Zellkulturmedien: Ein Überblick

Im Bereich der Biowissenschaften ist die Zellkultur eine der wichtigsten Methoden. Unter dem Begriff „Zellkultur“ versteht man die Entnahme von Zellen, Geweben oder Organen aus einem Tier oder einer Pflanze und die anschließende Einbringung dieser Zellen, Gewebe oder Organe in eine künstliche Umgebung, die für ihr Überleben und/oder Wachstum günstig ist. Die grundlegenden Umweltbedingungen für eine optimale Zellentwicklung sind eine kontrollierte Temperatur, ein Substrat für die Zelladhäsion, ein geeignetes Wachstumsmedium sowie ein Inkubator, der den optimalen pH-Wert und die optimale Osmolalität aufrechterhält. Nur unter diesen Bedingungen können Zellen ihr volles Wachstumspotenzial entfalten.

Die Auswahl eines geeigneten Wachstumsmediums für die In-vitro-Kultivierung ist der Schritt in der Zellkultur, der sowohl am kritischsten als auch am wichtigsten ist. Ein Wachstumsmedium, auch als Kulturmedium bezeichnet, ist eine Flüssigkeit oder ein Gel, das so formuliert ist, dass es die Entwicklung von Organismen auf mikroskopischer, zellulärer oder pflanzenähnlicher Ebene fördert. Das zur Zellkultivierung verwendete Medium enthält häufig eine ausreichende Versorgung mit Energie und Substanzen, die den Zellzyklus steuern. Zu den Hauptbestandteilen eines Kulturmediums gehören Aminosäuren, Vitamine, anorganische Salze, Glukose und Serum. Das Serum wird dem Medium zugesetzt, da es als Quelle für Wachstumsfaktoren, Hormone und Adhäsionsfaktoren dient. Neben der Bereitstellung von Nährstoffen trägt das Medium auch zur Aufrechterhaltung des pH-Werts und der Osmolalität bei.

Arten von Medien, die in der Zellkultur verwendet werden

Sowohl menschliche als auch tierische Zellen können entweder in einem künstlichen oder synthetischen Medium oder in einem vollständig natürlichen Medium, das mit natürlichen Elementen angereichert ist, gezüchtet werden. Im Folgenden geben wir Ihnen einen Überblick über die verschiedenen derzeit verfügbaren Medientypen.

Natürliche Medien

In natürlichen Medien kommen ausschließlich biologische Flüssigkeiten vor, die in ihrem natürlichen Zustand vorliegen. Natürliche Medien sind sehr hilfreich und einfach für die Kultivierung einer breiten Vielfalt tierischer Zelltypen. Das mangelnde Verständnis der genauen Bestandteile, aus denen natürliche Medien bestehen, ist der Hauptfaktor, der zur geringen Reproduzierbarkeit der mit natürlichen Medien erzielten Ergebnisse beiträgt.

Künstliche Medien

Die Herstellung künstlicher oder synthetischer Medien umfasst die Zugabe von Nährstoffen (sowohl organischen als auch anorganischen), Serumproteinen, Kohlenhydraten, Cofaktoren, Vitaminen und Salzen sowie von O₂- und CO₂-Gasphasen [1].

Es wurden verschiedene Arten künstlicher Medien entwickelt, um eine oder mehrere der folgenden Funktionen zu erfüllen: 1) Sofortiges Überleben (eine ausgewogene Salzlösung mit genauem pH-Wert und osmotischem Druck). 2) Langfristiges Überleben (eine ausgewogene Salzlösung, ergänzt durch verschiedene Formulierungen organischer Chemikalien und/oder Serum). 3) Unbegrenzte Entwicklung. 4) Spezielle Funktionen.

Es gibt vier unterschiedliche Klassifizierungen für künstliche Medien:

Serumhaltige Medien

Die häufigste Art von Zusatzstoff in Medien zur Kultivierung tierischer Zellen ist fötales Rinderserum. Es wird dem Kulturmedium als kostengünstiger Zusatz beigemischt, um die bestmöglichen Wachstumsbedingungen zu erzielen. Das Serum dient nicht nur als Transporter oder Chelatbildner für instabile oder wasserunlösliche Nährstoffe, Hormone und Wachstumsfaktoren, Proteaseinhibitoren und andere Substanzen, sondern bindet und neutralisiert auch schädliche Moleküle.

