Introducción

El Células Bend.3 La línea —también conocida por los sinónimos bEND.3, b.End3, bEnd3, BEND-3, BEND3 y «células endoteliales derivadas del cerebro.3»— es una línea celular de células endoteliales microvasculares del cerebro de ratón transformadas que se ha convertido en una de las herramientas in vitro más utilizadas en biología neurovascular. La línea se estableció a partir de tejido de endotelioma cerebral murino tras su transformación con el antígeno T medio del virus del polioma, una manipulación que le confiere una capacidad proliferativa estable e indefinida, al tiempo que conserva las características endoteliales clave. Desde su caracterización a principios de la década de 1990, bEnd.3 ha servido como un modelo accesible y reproducible para el estudio de la barrera hematoencefálica (BHE), la isquemia cerebral, el ictus, la lesión por reperfusión, la angiogénesis y, de manera más amplia, la biología de las células endoteliales. Su utilidad para modelar la alteración de la BHE en el contexto del ictus isquémico, la enfermedad de Alzheimer y el traumatismo craneoencefálico lo ha convertido en una herramienta ampliamente adoptada tanto en la investigación básica como en la traslacional en neurociencia.

Puntos clave

• bEnd.3 es una línea celular de células endoteliales microvasculares del cerebro de ratón transformada, derivada de tejido cerebral de ratón BALB/c y transformada con el antígeno T medio del virus del polioma (número de acceso en Cellosaurus: CVCL_0170).
• Se utiliza ampliamente como modelo in vitro de la barrera hematoencefálica para el estudio del ictus isquémico, la lesión por reperfusión, la enfermedad de Alzheimer y la neuroinflamación.
• Las células expresan marcadores clave asociados a la barrera hematoencefálica, entre los que se incluyen las proteínas de las uniones estrechas claudina-5, ocludina y ZO-1, así como eNOS y PECAM-1.
• Las células bEnd.3 expresan marcadores endoteliales linfáticos como LYVE-1 y VEGFR-3, lo que amplía su relevancia para la investigación en biología vascular.
• La línea celular tiene un tiempo de duplicación de entre 26 y 30 horas, lo que la hace idónea para trabajos experimentales a gran escala.
• La estanqueidad de la barrera es limitada: solo en el cocultivo astroglial se alcanzó una resistencia eléctrica transendotelial máxima de aproximadamente 130 Ω·cm², y la línea distingue mal entre los marcadores de permeabilidad paracelular y transcelular.
• Se ha demostrado que las células bEnd.3 favorecen el mantenimiento de las células madre pluripotentes humanas en su función de células alimentadoras, lo que amplía sus aplicaciones en la biología de las células madre.

¿Qué es bEnd.3?

bEnd.3 se obtuvo a partir de tejido cerebral de un ratón BALB/c de 6 semanas de edad, de sexo no especificado (número de acceso de Cellosaurus: CVCL_0170). Las células de endotelioma originales se generaron mediante la transformación de células endoteliales murinas con el antígeno «middle T» (mT) del virus del polioma. Un estudio de referencia realizado en 1990 por Montesano, Pepper y sus colaboradores demostró que las células de endotelioma que expresan mT presentan una actividad proteolítica notablemente aumentada —en particular, unos niveles elevados de activador del plasminógeno de tipo uroquinasa, junto con una producción reducida de inhibidor del activador del plasminógeno —, y forman grandes estructuras quísticas similares a hemangiomas dentro de geles de fibrina, lo que explica la profunda alteración que el oncogén provoca en el desarrollo vascular normal [1]. Esta base mecánica contribuyó a definir el fenotipo transformado que sustenta el comportamiento biológico y la utilidad de bEnd.3 en entornos experimentales.

