Buněčná kultivační média: přehled

V oblasti biologických věd patří mezi nejdůležitější metodiky buněčná kultura. Pod pojmem „buněčná kultura“ se rozumí odebrání buněk, tkání nebo orgánů ze zvířete či rostliny a jejich následné umístění do umělého prostředí, které je příznivé pro jejich přežití a/nebo růst. Základními podmínkami pro optimální vývoj buněk jsou regulovaná teplota, substrát pro přilnutí buněk, vhodné růstové médium a inkubátor, který udržuje optimální pH a osmolalitu. Buňky musí mít tyto podmínky, aby mohly růst na plný potenciál.

Výběr vhodného růstového média pro kultivaci in vitro je ve buněčné kultuře fází, která je zároveň nejkritičtější i nejdůležitější. Růstové médium, známé také jako kultivační médium, je kapalina nebo gel sestavený tak, aby podporoval vývoj organismů v mikroskopickém, buněčném nebo rostlinném měřítku. Médium používané pro kultivaci buněk často obsahuje dostatečný přísun energie a látek, které regulují buněčný cyklus. Mezi hlavní složky kultivačního média patří aminokyseliny, vitamíny, anorganické soli, glukóza a sérum. Sérum se do média přidává, protože slouží jako zdroj růstových faktorů, hormonů a adhezivních faktorů. Kromě dodávání živin přispívá médium také k udržení správné hodnoty pH a osmolality.

Typy médií používaných v buněčné kultuře

Lidské i živočišné buňky lze pěstovat buď v umělém či syntetickém médiu, nebo ve zcela přírodním médiu doplněném o přírodní prvky. Níže vám poskytneme přehled různých typů médií, která jsou v současné době k dispozici.

Přírodní média

V přírodních médiích se vyskytují pouze biologické tekutiny, které existují ve svém přirozeném stavu. Přírodní média jsou velmi užitečná a snadno použitelná pro kultivaci široké škály typů živočišných buněk. Nedostatečné porozumění přesnému složení přírodních médií je hlavním faktorem, který přispívá k nízké opakovatelnosti výsledků získaných při použití přírodních médií.

Umělá média

Příprava umělých nebo syntetických médií zahrnuje přidání živin (organických i anorganických), sérových proteinů, sacharidů, kofaktorů, vitamínů a solí, stejně jako plynných fází O₂ a CO₂ [1].

Byly vyvinuty různé typy umělých médií, aby splňovaly jednu nebo více z následujících funkcí: 1) Okamžité přežití (vyvážený solný roztok s přesnou hodnotou pH a osmotickým tlakem). 2) Prodloužené přežití (vyvážený solný roztok doplněný různými složeními organických chemikálií a/nebo séra). 3) Neomezený vývoj. 4) Specializované funkce.

Existují čtyři odlišné klasifikace umělých médií:

Média obsahující sérum

Nejčastějším druhem doplňku v médiu používaném pro kultivaci živočišných buněk je fetální bovinní sérum. Do kultivačního média se přidává jako levný doplněk za účelem dosažení co nejlepších podmínek pro růst. Kromě toho, že sérum působí jako transportér nebo chelátor pro živiny, které jsou nestabilní nebo nerozpustné ve vodě, hormony a růstové faktory, inhibitory proteáz a další látky, také váže a neutralizuje škodlivé molekuly.

Prostředky bez séra

Přítomnost séra v kultivačních médiích má řadu nevýhod a může způsobit závažné chyby při interpretaci výsledků v imunologickém výzkumu [2, 3]. Byla vyvinuta řada různých bezsérových médií [4, 5]. Tato média jsou obecně speciálně formulována tak, aby podporovala kultivaci jediného typu buněk, jako jsou například Knockout Serum Replacement a Knockout DMEM od společnosti Thermo Fisher Scientific a médium mTESR od společnosti Stem Cell Technologies [6] určené pro kmenové buňky [7].

