxicidad endotelial inducida por plaguicidas en esta línea celular. Jung y sus colegas demostraron que el N-nitrosocarbofurano, el metabolito nitroso del pesticida carbamato carbofurano, indujo apoptosis en las células bEnd.3 a través de las vías de las quinasas MAP, desempeñando la vía ERK un papel predominante en la muerte celular [13]. Tsai y sus colegas examinaron la citotoxicidad inducida por la lisofosfatidilcolina en células bEnd.3; atribuyeron la muerte celular a la sobrecarga de calcio citosólico, la pérdida del potencial de membrana mitocondrial, la activación de p38 y la activación de la caspasa-3 —notablemente sin generación de especies reactivas de oxígeno— e identificaron a la heparina como un agente protector que actúa aguas abajo de p38 [14]. Trabajos más recientes sobre el tratamiento con florfenicol documentaron que la remodelación de la F-actina mediada por ROCK/cofilina contribuye a la reducción de la proliferación y la migración en las células endoteliales bEnd.3 [15].

En el ámbito de la investigación sobre la enfermedad de Alzheimer, las células bEnd.3 han servido como modelo para la alteración de la barrera hematoencefálica (BHE) mediada por el péptido beta-amiloide. Chan y sus colegas demostraron que las alteraciones de la autofagia inducidas por oligómeros de Aβ en las células bEnd.3 eran bloqueadas por el ARN pequeño interferente de RAGE, lo que vincula la señalización de RAGE a través del eje CaMKKβ/AMPK/mTOR con el daño dependiente de la autofagia de las proteínas del andamio de las uniones estrechas ZO-1, ocludina y claudina-5 [16]. Por otra parte, se demostró que los polifenoles de la semilla de lichí protegen la integridad de la BHE al inhibir la activación del inflamasoma NLRP3 inducida por Aβ(25–35) a través de la vía de autofagia mediada por AMPK/mTOR/ULK1 en células bEnd.3; estos resultados se corroboraron en ratones transgénicos APP/PS1 —un estudio que amplió el conocimiento sobre la interacción entre la autofagia y el inflamasoma en la interfaz neurovascular [17]. La fotobiomodulación se ha estudiado en el mismo contexto: Ma y sus colegas utilizaron células bEnd.3 estimuladas con LPS junto con ratones APP/PS1 para demostrar que el tratamiento con infrarrojo cercano mejora el metabolismo energético mitocondrial, regula al alza la ocludina, la claudina-5 y la ZO-1, y protege la integridad de la barrera de manera dependiente de la AMPK [18].

Angiogénesis y señalización vascular

Las células bEnd.3 han resultado ser muy informativas en estudios de señalización angiogénica. Yue y sus colegas emplearon un microarray de ADNc para perfilar la expresión génica angiogénica en células bEnd.3 tratadas con factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), identificando la regulación al alza de genes proangiogénicos como ADAMTS1, MMP-9, la angiopoyetina-1, el PDGF-B y el G-CSF; la regulación a la baja de genes antiangiogénicos como el TIMP-2 y el TSP-3; y la inducción de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) tanto a nivel de ARNm como de proteína [19]. Este enfoque de alto rendimiento estableció a bEnd.3 como una plataforma conveniente para el perfilado de la angiogénesis a escala genómica.

Las respuestas angiogénicas impulsadas por la hipoxia también se han mapeado utilizando células bEnd.3. Zhu y sus colegas demostraron que la hipoxia aumentaba la expresión del ARNm y de la proteína de la endoglina (CD105) en las células bEnd.3 mediante la activación de la p38 MAPK, y que los inhibidores de esta vía —así como la MKK3 dominante negativa— suprimían la inducción de la endoglina [20]. Dado que la endoglina presenta mutaciones en la telangiectasia hemorrágica hereditaria y se regula al alza durante la angiogénesis activa, estos hallazgos relacionaron la señalización de la MAPK sensible a la hipoxia con la remodelación vascular patológica. Li y sus colegas demostraron además que la hipoxia regula al alza la actividad de la CD73 (ecto-5'-nucleotidasa), el ARNm y la proteína en las células bEnd.3 de manera dependiente del tiempo, mientras que la reoxigenación revirtió inicialmente esta inducción antes de que el CD73 volviera a aumentar con la reoxigenación prolongada —lo que implica que la generación de adenosina actúa como mecanismo neuroprotector durante la isquemia-reperfusión [21].

La señalización de la angiopoyetina se ha estudiado a fondo utilizando bEnd.3 como sistema modelo. Shi y sus colegas establecieron un modelo de apoptosis sin suero en células bEnd.3 y demostraron que la angiopoyetina-1 inhibe la apoptosis de las células endoteliales microvasculares a través de un mecanismo que implica la disminución de Bax, el aumento de Bcl-2 y la reducción de la liberación de citocromo C de las mitocondrias al citoplasma [22]. Perry y sus colegas ampliaron la biología de la angiopoyetina a la investigación sobre los hemangiomas, demostrando la activación constitutiva del receptor Tie-2 en el hemangioma humano de la infancia y utilizando células bEnd.3 como un sistema modelo murino de hemangioma en el que la inhibición farmacológica de la producción de angiopoyetina-2 eliminó casi por completo el crecimiento tumoral in vivo [23].