Los trabajos posteriores de caracterización han definido con detalle el perfil morfológico y molecular de la línea celular. Omidi y sus colaboradores informaron de que las células bEnd.3 presentan en cultivo una morfología escamosa distintiva con forma de huso y expresan proteínas asociadas a las vesículas, entre ellas la clatrina, la caveolina-1, la flotilina y la dinamina II, lo que concuerda con un mecanismo activo de tráfico vesicular. [2]. El mismo estudio confirmó la presencia de transcritos de los elementos de las uniones estrechas ZO-1, JAM, ocludina, claudina-1 y claudina-5, así como la captación funcional de glucosa mediada por GLUT-1 y el eflujo de la glicoproteína P. En cocultivo con astrocitos C6, las monocapas alcanzaron una resistencia eléctrica transendotelial máxima de aproximadamente 130 Ω·cm², aunque los autores también observaron que las células no distinguían de forma significativa entre los marcadores de permeabilidad paracelular y transcelular. Yuen y sus colaboradores informaron posteriormente de que las células bEnd.3 también expresan los marcadores endoteliales linfáticos LYVE-1 y VEGFR-3, así como los marcadores de progenitores Sca-1 y CD133, y forman tubos de tipo capilar tras la estimulación con TNF-alfa —un descubrimiento que amplió la relevancia biológica de la línea celular más allá de la investigación vascular clásica— [3].

Ventajas de bEnd.3

Una de las ventajas más significativas de bEnd.3 es su accesibilidad y su facilidad de reproducción. A diferencia de las células endoteliales microvasculares cerebrales primarias, que requieren laboriosos procedimientos de aislamiento y presentan una capacidad de pases limitada, bEnd.3 es una línea inmortalizada que puede multiplicarse de forma fiable en distintos laboratorios. Con un tiempo de duplicación de entre 26 y 30 horas, estas células son idóneas para experimentos que requieran grandes cantidades de células uniformes. Su expresión estable de marcadores endoteliales —entre los que se incluyen las proteínas de uniones estrechas claudina-5, ocludina y ZO-1, así como eNOS y PECAM-1— las convierte en un sustituto práctico del endotelio microvascular cerebral en una amplia gama de condiciones experimentales, siempre que se tengan en cuenta las salvedades relativas a la función de barrera que se describen a continuación.

La versatilidad de bEnd.3 abarca múltiples disciplinas de investigación. Se han realizado estudios utilizando esta línea para modelar la alteración de la barrera hematoencefálica (BHE) durante el ictus isquémico y la lesión por reperfusión, investigar la neuroinflamación desencadenada por moléculas de adhesión, caracterizar la expresión génica angiogénica y explorar la comunicación intercelular mediada por conexinas. Además, Joubin y sus colegas demostraron que las células bEnd.3 pueden mantener a las células madre pluripotentes humanas en un estado indiferenciado, actuando como células alimentadoras que pueden modificarse genéticamente —una capacidad que no resulta fácil de replicar con cultivos primarios de vida corta—. [4]. Esta amplitud de aplicaciones pone de manifiesto la utilidad de la línea celular en los campos de la neurociencia, la biología vascular, la farmacología y la investigación con células madre.

Limitaciones de bEnd.3

A pesar de su uso generalizado, bEnd.3 presenta importantes limitaciones cuando se emplea como modelo de la barrera hematoencefálica. Omidi y sus colaboradores midieron una resistencia eléctrica transendotelial máxima de tan solo unos 130 Ω·cm², y ese valor requirió un cocultivo con astrocitos C6; lo que es aún más importante, las monocapas mostraron poca capacidad para distinguir entre sondas transcelulares y paracelulares, y los coeficientes de permeabilidad del propranolol y la sacarosa solo difirieron de forma marginal [2]. Los autores concluyeron que esta línea celular no es adecuada para evaluar la permeabilidad transendotelial, aunque sigue siendo útil para los estudios sobre los mecanismos de transporte de la barrera hematoencefálica. Por lo tanto, los datos de permeabilidad obtenidos en este sistema deben interpretarse con precaución y, siempre que sea posible, complementarse con sistemas de cocultivo o con una validación in vivo.