Serumfreies Medium

Das Vorhandensein von Serum in den Medien birgt eine Reihe von Nachteilen und kann in der immunologischen Forschung zu erheblichen Fehlinterpretationen führen [2, 3]. Es wurden bereits verschiedene serumfreie Medien entwickelt [4, 5]. Diese Medien sind in der Regel speziell auf die Kultivierung eines einzelnen Zelltyps abgestimmt, wie beispielsweise „Knockout Serum Replacement“ und „Knockout DMEM“ von Thermo Fisher Scientific sowie das mTESR-Medium von Stem Cell Technologies [6] für Stammzellen [7].

Zudem enthalten diese Medien definierte Mengen an gereinigten Wachstumsfaktoren, Lipoproteinen und anderen Proteinen, die andernfalls typischerweise durch das Serum bereitgestellt werden [8]. Diese Medien werden oft als „definierte Kulturmedien“ bezeichnet, da die Bestandteile, aus denen sie bestehen, gut bekannt sind.

Chemisch definierte Medien

Diese Medien enthalten hochreine anorganische und organische Komponenten, die keinerlei Verunreinigungen aufweisen. Sie können auch reine Proteinzusätze wie Wachstumsfaktoren enthalten.

 Die genetische Modifikation von Bakterien oder Hefen führt in Verbindung mit der Zugabe bestimmter Fettsäuren, Vitamine, Cholesterin und Aminosäuren zur Produktion ihrer Bestandteile [9].

Proteinfreie Medien

Proteinfreie Medien sind solche, die überhaupt kein Protein enthalten, sondern ausschließlich nicht-proteinhaltige Bestandteile. Im Vergleich zu Medien mit Serumzusatz fördert die Verwendung von Medien ohne Proteinzusatz eine stärkere Zellproliferation und Proteinexpression und erleichtert die Aufreinigung von Produkten, die in einem nachgelagerten Prozess entstehen [10–12]. In Formulierungen wie MEM und RPMI-1640 ist kein Protein enthalten. Bei Bedarf kann jedoch ein Proteinzusatz verabreicht werden.

Kulturmedien und ihre Grundbestandteile

Kommerzielle Kulturmedien sind als Pulver oder in flüssiger Form erhältlich und enthalten häufig eine Vielzahl von Nährstoffen wie Aminosäuren, Glukose, Salze, Vitamine und andere Nahrungsergänzungsmittel. 

Der Bedarf an diesen Komponenten ist für jede Zelllinie unterschiedlich, und diese Unterschiede sind für die große Anzahl verschiedener Medienformulierungen verantwortlich. Jede Komponente erfüllt eine bestimmte Funktion, die in den folgenden Abschnitten erläutert wird:

Puffersysteme

Um optimale Wachstumsbedingungen aufrechtzuerhalten, muss der pH-Wert geregelt werden, was häufig durch eines von zwei Puffersystemen erfolgt:

Natürliches Puffersystem

Das CO₂/H₂CO₃-Verhältnis in der Atmosphäre entspricht dem des Mediums, wodurch ein natürlicher Puffermechanismus entsteht. Um diesen natürlichen Puffermechanismus zu erhalten, müssen die Kulturen in einer Luftumgebung mit 5–10 % CO₂ gehalten werden, was häufig durch den Einsatz eines CO₂-Inkubators erreicht wird. Einer der größten Vorteile der Verwendung eines natürlichen Puffers ist, dass er kostengünstig und sicher ist.

HEPES

Die chemische Pufferung mit dem Zwitterion HEPES weist im pH-Bereich von 7,2–7,4 eine höhere Pufferkapazität auf und erfordert keine regulierte Gasatmosphäre. Für bestimmte Zelltypen kann eine höhere HEPES-Dosis schädlich sein. HEPES-haltige Medien sind zudem wesentlich anfälliger für die phototoxischen Wirkungen von Leuchtstofflicht [13].

Phenolrot

Der pH-Indikator Phenolrot ist häufig in handelsüblichen Kulturmedien enthalten und ermöglicht eine kontinuierliche Überwachung des pH-Werts. Durch das Wachstum der Zellen bewirken die von diesen Zellen produzierten Stoffwechselprodukte eine Verschiebung des pH-Werts und damit eine Farbveränderung des Mediums. Phenolrot hat einen doppelten Effekt auf die Farbe des Mediums: Bei saurem pH-Wert färbt es sich gelb, bei alkalischem pH-Wert violett. Bei einem pH-Wert von 7,4 – dem optimalen Wert für die Zellkultur – erscheint das Medium fluoreszierend rot.

