Johdanto

Ba/F3-solut, joka tunnetaan myös synonyymeillä BA/F3, BaF3, BAF3 ja Baf3 (Cellosaurus-rekisterinumero CVCL_0161), on hiirestä peräisin oleva, interleukiini-3:sta (IL-3) riippuvainen pro-B-solulinja, joka on peräisin luuytimestä. Palacios ja Steinmetz kuvasivat linjan ensimmäisen kerran vuonna 1985 osana jatkuvasti proliferoituvien, IL-3-riippuvien luuydin-kloonien joukkoa, jotka kantoivat B-solujen sukulaisuusmerkkiä B-220 ja säilyttivät immunoglobuliinigeeninsä sukusolukonfiguraatiossa. ^[19] Alun perin linjan ilmoitettiin olevan peräisin BALB/c-hiirestä, mutta myöhemmin tehdyn SNP-matriisiprofilointitutkimuksen perusteella todettiin, että linja on itse asiassa peräisin C3H-hiirestä. ^[1] Kehittämisestään lähtien Ba/F3-solut ovat nousseet yhdeksi laajimmin käytetyistä mallijärjestelmistä hematopoieettisen signalointitutkimuksen ja syöpälääkkeiden kehittämisen alalla. Niiden eloonjääminen ja lisääntyminen riippuvat täysin IL-3:sta, mikä tekee niistä poikkeuksellisen puhtaan alustan: onkogeenisen kinaasin tai fuusioproteiinin lisääminen tekee soluista tekijästä riippumattomia, mikä tarjoaa tehokkaan ja mitattavissa olevan tuloksen. Tutkijat hyödyntävät tätä ominaisuutta rutiininomaisesti BCR-ABL-fuusioproteiinien, FLT3-mutaatioiden, JAK2-fuusioiden ja monien muiden kliinisesti merkittävien kinaasi-onkogeenien karakterisoimiseksi sekä pienimolekyylisten kinaasi-inhibiittorien profiilointiin suurikapasiteettisissa menetelmissä.

Tärkeimmät kohdat

• Ba/F3 on C3H-hiiren luuytimestä peräisin oleva, IL-3:sta riippuvainen pro-B-solulinja, joka on rekisteröity Cellosaurus-tietokantaan tunnuksella CVCL_0161.
• IL-3:n poistaminen tarjoaa tiukan valintakokeen: emosolut kuolevat, kun taas solut, jotka ilmentävät aktiivista onkogeenistä kinaasia – tai mitä tahansa muuta rakennetta, joka tuottaa jatkuvaa kasvusignaalia – selviävät ja lisääntyvät.
• Tätä solulinjaa on käytetty laajasti BCR-ABL-fuusioproteiinien, FLT3-mutaatioiden, JAK–STAT-signalointireitin sekä sytokiinireseptorien biologian tutkimiseen.
• Ba/F3-solut soveltuvat yhä paremmin kinaasi-inhibiittorien suurikapasiteettiseen seulontaan, minkä vuoksi ne ovat kohdennettujen syöpälääkkeiden kehittämisen kulmakivi. ^[2]
• Ba/F3-solulinjasta on tuotettu satoja johdannaissolulinjoja, joissa on määriteltyjä onkogeenisiä mutaatioita ja jotka kattavat EGFR-, ALK-, ROS1-, RET-, NTRK-, FLT3- ja monet muut kliinisesti merkittävät kohteet.

Mikä on Ba/F3?

Ba/F3 on tekijästä riippuvainen hiiren pro-B-solulinja, joka on peräisin C3H-hiiren luuytimestä; luovuttajan sukupuolta ja ikää ei ole kirjattu Cellosaurus-tietokantaan tämän linjan osalta. Emolinjassa ei ole tunnettuja aktivoivia kinaasimutaatioita, ja se tarvitsee eloonjäämisensä kannalta eksogeenistä IL-3:a. Sen kaksinkertaistumisaika on noin 20 tuntia tavanomaisissa viljelyolosuhteissa. Linjan tärkein tunnusmerkki on sen tiukka riippuvuus IL-3:sta, mikä tarkoittaa, että kaikki geneettiset manipulaatiot, jotka mahdollistavat tekijästä riippumattoman kasvun, voidaan havaita nopeasti ja yksiselitteisesti. Tämä ominaisuus yhdistettynä sekoittavien endogeenisten kinaasimutaatioiden puuttumiseen on tehnyt Ba/F3-soluista välttämättömän työkalun kinaasifuusioiden, pistemutaatioiden ja konstitutiivisesti aktiivisten signalointimolekyylien onkogeenisen potentiaalin selvittämiseen sekä hematopoieettisten että kiinteiden kasvainten biologiassa. On syytä huomata, että mutaatioiden puuttuminen ei tarkoita geneettisesti puhdasta taustaa: Cellosaurus tallentaa myös tämän solulinjan osalta SNP-array-menetelmällä saatuja variaatiotietoja.