La propia organización de las uniones estrechas constituye un punto débil relacionado. Song y Pachter compararon bEnd.3 con células endoteliales microvasculares cerebrales primarias de ratón recién purificadas y observaron que, mientras que las células primarias concentraban claudina-5, ocludina y ZO-1 a lo largo de las fronteras intercelulares y separaban la ocludina y la ZO-1 del armazón citosquelético resistente a los detergentes, las células bEnd.3 mostraban una localización citoplasmática difusa de la ocludina y la ZO-1 y retenían estas proteínas predominantemente en la fracción soluble. [5]. Por lo tanto, la expresión de una proteína de unión estrecha en bEnd.3 no implica por sí sola que el ensamblaje de las uniones sea correcto.

La transformación de bEnd.3, derivada de la expresión del oncogén mT, también puede dar lugar a artefactos fenotípicos que no están presentes en el endotelio cerebral normal. La elevada actividad proteolítica —una característica definitoria de las células de endotelioma que expresan mT— [1] — y la expresión de marcadores linfáticos como LYVE-1 y VEGFR-3 sugiere que la línea celular no reproduce íntegramente el endotelio vascular sanguíneo normal [3]. Además, en esta línea celular no se especifica el sexo de los donantes, lo que limita la aplicabilidad de los resultados a cuestiones de investigación estratificadas por sexo. Estas consideraciones no restan valor a la línea celular, pero sí subrayan la importancia de comprender su contexto biológico específico.

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Aplicaciones

Modelización de la barrera hematoencefálica y el ictus isquémico

La aplicación más destacada de bEnd.3 es como modelo in vitro de la barrera hematoencefálica en condiciones isquémicas y postisquémicas. Koto y sus colaboradores demostraron que la hipoxia (1 % de O₂) alteraba la localización y el nivel proteico de la claudina-5 en monocapas de bEnd.3, lo que provocaba una disminución cuantificable de la resistencia eléctrica transendotelial, y confirmaron la correspondiente pérdida de claudina-5 en el endotelio microvascular retiniano in vivo [6]. Esto estableció un vínculo mecánico entre la remodelación de las uniones estrechas y la ruptura de la barrera durante la hipoxia neural, y posicionó a bEnd.3 como un sistema manejable para estudiar los eventos moleculares subyacentes al fallo de la barrera hematoencefálica (BHE) en el ictus.

Un estudio frecuentemente citado de Kim y sus colaboradores utilizó esta línea celular como modelo in vitro de la BHE expuesta a la privación de oxígeno y glucosa (OGD) para simular la isquemia. Dieciocho horas de OGD indujeron disfunción celular, aumento de la permeabilidad, degradación de la ocludina y activación de las vías de autofagia, observándose que la ocludina degradada se colocalizaba con los autofagosomas isquémicos; tanto la pérdida de ocludina como el cambio en la permeabilidad se redujeron notablemente con el inhibidor de la autofagia 3-metiladenina. Posteriormente, se reprodujeron los mismos cambios moleculares y su reversión por la 3-metiladenina en los capilares cerebrales de ratas sometidas a oclusión de la arteria cerebral media [7]. Este trabajo estableció un marco mecanístico que vincula el flujo autofágico con la pérdida de proteínas de las uniones estrechas y aportó importantes conocimientos traslacionales sobre la patología del ictus.

Investigaciones complementarias demostraron que la agmatina atenúa la expresión de las metaloproteinasas de matriz 2 y 9 en las células endoteliales cerebrales —incluidas las bEnd.3 — sometidas a una lesión por privación de oxígeno y glucosa (OGD) y reperfusión, en la que la regulación a la baja de la MMP-9 discurre en paralelo a la regulación al alza de la eNOS y al mantenimiento de la liberación de óxido nítrico, lo que ofrece un posible mecanismo neuroprotector relevante para las lesiones cerebrales y la lesión por reperfusión [8]. Los estudios sobre la apoptosis mediada por la Ang II mostraron además que el hiperósido protege a las células bEnd.3 y preserva la integridad de una monocapa de la BHE in vitro, actuando sobre JAM-A, claudina-5, ZO-1, caveolina-1 y Mfsd2a, lo que sugiere vías terapéuticas para la protección cerebrovascular [9]. La investigación sobre la sobreexpresión de circLphn3 en células bEnd.3 también puso de relieve el papel del ARN no codificante en el mantenimiento de la expresión de proteínas de las uniones estrechas —entre ellas ZO-1, ZO-2 y ocludina— tras una lesión cerebral traumática, actuando el circLphn3 como una esponja molecular para el miR-185-5p [10].