eNOS, conexinas y función endotelial

La biología de la sintasa de óxido nítrico endotelial (eNOS) se ha caracterizado en las células bEnd.3 con considerable precisión. Govers y sus colegas utilizaron microscopía de inmunofluorescencia para demostrar que la localización de la eNOS en la membrana plasmática depende fundamentalmente del contacto célula-célula, con un fuerte enriquecimiento en los sitios de contacto intercelular que se asemeja al patrón de distribución de PECAM-1 más que al de la VE-cadherina o la plakoglobina, y con una actividad de la eNOS mayor en monocapas confluentes que en subconfluentes, a pesar de que la expresión se mantuvo sin cambios [24]. Este acoplamiento espacial entre la localización y la actividad de la eNOS destacó a las células bEnd.3 como un modelo en el que se puede investigar de manera significativa el contexto fisiológico del endotelio confluente.

Bevers y sus colegas investigaron el desacoplamiento de la eNOS en células bEnd.3, las cuales expresan eNOS en niveles superiores en más de dos órdenes de magnitud a los de una línea endotelial de comparación, al tiempo que carecen de iNOS y nNOS. Descubrieron que la suplementación con tetrahidrobiopterina (BH4) aumentaba la producción de NO y disminuía la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), mientras que la adición de L-arginina adicional aumentaba aún más los ROS inducidos por el VEGF —lo que indica que la deficiencia relativa de BH4, y no la disponibilidad de arginina, impulsa el desacoplamiento en este contexto [25]. Este resultado tiene relevancia directa para las complicaciones vasculares de afecciones como la hipertensión y la aterosclerosis, en las que la sobreexpresión sostenida de eNOS puede, paradójicamente, promover el estrés oxidativo.

También se ha examinado la comunicación a través de uniones comunicantes mediada por conexinas en células bEnd.3. Kwak y sus colegas compararon la expresión de conexinas y el acoplamiento célula a célula antes y después de una lesión mecánica en monocapas de bEnd.3, observando una regulación al alza de Cx43 y una regulación a la baja de Cx37 inducidas por la lesión en el sitio de la lesión, sin que Cx40 se viera afectada [26]. La transfección estable con inhibidores de conexina dominantes negativos prolongó el tiempo necesario para el cierre completo de la lesión en aproximadamente un 50 %, sin alterar la proliferación, la migración de células individuales ni la actividad proteolítica, lo que establece un papel específico de la comunicación a través de uniones comunicantes en la reparación coordinada de lesiones endoteliales.

Secreción de factores neurotróficos y aplicaciones con células madre

Las células bEnd.3 secretan factores neurotróficos que actúan sobre el microambiente neural circundante. Wang y sus colegas demostraron que las células bEnd.3 expresan y liberan el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), y que tanto la hipoxia sostenida como la intermitente estimulan la secreción de BDNF —siendo la hipoxia intermitente el estímulo más potente [27]. La liberación de BDNF inducida por la hipoxia se inhibió parcialmente con N-acetil-L-cisteína y con un mimético de la superóxido dismutasa, lo que implica la participación de las especies reactivas de oxígeno en la señalización neurotrófica impulsada por la hipoxia, y requirió la movilización de calcio de las reservas internas. Estos hallazgos establecieron que el endotelio microvascular cerebral participa activamente en la supervivencia neural, y no es simplemente una barrera pasiva.

Lo más llamativo es que Joubin y sus colegas demostraron que las células bEnd.3 mantienen a las células madre pluripotentes humanas en un estado indiferenciado, secretando una actividad soluble que imita el nicho que proporcionan los fibroblastos embrionarios de ratón [4]. Los autores demostraron además que las células bEnd.3 pueden modificarse genéticamente para expresar marcadores fluorescentes o genes de resistencia a los fármacos, creando capas alimentadoras a medida para el cultivo de células madre —una aplicación que amplía significativamente la utilidad de la línea celular más allá de la investigación endotelial clásica.

Conclusión

bEnd.3 sigue siendo una de las líneas celulares más versátiles y productivas en la investigación neurovascular y de la barrera hematoencefálica (BHE). Desde la modelación del accidente cerebrovascular isquémico y la lesión por reperfusión hasta el análisis de la señalización de la eNOS, la reparación de heridas mediada por conexinas, la expresión de genes angiogénicos y la alteración de las uniones estrechas impulsada por la autofagia, esta línea celular de células endoteliales microvasculares del cerebro de ratón ha aportado conocimientos en múltiples disciplinas biomédicas. Su aplicabilidad a cuestiones relacionadas con la enfermedad de Alzheimer, las lesiones cerebrales traumáticas y la selección de agentes neuroprotectores consolida aún más su lugar en el conjunto de herramientas de investigación en neurociencia —siempre y cuando se tengan en cuenta en el diseño experimental su limitada estanqueidad de barrera y su fenotipo transformado—. Se invita a los investigadores que busquen un modelo in vitro de endotelio y transporte a través de la barrera hematoencefálica (BHE) bien caracterizado, reproducible y fácil de manejar experimentalmente a explorar las células Bend.3 disponibles en cytion.com, donde se proporcionan las especificaciones completas del producto y la información para realizar pedidos.

Publicaciones clave

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