はじめに

そのBend.3 セル この細胞株（bEND.3、b.End3、bEnd3、BEND-3、BEND3、およびbrain-derived Endothelial cells.3といった同義語でも知られる）は、形質転換されたマウス脳微小血管内皮細胞株であり、神経血管生物学において最も広く使用されているin vitroツールの一つとなっている。 この細胞株は、ポリオマウイルスの中間T抗原による形質転換を経たマウス脳内皮腫組織から樹立されたものであり、この操作により、重要な内皮細胞の特性を維持しつつ、安定した無期限の増殖能が与えられている。 1990年代初頭にその特性が解明されて以来、bEnd.3は、血液脳関門（BBB）、脳虚血、脳卒中、再灌流障害、血管新生、およびより広範な内皮細胞生物学の研究において、入手しやすく再現性の高い代替モデルとして活用されてきました。 虚血性脳卒中、アルツハイマー病、外傷性脳損傷における血液脳関門（BBB）の破壊をモデル化する上での有用性により、bEnd.3は基礎およびトランスレーショナル神経科学の研究において広く採用されているツールとなっている。

主なポイント

• bEnd.3は、BALB/cマウスの脳組織由来の、ポリオマウイルスの中間T抗原によって形質転換されたマウス脳微小血管内皮細胞株である（Cellosaurus 登録番号 CVCL_0170）。
• これは、虚血性脳卒中、再灌流障害、アルツハイマー病、および神経炎症の研究における血液脳関門のin vitroモデルとして広く利用されている。
• これらの細胞は、タイトジャンクションタンパク質であるクラウディン-5、オクルディン、ZO-1をはじめ、eNOSやPECAM-1など、血液脳関門（BBB）に関連する主要なマーカーを発現している。
• bEnd.3細胞は、LYVE-1やVEGFR-3などのリンパ管内皮マーカーを発現しており、血管生物学の研究におけるその重要性をさらに広げている。
• この細胞株の倍加時間は26～30時間であり、大規模な実験に効率的に利用できます。
• バリアの密閉性は限定的である。最大内皮細胞間電気抵抗が約130 Ω・cm²に達したのはアストロサイト共培養の場合のみであり、この基準では細胞間透過性マーカーと細胞内透過性マーカーの区別が不十分である。
• bEnd.3細胞は、フィーダー細胞としてヒト多能性幹細胞の維持を支援することが示されており、幹細胞生物学におけるその応用範囲を広げている。

bEnd.3とは何ですか？

bEnd.3は、性別不明の生後6週齢のBALB/cマウス（Cellosaurus登録番号CVCL_0170）の脳組織から樹立された。元となる内皮腫細胞は、マウス内皮細胞をポリオマウイルスの中間T（mT）抗原で形質転換することにより作製された。 1990年にモンテサノ、ペッパーらによって行われた画期的な研究では、mTを発現する内皮腫細胞が、著しく増強されたタンパク質分解活性――特にウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の発現上昇と、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子の産生低下――を示し ――さらに、フィブリンゲル内で血管腫に似た大きな嚢胞状構造を形成することが示され、これにより、この発癌遺伝子が正常な血管発達をいかに著しく撹乱しているかが説明された。[1]。このメカニズムに基づく基盤は、bEnd.3の生物学的挙動および実験環境における有用性の根底にある、変容した表現型の解明に寄与した。

その後の特性解析により、この細胞株の形態学的および分子的特徴が詳細に解明された。 Omidiらは、bEnd.3細胞が培養下で特徴的な紡錘状の扁平上皮様形態を示し、クラトリン、カベオリン-1、フロティリン、ダイナミンIIなどの小胞関連タンパク質を発現しており、これは活発な小胞輸送機構の存在と一致すると報告した。[2]。同研究では、タイトジャンクション構成要素であるZO-1、JAM、オクルディン、クラウディン-1、クラウディン-5の転写産物が確認されたほか、GLUT-1を介した機能的なグルコース取り込みおよびP-グリコプロテインによる排出も確認された。 C6アストロサイトとの共培養において、単層細胞の最大経内皮電気抵抗は約130 Ω・cm²に達したが、著者らは、これらの細胞が細胞間および細胞内透過性プローブを有意に区別していないことも明らかにした。 Yuenらはその後、bEnd.3細胞がリンパ管内皮マーカーであるLYVE-1およびVEGFR-3、ならびに前駆細胞マーカーであるSca-1およびCD133も発現し、 さらに、TNF-αによる刺激を受けると毛細血管型の管を形成することを報告した。この発見により、この細胞株の生物学的意義は、従来の血液血管研究の枠を超えて広がることとなった。[3].