Neuroinflamación, toxicología endotelial y enfermedad de Alzheimer

Las células bEnd.3 se han utilizado ampliamente para estudiar la señalización inflamatoria en el endotelio cerebrovascular. Jeong y sus colaboradores demostraron que el cadmio —un metal pesado omnipresente que se acumula fuera de la barrera hematoencefálica— estimulaba la expresión de ICAM-1 en las células bEnd.3 a través de la activación de NF-κB impulsada por la fosforilación de tirosina de IκBα, en lugar de su degradación, lo que proporcionó una base mecánica para la toxicidad cerebrovascular inducida por el cadmio [11]. De manera similar, Zhang y sus colaboradores informaron de que la proteína C reactiva, en concentraciones de 1 a 75 mg/L, aumentaba la expresión de ICAM-1 y VCAM-1, así como la fuga de LDH en las células bEnd.3, lo que sugiere un papel directo de esta proteína de fase aguda en la lesión de la BHE durante el ictus isquémico [12].

También se ha investigado la toxicidad endotelial inducida por plaguicidas en esta línea celular. Jung y sus colaboradores demostraron que el N-nitrosocarbofurano, el metabolito nitroso del pesticida carbamato carbofurano, inducía la apoptosis en las células bEnd.3 a través de las vías de las MAP cinasas, desempeñando la vía ERK un papel predominante en la muerte celular [13]. Tsai y sus colaboradores examinaron la citotoxicidad inducida por la lisofosfatidilcolina en células bEnd.3 y atribuyeron la muerte celular a la sobrecarga de calcio citosólico, la pérdida del potencial de membrana mitocondrial, la activación de la p38 y la activación de la caspasa-3 —en particular, sin generación de especies reactivas de oxígeno— e identificaron la heparina como un agente protector que actúa aguas abajo de la p38 [14]. Trabajos más recientes sobre el tratamiento con florfenicol documentaron que la remodelación de la F-actina mediada por ROCK/cofilina contribuye a la reducción de la proliferación y la migración en las células endoteliales bEnd.3 [15].

En el ámbito de la investigación sobre la enfermedad de Alzheimer, las células bEnd.3 han servido como modelo para la alteración de la barrera hematoencefálica (BHE) mediada por el péptido beta-amiloide. Chan y sus colaboradores demostraron que las alteraciones de la autofagia inducidas por oligómeros de Aβ en las células bEnd.3 quedaban bloqueadas por el ARN pequeño interferente de RAGE, lo que relacionaba la señalización de RAGE a través del eje CaMKKβ/AMPK/mTOR con el daño dependiente de la autofagia de las proteínas del andamio de las uniones estrechas ZO-1, ocludina y claudina-5 [16]. Por otra parte, se demostró que los polifenoles de la semilla de lichi protegen la integridad de la BHE al inhibir la activación del inflamasoma NLRP3 inducida por Aβ(25–35) a través de la vía de autofagia mediada por AMPK/mTOR/ULK1 en células bEnd.3, resultados que se corroboraron en ratones transgénicos APP/PS1 —un estudio que amplió la comprensión de la interacción entre la autofagia y el inflamasoma en la interfaz neurovascular [17]. La fotobiomodulación se ha estudiado en el mismo contexto: Ma y sus colaboradores utilizaron células bEnd.3 estimuladas con LPS, junto con ratones APP/PS1, para demostrar que el tratamiento con infrarrojo cercano mejora el metabolismo energético mitocondrial, regula al alza la ocludina, la claudina-5 y la ZO-1, y protege la integridad de la barrera de forma dependiente de la AMPK [18].