SNP-mikroarray-analyysi oikaisi tämän linjan alkuperää koskevan pitkään vallinneen virheellisen tulkinnan. Aikaisemmassa kirjallisuudessa Ba/F3:n kuvattiin polveutuvan BALB/c-hiirestä, mutta genomin analyysi vahvisti sen C3H-alkuperän. ^[1] Tutkimuksessa tarkastelluista 99 hiiren solulinjasta Ba/F3 oli ainoa linja, jonka geneettinen tausta ei vastannut sen ilmoitettua alkuperäistä kantaa; tämä ristiriita vahvistettiin riippumattomasti linjan jakelijan RIKENin toimesta, ja morfologinen vertailu muihin C3H-peräisiin linjoihin osoitti, että Ba/F3 on erillinen solulinja eikä ristisaastumisen tulos. Tämä havainto korostaa rutiininomaisen solulinjojen autentikoinnin tärkeyttä, erityisesti hiirilinjojen osalta, joissa pelkkä STR-profiilointi ei välttämättä riitä sisäsiitoskantojen erottamiseen toisistaan. Ba/F3-solulinjaa käyttävien tutkijoiden tulisi viitata Cellosaurus-rekisterinumeroon CVCL_0161 varmistaakseen yksiselitteisen tunnistamisen julkaisuissa.

Soluviljelyä koskevat tiedot

Ba/F₃-kennojen edut

Ba/F3-solujen merkittävin etu on niiden kaksitilainen, IL-3:sta riippuva eloonjäämiskytkin. IL-3:n puuttuessa alkuperäiset Ba/F3-solut käyvät nopeasti läpi apoptoosin. Onkogeenisen kinaasin tai fuusioproteiinin lisääminen pelastaa solut kuolemalta, mikä mahdollistaa stabiilisti transformoituneiden kloonien suoraviivaisen valinnan ilman monimutkaisia raportointirakenteita. Tätä ominaisuutta on hyödynnetty lukuisissa määritystavoissa, klassisista pesäkkeiden eloonjäämismäärityksistä moderneihin suurikapasiteettisiin proliferaatioseulontoihin yhdisteiden profilointia varten. ^[2] Tulosten tulkinnan yksinkertaisuus ja luotettavuus tekevät Ba/F3-pohjaisista määrityksistä laajalti käytetyn ensivaiheen järjestelmän kinaasi-inhibiittorien tehokkuuden luokittelemiseksi, vaikka absoluuttiset tehokkuusarvot riippuvatkin edelleen käytetystä määrityksestä ja laboratoriosta, minkä vuoksi niitä tulisi verrata eri tutkimusten välillä varovaisesti. ^[21]

Ba/F3-solut ovat myös geneettisesti muokattavissa ja niitä on helppo transfektoida tai transdukoida. Retroviraalinen, lentiviraalinen ja elektroporointiin perustuva ekspressiokonstruktien siirto tuottavat kaikki tehokkaasti stabiilisti ilmentäviä alalinjoja. Tämä on mahdollistanut satojen johdannaislinjojen luomisen, jotka kantavat kliinisesti merkityksellisiä mutaatioita kohteissa kuten EGFR, FLT3, BCR-ABL, EML4-ALK ja RET, sekä monissa muissa. Emolinjassa ei esiinny sekoittavia endogeenisiä kinaasimutaatioita, mikä takaa, että fenotyyppiset vasteet johtuvat nimenomaan siirretystä transgeenistä. Lisäksi noin 20 tunnin kaksinkertaistumisaika mahdollistaa nopean kokeellisen läpimenon, mikä lyhentää määritysaikoja huomattavasti hitaammin kasvaviin primaarisoluviljelmiin verrattuna.