bEnd.3のメリット

bEnd.3の最も大きな利点の一つは、その入手しやすさと実用的な再現性です。手間のかかる分離手順を必要とし、継代回数にも限りがある一次脳微小血管内皮細胞とは異なり、bEnd.3は不死化細胞株であり、どの研究室でも確実に増殖させることができます。 倍加時間が26～30時間であるため、この細胞は、均一な細胞を大量に必要とする実験に最適です。タイトジャンクションタンパク質であるクラウディン-5、オクルディン、 ZO-1、eNOS、PECAM-1など）が安定して発現しているため、以下に概説するバリア機能に関する留意点を考慮すれば、幅広い実験条件下において、脳微小血管内皮の実用的な代替モデルとして活用できる。

bEnd.3の汎用性は、複数の研究分野に及んでいます。これまでの研究では、この細胞株を用いて、虚血性脳卒中や再灌流障害における血液脳関門（BBB）の破壊をモデル化したり、接着分子によって引き起こされる神経炎症を調査したり、血管新生関連遺伝子の発現プロファイルを解析したり、コネキシン介在性の細胞間コミュニケーションを解明したりしてきました。 さらに、Joubinらは、bEnd.3細胞がヒト多能性幹細胞を未分化状態に維持し、遺伝子操作が可能なフィーダー細胞として機能することを実証しました。これは、寿命の短い初代培養では容易に再現できない能力です。[4]. このように幅広い応用可能性は、この細胞株が神経科学、血管生物学、薬理学、そして幹細胞研究の各分野において有用であることを示している。

bEnd.3の制限事項

bEnd.3は広く利用されているにもかかわらず、血液脳関門（BBB）モデルとして用いる場合、重要な制限がある。Omidiらは、最大内皮透過電気抵抗がわずか約130 Ω・cm²であることを測定したが、その値を得るにはC6アストロサイトとの共培養が必要であった。 さらに重大な問題として、単層細胞では細胞内透過型プローブと細胞間透過型プローブの区別がほとんど見られず、プロプラノロールとスクロースの透過係数にはごくわずかな違いしか認められなかった[2]。著者らは、このアッセイ法は内皮細胞透過性の評価には不向きである一方、血液脳関門（BBB）の輸送メカニズムの研究においては依然として有用であると結論付けた。したがって、このシステムで得られた透過性データは慎重に解釈すべきであり、可能であれば、共培養システムや生体内での検証によって補完する必要がある。

タイトジャンクション自体の構造にも、これに関連する弱点が見られる。 SongとPachterは、bEnd.3細胞と、精製したばかりのマウス脳微小血管由来一次内皮細胞を比較した。その結果、一次細胞ではクラウディン-5、オクルディン、およびZO-1が細胞間境界に沿って濃縮され、オクルディンとZO-1が界面活性剤に耐性のある細胞骨格の枠組みと分離されていたのに対し、 bEnd.3細胞では、オクルディンとZO-1が細胞質内に拡散して局在し、これらのタンパク質は主に可溶性画分に保持されていた[5]. したがって、bEnd.3におけるタイトジャンクションタンパク質の発現は、それ自体ではジャンクションの正しい形成を意味するものではない。

mTオンコジーンの発現に起因するbEnd.3の性質の変化は、正常な脳内皮細胞には見られない表現型上のアーティファクトをもたらす可能性もある。タンパク質分解活性の上昇——これはmTを発現する内皮腫細胞の決定的な特徴である[1] — また、LYVE-1やVEGFR-3などのリンパ系マーカーの発現状況から、この細胞株は正常な血液血管内皮を完全に再現しているわけではないことが示唆される[3]。さらに、この細胞株ではドナーの性別が特定されていないため、性別別に分類した研究課題への知見の適用範囲が制限される。こうした点は、この細胞株の価値を損なうものではないが、その特定の生物学的背景を理解することの重要性を浮き彫りにしている。

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応用分野

血液脳関門のモデル化と虚血性脳卒中

bEnd.3の最も代表的な応用例は、虚血時および虚血後の状態における血液脳関門のin vitroモデルとしての利用である。 Kotoらは、低酸素状態（1% O₂）がbEnd.3単層におけるクラウディン-5の局在およびタンパク質レベルを変化させ、内皮細胞間の電気抵抗の測定可能な低下を引き起こすことを実証し、生体内における網膜微小血管内皮でもクラウディン-5の相応な喪失を確認しました [6]。 これにより、神経低酸素状態におけるタイトジャンクションのリモデリングとバリア機能の破綻との間にメカニズム上の関連性が確立され、bEnd.3 は、脳卒中における血液脳関門（BBB）機能不全の根底にある分子的事象を研究するための扱いやすいシステムとしての地位を確立した。