Angiogénesis y señalización vascular

Las células bEnd.3 han resultado muy reveladoras en los estudios sobre la señalización angiogénica. Yue y sus colaboradores emplearon un microarray de ADNc para perfilar la expresión génica angiogénica en células bEnd.3 tratadas con factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), identificando la regulación al alza de genes proangiogénicos, entre ellos ADAMTS1, MMP-9, la angiopoyetina-1, el PDGF-B y el G-CSF; la regulación a la baja de genes antiangiogénicos como el TIMP-2 y el TSP-3; y la inducción de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) tanto a nivel de ARNm como de proteína [19]. Este enfoque de alto rendimiento consolidó a bEnd.3 como una plataforma adecuada para el perfilado de la angiogénesis a escala genómica.

Las respuestas angiogénicas provocadas por la hipoxia también se han cartografiado utilizando células bEnd.3. Zhu y sus colaboradores demostraron que la hipoxia aumentaba la expresión del ARNm y de la proteína de la endoglina (CD105) en las células bEnd.3 mediante la activación de la p38 MAPK, y que los inhibidores de esta vía —así como la MKK3 dominante negativa— suprimían la inducción de la endoglina [20]. Dado que la endoglina presenta mutaciones en la telangiectasia hemorrágica hereditaria y se regula al alza durante la angiogénesis activa, estos hallazgos relacionaron la señalización de la MAPK sensible a la hipoxia con la remodelación vascular patológica. Li y sus colaboradores demostraron además que la hipoxia regula al alza la actividad de la CD73 (ecto-5'-nucleotidasa), el ARNm y la proteína en las células bEnd.3 de forma dependiente del tiempo, mientras que la reoxigenación revirtió inicialmente esta inducción antes de que la CD73 volviera a aumentar con una reoxigenación prolongada, lo que sugiere que la generación de adenosina actúa como mecanismo neuroprotector durante la isquemia-reperfusión [21].

La señalización de la angiopoyetina se ha estudiado en profundidad utilizando bEnd.3 como sistema modelo. Shi y sus colaboradores establecieron un modelo de apoptosis sin suero en células bEnd.3 y demostraron que la angiopoyetina-1 inhibe la apoptosis de las células endoteliales microvasculares a través de un mecanismo que implica la disminución de Bax, el aumento de Bcl-2 y la reducción de la liberación de citocromo C desde las mitocondrias al citoplasma [22]. Perry y sus colaboradores ampliaron la biología de la angiopoyetina a la investigación sobre los hemangiomas, demostrando la activación constitutiva del receptor Tie-2 en el hemangioma humano de la primera infancia y utilizando células bEnd.3 como sistema modelo murino de hemangioma, en el que la inhibición farmacológica de la producción de angiopoyetina-2 eliminó casi por completo el crecimiento tumoral in vivo [23].

eNOS, conexinas y función endotelial

La biología de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) se ha caracterizado en las células bEnd.3 con considerable precisión. Govers y sus colaboradores utilizaron microscopía de inmunofluorescencia para demostrar que la localización de la eNOS en la membrana plasmática depende de manera crítica del contacto célula-célula, con un fuerte enriquecimiento en los puntos de contacto intercelular que se asemeja al patrón de distribución de la PECAM-1 más que al de la VE-cadherina o la placoglobina, y con una actividad de la eNOS mayor en monocapas confluentes que en subconfluentes, a pesar de que la expresión no variaba [24]. Este acoplamiento espacial entre la localización y la actividad de la eNOS destacó a bEnd.3 como un modelo en el que se puede estudiar de forma significativa el contexto fisiológico del endotelio confluente.