Kromě toho tato média obsahují definovaná množství purifikovaných růstových faktorů, lipoproteinů a dalších proteinů, které by jinak obvykle dodávalo sérum [8]. Tato média se často označují jako „definovaná kultivační média“, protože složky, z nichž se skládají, jsou dobře známy.

Chemicky definovaná média

Tato média obsahují ultračisté anorganické a organické složky, které nebyly kontaminovány žádným druhem nečistot. Mohou také obsahovat přísady v podobě čistých proteinů, jako jsou růstové faktory.

 Genetická modifikace bakterií nebo kvasinek spolu s přidáním konkrétních mastných kyselin, vitamínů, cholesterolu a aminokyselin vede k produkci jejich složek [9].

Prostředí bez bílkovin

Média bez bílkovin jsou taková, která neobsahují vůbec žádné bílkoviny, ale pouze neproteinové složky. Ve srovnání s médii s přidaným sérem podporuje použití médií bez přidaných bílkovin větší buněčnou proliferaci a expresi bílkovin a usnadňuje čištění jakéhokoli produktu vzniklého v následném procesu [10–12]. Proteiny nejsou součástí složení médií, jako jsou MEM a RPMI-1640. V případě potřeby však lze přidat proteinový doplněk.

Kultivační média a jejich základní složky

Komerční kultivační média lze zakoupit v práškové nebo tekuté formě a často obsahují řadu živin, jako jsou aminokyseliny, glukóza, soli, vitamíny a další doplňky stravy. 

Potřeby těchto složek se u jednotlivých buněčných linií liší a právě tyto rozdíly jsou příčinou velkého množství různých složení médií. Každá složka plní určitou funkci, která bude popsána v následujících odstavcích:

Pufrovací systémy

Pro udržení optimálních podmínek pro růst je nutné regulovat pH, což se často provádí pomocí jednoho ze dvou pufrovacích systémů:

Přírodní pufrovací systém

Poměr CO₂/H₂CO₃ v atmosféře se rovná poměru v médiu, čímž vzniká přirozený pufrovací mechanismus. Aby se zachoval tento přirozený pufrovací mechanismus, musí být kultury udržovány v prostředí s obsahem 5–10 % CO₂, čehož se často dosahuje použitím CO₂ inkubátoru. Jednou z největších výhod používání přírodního pufru je jeho nízká cena a bezpečnost.

HEPES

Chemické pufrování pomocí zwitteriontu HEPES má větší pufrovací schopnost v rozmezí pH 7,2–7,4 a nevyžaduje regulované plynné prostředí. U některých typů buněk může být vyšší dávka HEPES škodlivá. Média obsahující HEPES jsou rovněž mnohem náchylnější k fototoxickým účinkům fluorescenčního světla [13].

Fenolová červeň

Indikátor pH fenolová červeň je často součástí komerčně dostupných kultivačních médií, což umožňuje průběžné sledování pH. Při množení buněk způsobují metabolity produkované těmito buňkami posun pH a tím i změnu barvy média. Fenolová červeň má dvojí účinek na barvu média: při kyselém pH ho zbarvuje do žluta a při zásaditém pH do fialova. Při pH 7,4, což je optimální hodnota pro buněčnou kulturu, se médium jeví jako fluorescenčně červené.

Fenolová červeň má však několik nevýhod: Zaprvé je schopna napodobovat působení řady steroidních hormonů, především estrogenu [14]. Proto se při studiu buněk citlivých na estrogen, jako je prsní tkáň, doporučuje používat médium bez fenolové červene. Přítomnost fenolové červeně v několika bezsérových formulacích narušuje rovnováhu sodíku a draslíku. Tomuto účinku lze zabránit přidáním séra nebo hovězího hypofyzárního hormonu do média [15]. Za třetí, přítomnost fenolové červeně ztěžuje detekci v experimentech s průtokovou cytometrií.