Phenolrot weist jedoch einige Nachteile auf: Erstens kann Phenolrot die Wirkung einer Reihe von Steroidhormonen, vor allem von Östrogen, simulieren [14]. Daher wird bei der Untersuchung östrogensensitiver Zellen wie Brustgewebe ein phenolrotfreies Medium empfohlen. In mehreren serumfreien Formulierungen wird das Natrium-Kalium-Gleichgewicht durch das Vorhandensein von Phenolrot gestört. Die Zugabe von Serum oder Rinderhypophysenhormon zum Medium kann diesem Effekt entgegenwirken [15]. Drittens wird der Nachweis in durchflusszytometrischen Experimenten durch das Vorhandensein von Phenolrot erschwert.

Anorganische Salze

Medien, die anorganische Salze wie Natrium-, Kalium- und Kalziumionen enthalten, tragen zur Aufrechterhaltung des osmotischen Gleichgewichts bei und regulieren das Membranpotenzial.

Aminosäuren

Da Aminosäuren die Grundbausteine von Proteinen sind, sind sie ein wesentlicher Bestandteil jedes jemals entwickelten Zellwachstumsmediums. Da Zellen bestimmte Aminosäuren nicht selbst produzieren können, ist es wichtig, dass das Kulturmedium essentielle Aminosäuren enthält. Sie sind für die Zellproliferation notwendig, und ihre Konzentration bestimmt die maximal erreichbare Zelldichte. Insbesondere L-Glutamin, eine essentielle Aminosäure, ist von entscheidender Bedeutung.

L-Glutamin dient als sekundäre Energiequelle für den Stoffwechsel und liefert Stickstoff für die Produktion von NAD, NADPH und Nukleotiden. Da L-Glutamin eine instabile Aminosäure ist, die sich mit der Zeit in eine Form umwandelt, die von den Zellen nicht verwertet werden kann, muss es dem Medium zugeführt werden.

Darüber hinaus können nicht essentielle Aminosäuren dem Medium zugeführt werden, um diejenigen wieder aufzufüllen, die während des Wachstumsprozesses verbraucht wurden. Das Wachstum der Zellen wird gefördert und ihre Lebensfähigkeit erhöht, wenn das Wachstumsmedium mit nicht essentiellen Aminosäuren angereichert wird.

Kohlenhydrate

Kohlenhydrate in Form von Zuckern sind die wichtigste Energiequelle. Viele Medien enthalten neben den gängigeren Zuckern Glukose und Galaktose auch Maltose und Fruktose.

Proteine und Peptide

Albumin, Transferrin und Fibronektin sind die am häufigsten verwendeten Proteine und Peptide. Sie sind besonders wichtig in Medien, die kein Serum enthalten. Albumin, Transferrin, Aprotinin, Fetuin und Fibronektin gehören zu den Proteinen, die im Serum vorkommen können, das eine reichhaltige Proteinquelle darstellt.

Albumin ist das Hauptprotein im Blut und hat die Aufgabe, verschiedene Substanzen – darunter Wasser, Salze, freie Fettsäuren, Hormone und Vitamine – zu binden und zwischen verschiedenen Organen und Zellen zu transportieren. Die Fähigkeit von Albumin, sich an chemische Substanzen zu binden, macht es zu einem wirksamen Mittel, um schädliche Verbindungen aus dem Kulturmedium zu entfernen.

Aprotinin ist ein Schutzmittel in Zellkultursystemen, da es bei neutralem und saurem pH-Wert stabil sowie resistent gegen hohe Temperaturen und die durch proteolytische Enzyme verursachte Zerstörung ist. Es ist in der Lage, eine Reihe von Serinproteasen, darunter unter anderem Trypsin, zu hemmen.

Fetuin ist ein Glykoprotein, das im Serum von Föten und Neugeborenen im Vergleich zum Serum von Erwachsenen in höheren Mengen nachgewiesen werden kann. Darüber hinaus wirkt es als Serinprotease-Inhibitor. Das Protein Fibronektin ist ein wesentlicher Bestandteil des Zelladhäsionsprozesses. Transferrin ist ein Protein, das Eisen transportiert und für die Zufuhr von Eisen zu den Zellmembranen verantwortlich ist.

Fettsäuren und Lipide

Sie spielen eine entscheidende Rolle in serumfreiem Medium, wenn kein Serum vorhanden ist.

Vitamine

Zahlreiche Vitamine sind für die Zellentwicklung und -proliferation notwendig. Vitamine können von den Zellen nicht in ausreichenden Mengen produziert werden und sind daher in der Gewebekultur als Nahrungsergänzungsmittel unverzichtbar.