Bevers y sus colaboradores investigaron el desacoplamiento de la eNOS en células bEnd.3, que expresan eNOS en niveles superiores en más de dos órdenes de magnitud a los de una línea endotelial de comparación, al tiempo que carecen de iNOS y nNOS. Descubrieron que la suplementación con tetrahidrobiopterina (BH4) aumentaba la producción de NO y disminuía la generación de especies reactivas de oxígeno, mientras que la adición de L-arginina adicional incrementaba aún más las ROS inducidas por el VEGF, lo que indica que es la deficiencia relativa de BH4, y no la disponibilidad de arginina, lo que impulsa el desacoplamiento en este contexto [25]. Este resultado tiene relevancia directa para las complicaciones vasculares de afecciones como la hipertensión y la aterosclerosis, en las que la sobreexpresión sostenida de eNOS puede, paradójicamente, favorecer el estrés oxidativo.

También se ha estudiado la comunicación a través de uniones comunicantes mediada por conexinas en células bEnd.3. Kwak y sus colegas compararon la expresión de conexinas y el acoplamiento célula-célula antes y después de una lesión mecánica en monocapas de bEnd.3, observando una regulación al alza de Cx43 y una regulación a la baja de Cx37 inducidas por la lesión en el lugar de la lesión, sin que Cx40 se viera afectada [26]. La transfección estable con inhibidores de conexina dominantes negativos prolongó el tiempo necesario para el cierre completo de la herida en aproximadamente un 50 % sin alterar la proliferación, la migración de células individuales ni la actividad proteolítica, lo que establece un papel específico de la comunicación a través de las uniones comunicantes en la reparación coordinada de las heridas endoteliales.

Secreción de factores neurotróficos y aplicaciones con células madre

Las células bEnd.3 secretan factores neurotróficos que actúan sobre el microambiente neural circundante. Wang y sus colaboradores demostraron que las células bEnd.3 expresan y liberan el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), y que tanto la hipoxia sostenida como la intermitente estimulan la secreción de BDNF, siendo la hipoxia intermitente el estímulo más potente [27]. La liberación de BDNF inducida por la hipoxia se vio parcialmente inhibida por la N-acetil-L-cisteína y por un mimético de la superóxido dismutasa, lo que implica la participación de las especies reactivas de oxígeno en la señalización neurotrófica impulsada por la hipoxia, y requirió la movilización de calcio desde las reservas internas. Estos hallazgos establecieron que el endotelio microvascular cerebral es un participante activo en la supervivencia neural, y no meramente una barrera pasiva.

Lo más llamativo es que Joubin y sus colegas demostraron que las células bEnd.3 mantienen a las células madre pluripotentes humanas en un estado indiferenciado, secretando una actividad soluble que imita el nicho proporcionado por los fibroblastos embrionarios de ratón [4]. Los autores demostraron además que las células bEnd.3 pueden modificarse genéticamente para expresar marcadores fluorescentes o genes de resistencia a fármacos, creando capas alimentadoras a medida para el cultivo de células madre —una aplicación que amplía significativamente la utilidad de la línea celular más allá de la investigación endotelial clásica.

Conclusión

bEnd.3 sigue siendo una de las líneas celulares más versátiles y productivas en la investigación neurovascular y de la barrera hematoencefálica (BHE). Desde la modelización del ictus isquémico y la lesión por reperfusión hasta el análisis de la señalización de la eNOS, la reparación de heridas mediada por conexinas, la expresión génica angiogénica y la alteración de las uniones estrechas impulsada por la autofagia, esta línea celular de células endoteliales microvasculares del cerebro de ratón ha aportado conocimientos en múltiples disciplinas biomédicas. Su aplicabilidad a cuestiones relacionadas con la enfermedad de Alzheimer, las lesiones cerebrales traumáticas y el cribado de agentes neuroprotectores consolida aún más su lugar en el conjunto de herramientas de investigación neurocientífica, siempre que se tengan en cuenta en el diseño experimental su limitada estanqueidad de barrera y su fenotipo transformado. Se anima a los investigadores que busquen un modelo in vitro de endotelio y transporte a través de la barrera hematoencefálica (BHE) bien caracterizado, reproducible y fácil de manejar experimentalmente a que exploren las células Bend.3, disponibles en cytion.com, donde se facilitan las especificaciones completas del producto y la información para realizar pedidos.

Publicaciones clave

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