Anorganické soli

Média obsahující anorganické soli, jako jsou ionty sodíku, draslíku a vápníku, pomáhají udržovat osmotickou rovnováhu a regulovat membránový potenciál.

Aminokyseliny

Jelikož jsou aminokyseliny základními složkami bílkovin, představují nezbytnou složku každého kultivačního média, které kdy bylo vyvinuto. Protože buňky nejsou schopny některé aminokyseliny samy produkovat, je důležité, aby kultivační médium obsahovalo esenciální aminokyseliny. Jsou nezbytné pro proliferaci buněk a jejich koncentrace určuje maximální hustotu buněk, které lze dosáhnout. Zvláště důležitá je esenciální aminokyselina L-glutamin.

L-glutamin funguje jako sekundární zdroj energie pro metabolismus a dodává dusík pro tvorbu NAD, NADPH a nukleotidů. Vzhledem k tomu, že L-glutamin je nestabilní aminokyselina, která se časem mění na formu, kterou buňky nedokážou využít, musí být do média přidáván.

Kromě toho lze do růstového média přidávat neesenciální aminokyseliny, aby se doplnily ty, které byly během růstového procesu spotřebovány. Doplnění růstového média o neesenciální aminokyseliny podporuje růst buněk a zvyšuje jejich životaschopnost.

Sacharidy

Sacharidy ve formě cukrů jsou hlavním zdrojem energie. Mnohá média kromě běžnějších cukrů, jako jsou glukóza a galaktóza, obsahují také maltózu a fruktózu.

Bílkoviny a peptidy

Nejčastěji používanými bílkovinami a peptidy jsou albumin, transferin a fibronektin. Mají zvláštní význam v médiích, která neobsahují sérum. Albumin, transferin, aprotinin, fetuin a fibronektin patří mezi bílkoviny, které se vyskytují v séru, jenž je bohatým zdrojem bílkovin.

Albumin je hlavní bílkovina v krvi a jeho funkcí je vázat a transportovat různé látky, včetně vody, solí, volných mastných kyselin, hormonů a vitamínů, mezi různými orgány a buňkami. Schopnost albuminu vázat se na chemické látky z něj činí účinný prostředek pro odstraňování škodlivých sloučenin z média, ve kterém se buňky kultivují.

Aprotinin je ochranná látka v systémech buněčných kultur, protože je stabilní při neutrálním i kyselém pH a odolává vysokým teplotám i destrukci, kterou mohou způsobit proteolytické enzymy. Je schopen inhibovat řadu serinových proteáz, mimo jiné i trypsin.

Fetuin je glykoprotein, který lze v séru plodů a novorozenců zvířat detekovat ve vyšších množstvích než v séru dospělých jedinců. Kromě toho působí jako inhibitor serinových proteáz. Protein fibronektin je nezbytnou složkou procesu buněčné adheze. Transferin je protein, který transportuje železo a je zodpovědný za jeho dodávání do buněčných membrán.

Mastné kyseliny a lipidy

Hrají klíčovou roli v bezsérovém médiu, pokud není k dispozici sérum.

Vitamíny

Pro vývoj a proliferaci buněk je nezbytná řada vitamínů. Buňky nedokážou vitamíny produkovat v dostatečném množství, a proto jsou v tkáňových kulturách nezbytné jako doplňky stravy.

V buněčné kultuře je sérum primárním zdrojem vitamínů; média se však také obohacují o různé vitamíny, aby byla vhodná pro konkrétní typ buněk. K stimulaci růstu se nejčastěji používají vitamíny skupiny B.

Stopové prvky

Chemické prvky, jako je měď, zinek, selen a meziprodukty trikarboxylových kyselin, se označují jako stopové prvky. Stopové prvky se často přidávají do médií, která neobsahují sérum, aby nahradily ty, které jsou obvykle přítomny v séru. Tyto prvky jsou důležité chemické složky, které jsou nezbytné pro zdravý vývoj buněk. Mnoho biochemických reakcí závisí na určitých mikroživinách, například na enzymatické aktivitě.