In der Zellkultur ist das Serum die Hauptquelle für Vitamine; Medien werden jedoch auch mit verschiedenen Vitaminen angereichert, um sie für einen bestimmten Zelltyp geeignet zu machen. Am häufigsten werden Vitamine der B-Gruppe zur Wachstumsförderung eingesetzt.

Spurenelemente

Chemische Elemente wie Kupfer, Zink, Selen und Zwischenprodukte der Tricarbonsäure werden als Spurenelemente bezeichnet. Spurenelemente werden häufig Medien zugesetzt, die kein Serum enthalten, um diejenigen zu ersetzen, die typischerweise im Serum vorhanden sind. Diese Elemente sind wichtige chemische Bestandteile, die für eine gesunde Zellentwicklung erforderlich sind. Viele biochemische Reaktionen, wie beispielsweise die Enzymaktivität, hängen von bestimmten Mikronährstoffen ab.

Mediumzusätze

Das für bestimmte Zelllinien empfohlene vollständige Wachstumsmedium benötigt zusätzliche Komponenten, die im Basismedium und im Serum nicht enthalten sind. Diese Nahrungsergänzungsmittel unterstützen das Zellwachstum und eine angemessene Stoffwechselfunktion.

Obwohl Hormone, Wachstumsfaktoren und Signalmoleküle für die ordnungsgemäße Proliferation bestimmter Zelllinien unerlässlich sind, sollten stets die folgenden Vorsichtsmaßnahmen beachtet werden: Da die Zugabe von Zusätzen die Osmolalität des vollständigen Wachstumsmediums verändern kann, was die Zellentwicklung hemmen kann, ist es stets ratsam, die Osmolalität nach der Zugabe von Zusätzen zu überprüfen. Für die meisten Zelllinien liegt die optimale Osmolalität zwischen 260 und 320 mOSM/kg.

Antibiotika

Antibiotika werden häufig eingesetzt, um das Wachstum von bakteriellen und pilzlichen Kontaminanten zu hemmen [16], obwohl sie für das Zellwachstum nicht unbedingt erforderlich sind. Da Antibiotika eine Kontamination durch Mykoplasmen und resistente Bakterien verschleiern können, wird von ihrem routinemäßigen Einsatz in der Zellkultur abgeraten [17, 18].

Zudem können Antibiotika den Stoffwechsel empfindlicher Zellen stören. Häufig werden die von MilliporeSigma und Life Technologies hergestellten Penicillin-Streptomycin-Kombinationen verwendet. Plasmocin wurde bei der Kultivierung der Gliom-Zelllinien TS603, TS516 und BT260 eingesetzt [19] und hat sich bei der Beseitigung von Mykoplasmenkontaminationen als wirksam erwiesen (20).

Serum

Im Serum sind Albumine, Wachstumsfaktoren und Wachstumshemmer enthalten. Serum ist einer der wichtigsten Bestandteile des Zellkulturmediums, da es Aminosäuren, Proteine, Vitamine (insbesondere fettlösliche Vitamine wie A, D, E und K), Kohlenhydrate, Lipide, Hormone, Wachstumsfaktoren, Mineralstoffe und Spurenelemente liefert.

Serum aus fötalen und Kälberquellen wird häufig verwendet, um die Entwicklung von Kulturzellen zu fördern. Fötales Serum ist eine reichhaltige Quelle für Wachstumsfaktoren und eignet sich für das Klonen von Zellen sowie für die Entwicklung empfindlicher Zellen. Aufgrund seiner geringeren wachstumsfördernden Eigenschaften wird Kälberserum in Kontaktinhibitionsexperimenten eingesetzt. Normale Wachstumsmedien enthalten oft 2 % bis 10 % Serum. Die Zugabe von Serum zum Kulturmedium dient folgenden Zwecken [21]:

• Das Serum liefert die für die Zellen essenziellen Nährstoffe (sowohl in gelöster Form als auch an Proteine gebunden).

• Das Serum enthält verschiedene Wachstumsfaktoren und Hormone, die an der Wachstumsförderung und der spezifischen Zellaktivität beteiligt sind.

• Es enthält zahlreiche Bindungsproteine wie Albumin und Transferrin, die andere Substanzen in die Zelle transportieren. So befördert beispielsweise Albumin Fette, Vitamine, Hormone usw. in die Zellen.

• Es liefert zudem Proteine wie Fibronektin, die die Zelladhäsion am Substrat erhöhen. Darüber hinaus enthält es Ausbreitungsfaktoren, die die Zellausdehnung vor der Teilung unterstützen.

• Es liefert Proteaseinhibitoren, die die Proteolyse in den Zellen verhindern.