Kim らによる頻繁に引用される研究では、この細胞株を、虚血を模擬するために酸素・グルコース欠乏（OGD）に曝露された in vitro BBB モデルとして用いた。 18時間のOGDにより、細胞機能障害、透過性の増加、オクルディンの分解、およびオートファジー経路の活性化が誘導され、分解されたオクルディンは虚血性オートファゴソームと共局在した。オクルディンの喪失と透過性の変化は、オートファジー阻害剤である3-メチルアデニンによって著しく抑制された。 その後、中大脳動脈閉塞を受けたラットの脳毛細血管においても、同様の分子変化と、3-メチルアデニンによるその逆転が再現された [7]。この研究は、オートファジーフラックスとタイトジャンクションタンパク質の喪失を結びつけるメカニズムの枠組みを確立し、脳卒中の病態に関する重要なトランスレーショナルな知見をもたらした。

補完的な研究により、アグマチンが、OGD-再灌流損傷を受けたbEnd.3を含む脳内皮細胞において、マトリックスメタロプロテアーゼ-2および-9の発現を抑制することが実証された。 ）において、マトリックスメタロプロテアーゼ-2および-9の発現を抑制することが示された。MMP-9の発現低下はeNOSの発現上昇および一酸化窒素放出の維持と並行して生じ、脳損傷や再灌流障害に関連する潜在的な神経保護メカニズムを示唆している [8]。 Ang IIを介したアポトーシスに関する研究では、さらに、ハイペロシドがbEnd.3細胞を保護し、in vitroのBBB単層の完全性を維持することが示された。これは、JAM-A、クラウディン-5、ZO-1、カベオリン-1、およびMfsd2aに作用するものであり、脳血管保護のための治療的アプローチを示唆している[9]。 bEnd.3細胞におけるcircLphn3の過剰発現に関する研究では、外傷性脳損傷後にZO-1、 ZO-2、オクルディンなど）の維持における非コードRNAの役割を浮き彫りにした。この際、circLphn3はmiR-185-5pに対する分子スポンジとして機能していることが示された [10]。

神経炎症、内皮毒性、およびアルツハイマー病

bEnd.3細胞は、脳血管内皮における炎症シグナル伝達の研究に広く用いられてきた。 Jeongらは、血液脳関門（BBB）の外側に蓄積する普遍的な重金属であるカドミウムが、IκBαの分解ではなくチロシンリン酸化によって誘導されるNF-κBの活性化を介して、bEnd.3細胞におけるICAM-1の発現を刺激することを示し、カドミウム誘発性脳血管毒性のメカニズム的根拠を提供した [11]。同様に、Zhangらは、1～75 mg/Lの濃度のC反応性タンパク質が、bEnd.3細胞においてICAM-1およびVCAM-1の発現ならびにLDHの漏出を増加させると報告しており、虚血性脳卒中における血液脳関門（BBB）損傷において、この急性期タンパク質が直接的な役割を果たしていることを示唆している[12]。

この細胞株では、農薬による内皮細胞毒性についても研究が行われている。 Jungらは、カルバメート系農薬カルボフランのニトロソ代謝物であるN-ニトロソカルボフランが、MAPキナーゼ経路を介してbEnd.3細胞にアポトーシスを誘導し、その細胞死においてERK経路が主要な役割を果たしていることを実証した[13]。 Tsaiらは、bEnd.3細胞におけるリゾホスファチジルコリンによる細胞毒性を調べ、細胞死の原因を細胞質カルシウムの過剰蓄積、ミトコンドリア膜電位の喪失、 p38の活性化、およびカスパーゼ-3の活性化——特に活性酸素種の生成を伴わずに——に起因することを明らかにし、p38の下流で作用する保護因子としてヘパリンを同定した [14]。 フロルフェニコール処理に関するより最近の研究では、ROCK／コフィリンを介したF-アクチンの再構築が、bEnd.3内皮細胞における増殖および遊走の低下に寄与していることが報告された[15]。