Doplňky kultivačního média

Kompletní růstové médium doporučené pro určité buněčné linie vyžaduje další složky, které v základním médiu a séru chybí. Tyto doplňky stravy podporují buněčný růst a správnou metabolickou funkci.

Ačkoli jsou hormony, růstové faktory a signální molekuly nezbytné pro správnou proliferaci konkrétních buněčných linií, je třeba vždy dodržovat následující opatření: Vzhledem k tomu, že přidání doplňků může změnit osmolalitu kompletního růstového média, což může bránit buněčnému vývoji, je vždy vhodné osmolalitu po přidání doplňků ověřit. U většiny buněčných linií se optimální osmolalita pohybuje v rozmezí 260 až 320 mOSM/kg.

Antibiotika

Antibiotika se často používají k potlačení růstu bakteriálních a plísňových kontaminantů [16], ačkoli pro růst buněk nejsou nezbytná. Vzhledem k tomu, že antibiotika mohou zakrýt kontaminaci mykoplazmami a rezistentními bakteriemi, nedoporučuje se jejich rutinní použití v buněčných kulturách [17, 18].

Kromě toho mohou antibiotika narušit metabolismus hypersenzitivních buněk. Často se používají kombinace penicilinu a streptomycinu od společností MilliporeSigma a Life Technologies. Plasmocin byl použit při kultivaci gliomových buněčných linií TS603, TS516 a BT260 [19] a ukázal se jako účinný při odstraňování kontaminace mykoplazmami (20).

Sérová složka

V séru jsou přítomny albuminy, růstové faktory i inhibitory růstu. Sérum je jednou z nejvýznamnějších složek buněčného kultivačního média, protože poskytuje aminokyseliny, bílkoviny, vitamíny (zejména vitamíny rozpustné v tucích, jako jsou A, D, E a K), sacharidy, lipidy, hormony, růstové faktory, minerály a stopové prvky.

K podpoře vývoje kultivovaných buněk se často využívá sérum z fetálních a telatích zdrojů. Fetální sérum je bohatým zdrojem růstových faktorů a je vhodné pro klonování buněk a vývoj citlivých buněk. Vzhledem ke svým sníženým schopnostem podporovat růst se telátčí sérum používá v experimentech s kontaktní inhibicí. Běžná růstová média často obsahují 2 % až 10 % séra. Přidání séra do kultivačního média slouží k následujícím účelům [21]:

• Sérová složka dodává buňkám nezbytné živiny (jak ve formě roztoku, tak vázané na bílkoviny).

• V séru je obsaženo několik růstových faktorů a hormonů podílejících se na podpoře růstu a specializované buněčné činnosti.

• Obsahuje mnoho vazebných proteinů, jako je albumin a transferin, které transportují další chemické látky do buňky. Například albumin dodává do buněk tuky, vitamíny, hormony atd.

• Poskytuje také proteiny, jako je fibronektin, které zvyšují adhezi buněk k substrátu. Navíc produkuje prvky podporující šíření, které napomáhají expanzi buněk před dělením.

• Dodává inhibitory proteáz, které zabraňují proteolýze v buňkách.

• Obsahuje také minerály, jako jsou Na+, K+, Zn2+ a Fe2+.

• Zvyšuje viskozitu média, čímž chrání buňky před mechanickým poškozením během míchání suspenzní kultury.

• Působí také jako pufr.