• Es enthält außerdem Mineralstoffe wie Na+, K+, Zn²⁺ und Fe²⁺.

• Es erhöht die Viskosität des Mediums und schützt so die Zellen vor mechanischen Schäden während des Rührens in der Suspensionskultur.

• Es wirkt zudem als Puffer.

Literaturhinweise

[1] Morgan J, Morton H, Parker R. Ernährung tierischer Zellen in der Gewebekultur; erste Untersuchungen an einem synthetischen Medium. Proc Soc Exp Biol Med. 1950;73:1–8

[2] Kerbel R, Blakeslee D. Schnelle Adsorption einer Komponente des fötalen Kälberserums durch Säugetierzellen in Kultur. Eine potenzielle Quelle für Artefakte bei Untersuchungen von Antiseren gegen zellspezifische Antigene. Immunology. 1976;31:881-91

[3] Sula K, Draber P, Nouza K. Die Zugabe von Serum zum Medium für die Herstellung von Zellsuspensionen als mögliche Quelle für Artefakte bei zellvermittelten Reaktionen, untersucht mittels des Popliteal-Lymphknotentests. J Immunogenet. 1980;7:483-9

[4] Mariani E, Mariani A, Monaco M, Lalli E, Vitale M, Facchini A. Kommerzielle serumfreie Medien: Hybridomwachstum und Produktion monoklonaler Antikörper. J Immunol Methods. 1991;145:175–83

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[7] Meharena H, Marco A, Dileep V, Lockshin E, Akatsu G, Mullahoo J, et al. Durch das Down-Syndrom induzierte Seneszenz stört die Kernarchitektur neuraler Vorläuferzellen. Cell Stem Cell. 2022;29:116–130.e7

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[9] Stoll T, Muhlethaler K, von Stockar U, Marison I. Systematische Verbesserung eines chemisch definierten, proteinfreien Mediums für das Hybridomwachstum und die Produktion monoklonaler Antikörper. J Biotechnol. 1996;45:111-23

[10] Darfler F. Ein proteinfreies Medium für das Wachstum von Hybridomen und anderen Zellen des Immunsystems. In Vitro Cell Dev Biol. 1990;26:769-78

[11] Barnes D, Sato G. Serumfreie Zellkultur: ein einheitlicher Ansatz. Cell. 1980;22:649–55

[12] Hamilton W, Ham R. Klonales Wachstum von Zelllinien des chinesischen Hamsters in proteinfreien Medien. In Vitro. 1977;13:537-47

[13] Zigler J, Lepe Zuniga J, Vistica B, Gery I. Analyse der zytotoxischen Wirkungen von lichtbestrahltem, HEPES-haltigem Kulturmedium. In Vitro Cell Dev Biol. 1985;21:282-7

[14] Berthois Y, Katzenellenbogen J, Katzenellenbogen B. Phenolrot in Gewebekulturmedien ist ein schwaches Östrogen: Implikationen für die Untersuchung von östrogenempfindlichen Zellen in Kultur. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:2496–500

[15] Karmiol S. Entwicklung serumfreier Medien. In: Master JRW, Hrsg. Animal Cell Culture, 3. Aufl. Oxford: Oxford University Press; 2000.

[16] Perlman D. Einsatz von Antibiotika in Zellkulturmedien. Methods Enzymol. 1979;58:110-6

[17] McGarrity G. Ausbreitung und Bekämpfung von Mykoplasmeninfektionen in Zellkulturen. In Vitro. 1976;12:643–8

[18] Masters J, Stacey G. Medienwechsel und Passagierung von Zelllinien. Nat Protoc. 2007;2:2276–84

[19] Chakraborty A, Laukka T, Myllykoski M, Ringel A, Booker M, Tolstorukov M, et al. Die Histon-Demethylase KDM6A erfasst Sauerstoff direkt, um das Chromatin und das Zellschicksal zu steuern. Science. 2019;363:1217–1222

[20] Molla Kazemiha V, Azari S, Amanzadeh A, Bonakdar S, Shojaei Moghadam M, Habibi Anbouhi M, et al. Wirksamkeit von Plasmocin™ bei verschiedenen, mit Mollicutes infizierten Säugetierzelllinien im Vergleich zu häufig in der Zellkultur verwendeten Antibiotika: eine lokale Erfahrung. Cytotechnology. 2011;63:609–20

[21] Kragh Hansen U. Molekulare Aspekte der Ligandenbindung an Serumalbumin. Pharmacol Rev. 1981;33:17–53