アルツハイマー病の研究分野において、bEnd.3細胞はアミロイドβペプチドによる血液脳関門（BBB）破壊のモデルとして用いられてきた。Chanらは、bEnd.3細胞におけるAβオリゴマーによって誘発されるオートファジーの変化が、RAGE小干渉RNAによって阻害されることを示し、 これにより、CaMKKβ/AMPK/mTOR軸を介したRAGEシグナル伝達が、タイトジャンクションの骨格タンパク質であるZO-1、オクルディン、およびクラウディン-5のオートファジー依存性損傷に関与していることが示された[16]。 これとは別に、ライチの種に含まれるポリフェノールは、bEnd.3細胞においてAMPK/mTOR/ULK1を介したオートファジー経路を通じて、Aβ(25–35)によって誘導されるNLRP3インフラマソームの活性化を阻害することで、BBBの完全性を保護することが示され、この結果はAPP/PS1トランスジェニックマウスでも裏付けられた。この研究は、神経血管界面におけるオートファジーとインフラマソームの相互作用に関する理解を深めるものとなった[17]。フォトバイオモジュレーションについても、同様の文脈で検討が行われている： Maらは、LPS刺激を受けたbEnd.3細胞およびAPP/PS1マウスを用いて、近赤外線照射がミトコンドリアのエネルギー代謝を改善し、オクルディン、クラウディン-5、およびZO-1の発現を上昇させ、AMPK依存的なメカニズムでバリアの完全性を保護することを示した[18]。

血管新生と血管シグナル伝達

bEnd.3は、血管新生シグナル伝達に関する研究において極めて有益な知見をもたらしてきた。Yueらは、cDNAマイクロアレイを用いて、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）処理したbEnd.3細胞における血管新生関連遺伝子の発現プロファイルを解析し、ADAMTS1、 MMP-9、アンジオポエチン-1、PDGF-B、G-CSFなどの血管新生促進遺伝子の発現上昇、TIMP-2やTSP-3などの抗血管新生遺伝子の発現低下、ならびにmRNAおよびタンパク質レベルにおけるシクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）の誘導を明らかにした[19]。 このハイスループットなアプローチにより、bEnd.3はゲノム規模の血管新生プロファイリングを行うための便利なプラットフォームとして確立された。

低酸素による血管新生反応も、bEnd.3 細胞を用いて解明されている。 Zhuらは、低酸素がp38 MAPKの活性化を介してbEnd.3細胞におけるエンドグリン（CD105）のmRNAおよびタンパク質の発現を増加させることを実証し、この経路の阻害剤およびドミナントネガティブ型MKK3がエンドグリンの誘導を抑制することを明らかにした[20]。 エンドグリンは遺伝性出血性毛細血管拡張症において変異しており、活発な血管新生中に発現が上昇するため、これらの知見は、低酸素感受性MAPKシグナル伝達と病理学的血管リモデリングとの関連性を示唆した。Liらはさらに、低酸素状態がbEnd.3細胞においてCD73（エクト-5'-ヌクレオチダーゼ）の活性、 mRNA、およびタンパク質を時間依存的に上調節することを明らかにした。一方、再酸素化により当初はこの誘導が逆転したが、再酸素化が長期化するとCD73は再び上昇し、これにより、アデノシンの生成が虚血・再灌流時の神経保護メカニズムとして関与していることが示唆された[21]。

bEnd.3をモデル系として、アンジオポエチンシグナル伝達が詳細に研究されてきた。 Shiらは、bEnd.3細胞において無血清アポトーシスモデルを確立し、アンジオポエチン-1が、Baxの減少、Bcl-2の増加、およびミトコンドリアから細胞質へのシトクロムCの放出低下を伴うメカニズムを通じて、微小血管内皮細胞のアポトーシスを抑制することを実証した[22]。 Perryらは、アンジオポエチンの生物学的知見を血管腫の研究へと拡大し、乳児のヒト血管腫においてTie-2受容体が恒常的に活性化されていることを実証した。また、bEnd.3細胞をマウスモデル血管腫システムとして用いて、アンジオポエチン-2の産生を薬理学的に阻害することで、生体内での腫瘍の増殖がほぼ完全に抑制されることを示した [23]。

eNOS、コネキシン、および内皮機能

内皮型一酸化窒素合成酵素（eNOS）の生物学的特性は、bEnd.3細胞において極めて精密に解明されている。 Goversらは、免疫蛍光顕微鏡法を用いて、細胞膜におけるeNOSの局在が細胞間接触に決定的に依存していることを示した。eNOSは細胞間接触部位に強く富集しており、その分布パターンはVE-カドヘリンやプラコグロビンというよりはPECAM-1の分布パターンに類似しており、 また、発現量に変化がないにもかかわらず、eNOS活性は未密接単層よりも密接単層において高かった[24]。eNOSの局在と活性とのこの空間的関連性は、bEnd.3細胞が、密接な内皮の生理学的状況を有意義に解明できるモデルであることを浮き彫りにした。