Odkazy

[1] Morgan J, Morton H, Parker R. Výživa živočišných buněk v tkáňové kultuře; počáteční studie na syntetickém médiu. Proc Soc Exp Biol Med. 1950;73:1-8

[2] Kerbel R, Blakeslee D. Rychlá adsorpce složky fetálního telecího séra savčími buňkami v kultuře. Potenciální zdroj artefaktů ve studiích antisér proti buněčně specifickým antigenům. Immunology. 1976;31:881-91

[3] Sula K, Draber P, Nouza K. Přidání séra do média používaného k přípravě buněčných suspenzí jako možný zdroj artefaktů v buněčně zprostředkovaných reakcích studovaných pomocí testu popliteální lymfatické uzliny. J Immunogenet. 1980;7:483-9

[4] Mariani E, Mariani A, Monaco M, Lalli E, Vitale M, Facchini A. Komerční bezsérumová média: růst hybridomů a produkce monoklonálních protilátek. J Immunol Methods. 1991;145:175-83

[5] Barnes D, Sato G. Metody pro růst kultivovaných buněk v bezsérovém médiu. Anal Biochem. 1980;102:255-70

[6] Yu H, Lu S, Gasior K, Singh D, Vazquez Sanchez S, Tapia O, et al. Chaperony HSP70 transportují TDP-43 bez RNA do anisotropních intranukleárních tekutých sférických obalů. Science. 2021;371:

[7] Meharena H, Marco A, Dileep V, Lockshin E, Akatsu G, Mullahoo J, a kol. Senescence vyvolaná Downovým syndromem narušuje jadernou architekturu nervových progenitorů. Cell Stem Cell. 2022;29:116–130.e7

[8] Iscove N, Melchers F. Úplná náhrada séra albuminem, transferinem a sójovými lipidy v kulturách B lymfocytů reagujících na lipopolysacharidy. J Exp Med. 1978;147:923-33

[9] Stoll T, Muhlethaler K, von Stockar U, Marison I. Systematické zdokonalování chemicky definovaného bezproteinového média pro růst hybridomů a produkci monoklonálních protilátek. J Biotechnol. 1996;45:111-23

[10] Darfler F. Bezproteinové médium pro růst hybridomů a dalších buněk imunitního systému. In Vitro Cell Dev Biol. 1990;26:769-78

[11] Barnes D, Sato G. Buněčná kultura bez séra: sjednocující přístup. Cell. 1980;22:649-55

[12] Hamilton W, Ham R. Klonální růst buněčných linií čínského křečka v médiích bez bílkovin. In Vitro. 1977;13:537-47

[13] Zigler J, Lepe Zuniga J, Vistica B, Gery I. Analýza cytotoxických účinků kultivačního média obsahujícího HEPES vystaveného světlu. In Vitro Cell Dev Biol. 1985;21:282-7

[14] Berthois Y, Katzenellenbogen J, Katzenellenbogen B. Fenolová červeň v tkáňových kultivačních médiích je slabý estrogen: důsledky pro studium buněk reagujících na estrogen v kultuře. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:2496-500

[15] Karmiol S. Vývoj bezsérových médií. In: Master JRW, ed. Animal Cell culture, 3. vyd. Oxford: Oxford University Press; 2000.

[16] Perlman D. Použití antibiotik v kultivačních médiích. Methods Enzymol. 1979;58:110-6

[17] McGarrity G. Šíření a kontrola mykoplazmatické infekce buněčných kultur. In Vitro. 1976;12:643-8

[18] Masters J, Stacey G. Výměna média a pasážování buněčných linií. Nat Protoc. 2007;2:2276–84

[19] Chakraborty A, Laukka T, Myllykoski M, Ringel A, Booker M, Tolstorukov M, et al. Histonová demethyláza KDM6A přímo vnímá kyslík a reguluje chromatin a osud buněk. Science. 2019;363:1217-1222

[20] Molla Kazemiha V, Azari S, Amanzadeh A, Bonakdar S, Shojaei Moghadam M, Habibi Anbouhi M, a kol. Účinnost přípravku Plasmocin™ na různých savčích buněčných liniích infikovaných mollicuty ve srovnání s běžně používanými antibiotiky v buněčné kultuře: místní zkušenosti. Cytotechnology. 2011;63:609-20

[21] Kragh Hansen U. Molekulární aspekty vazby ligandů na sérový albumin. Pharmacol Rev. 1981;33:17-53