Beversらは、iNOSおよびnNOSを欠く一方で、比較対象となる内皮細胞株よりも2桁以上高いレベルでeNOSを発現するbEnd.3細胞におけるeNOSの解偶合を調査した。 彼らは、テトラヒドロビオプテリン（BH4）の補充によりNO産生が増加し、活性酸素種（ROS）の生成が減少したのに対し、L-アルギニンを追加するとVEGF誘導性ROSがさらに増加することを発見した。これは、この状況下では、アルギニンの利用可能性ではなく、相対的なBH4欠乏がアンカップリングを促進していることを示唆している[25]。 この結果は、高血圧やアテローム性動脈硬化症などの疾患に伴う血管合併症に直接関連しており、これらの疾患では、eNOSの持続的な過剰発現が逆説的に酸化ストレスを促進する可能性がある。

bEnd.3 細胞においても、コネキシンによるギャップ結合を介した細胞間コミュニケーションが検討されている。 Kwakらは、bEnd.3単層に機械的損傷を与える前後のコネキシン発現および細胞間結合を比較し、損傷部位においてCx43の発現が上昇し、Cx37の発現が低下する一方で、Cx40には影響が見られないことを観察した [26]。 ドミナントネガティブなコネキシン阻害剤の安定的なトランスフェクションにより、増殖、単一細胞の遊走、またはタンパク質分解活性に変化を与えることなく、創傷が完全に閉じるまでに要する時間が約 50% 延長され、協調的な内皮創傷修復におけるギャップ結合コミュニケーションの特異的な役割が確立された。

神経栄養因子の分泌と幹細胞への応用

bEnd.3細胞は、周囲の神経微小環境に作用する神経栄養因子を分泌する。Wangらは、bEnd.3細胞において脳由来神経栄養因子（BDNF）が発現・放出されることを実証し、持続性および間欠的な低酸素状態の双方がBDNF分泌を刺激することを示した。なお、間欠的な低酸素状態の方がより強力な刺激であることが明らかになった [27]。低酸素によって誘導されるBDNFの放出は、N-アセチル-L-システインおよびスーパーオキシドディスムターゼ模倣薬によって部分的に阻害され、低酸素に駆動される神経栄養シグナル伝達に活性酸素種が関与していることが示唆され、また、細胞内の貯蔵庫からのカルシウム動員を必要とした。 これらの知見により、脳微小血管内皮は単なる受動的なバリアではなく、神経細胞の生存に能動的に関与していることが明らかになった。

最も注目すべきは、Joubinらによって、bEnd.3細胞がヒト多能性幹細胞を未分化状態に維持し、マウス胚性線維芽細胞が提供するニッチを模倣する可溶性因子を分泌することが示されたことである[4]。 著者らはさらに、bEnd.3 細胞を遺伝子操作して蛍光レポーターや薬剤耐性遺伝子を発現させ、幹細胞培養用の「オーダーメイドのフィーダー層」を作成できることを実証しました。これは、従来の内皮細胞研究の枠を超えて、この細胞株の有用性を大幅に拡大する応用例です。

結論

bEnd.3 は、神経血管および血液脳関門（BBB）の研究において、依然として最も汎用性が高く、生産性の高い細胞株の一つである。 虚血性脳卒中や再灌流障害のモデル化から、eNOSシグナル伝達、コネキシン介在性の創傷修復、血管新生関連遺伝子の発現、オートファジーによるタイトジャンクションの破壊の解明に至るまで、このマウス脳微小血管内皮細胞株は、複数の生物医学分野にわたり知見をもたらしてきた。 アルツハイマー病、外傷性脳損傷、および神経保護剤のスクリーニングといった課題への適用可能性は、実験デザインにおいてその限られたバリア機能と形質転換された表現型が考慮されることを前提として、神経科学研究ツールキットにおけるその地位をさらに確固たるものにしています。 十分に特性が解明され、再現性が高く、実験的に扱いやすいin vitro内皮細胞および血液脳関門（BBB）輸送モデルを求める研究者には、cition.comで入手可能なBend.3細胞の利用を検討することをお勧めします。同サイトでは、製品の完全な仕様および注文情報が提供されています。

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