Ba/F3-alusta on osoittautunut erityisen sopivaksi signaalisekvenssien löytämiseen. Kojima ja Kitamura hyödynsivät jatkuvasti aktiivista sytokiinireseptorikonstruktia ohjaamaan Ba/F3-solujen kasvun riippuvuuden signaalipeptidiä sisältävien proteiinien solupinnalle lokalisoitumiseen, mikä mahdollisti laajamittaisen cDNA-seulonnan erittyvien ja kalvoon kohdistuvien geenituotteiden tunnistamiseksi. ^[3] Tämä luova sovellus havainnollistaa, kuinka Ba/F3-solujen IL-3-riippuvuutta voidaan hyödyntää paljon laajemmin kuin pelkästään kinaasi-onkogeenien tutkimuksessa, mikä tekee solulinjasta monipuolisen geneettisen seulonta-alustan.

Ba/F₃-solujen rajoitukset

Lukuisista eduistaan huolimatta Ba/F3-soluilla on luontaisia biologisia rajoituksia, jotka on otettava huomioon kokeellisia tuloksia tulkittaessa. Hiiren pro-B-solulinjana niiltä puuttuu monia signaalinvälittäjiä ja koreseptoreita, joita esiintyy ihmisen syöpäsoluissa. Ba/F3-soluissa havaitut inhibiittorien tehoarvot ja niiden jälkeiset signalointivasteet eivät välttämättä heijasta tarkasti aktiivisuutta primaarisissa ihmisen kasvainsoluissa tai potilaalta peräisin olevassa materiaalissa. Esimerkiksi keuhkojen adenokarsinooman kohdennettujen hoitojen resistenssiä tutkivien tutkijoiden on vahvistettava Ba/F3-pohjaiset havainnot fysiologisesti merkityksellisimmissä ihmisen solumalleissa ennen kliinisten johtopäätösten tekemistä.

Myös tämän linjan genomin taustasta on annettu virheellisiä kuvauksia. Vuosikymmenten ajan Ba/F3:n katsottiin olevan peräisin BALB/c-linjasta, mutta SNP-array-profiilointi osoitti, että se on peräisin C3H-hiirestä. ^[1] Samassa tutkimuksessa havaittiin aneuploidian merkkejä noin 42 prosentissa tutkituista hiirisolulinjoista, mukaan lukien huomattava osa linjoista, jotka oli peräisin normaalikudoksesta eikä kasvainkudoksesta; itse Ba/F3-linja merkittiin virheellisen tunnistuksen vuoksi eikä kopioiden lukumäärän muutoksen vuoksi, mutta yleinen havainto osoittaa, kuinka helposti karyotyyppinen muutos kertyy viljelyssä. Tällainen epävakaus suurilla viljelykerroksilla voi vaikuttaa signalointituloksiin, lääkeherkkyysmittauksiin ja transformoituneiden fenotyyppien toistettavuuteen. Tutkijoiden tulisi siksi työskennellä pienillä viljelykerroksilla ja todentaa solukantonsa säännöllisesti.

Lopuksi on todettava, että Ba/F3-solut eivät jäljittele täysin hematologisissa pahanlaatuisissa sairauksissa esiintyvää kasvaimen mikroympäristöä tai stromaalisia vuorovaikutuksia. Niiltä puuttuu myös monien ihmisen signalointikomponenttien endogeeninen ilmentyminen, mikä tarkoittaa, että onkogeenin toiminnalle tärkeät koreseptorivuorovaikutukset saattavat puuttua tai poiketa todellisesta. Monimutkaisten, useista alayksiköistä koostuvien sytokiinireseptorien tai glykosylaatiosta riippuvaa signalointia vaativien reseptorien tutkimuksissa saatetaan tarvita täydentäviä ihmisen solujärjestelmiä, jotta voidaan tehdä biologisesti päteviä johtopäätöksiä. Näistä varauksista huolimatta Ba/F3-solut ovat edelleen tehokas ja laajalti hyväksytty ensisijainen työkalu kinaasibiologiassa.

Katso täydelliset tekniset tiedot ja tilaa

Sovellukset

Kinaasien lääkekehitys ja onkogeenien seulonta

Ba/F3-solut ovat nousseet hallitsevaksi solualustaksi kinaaseihin kohdistuvassa lääkekehityksessä. Warmuth ja kollegat esittivät kattavan arvion Ba/F3-järjestelmästä tässä tarkoituksessa ja kuvasivat, kuinka IL-3-riippumattomuustesti voidaan mukauttaa suurikapasiteettisiin menetelmiin, jotta voidaan arvioida sekä kinaasimutaatioiden onkogeenistä potentiaalia että pienimolekyylisten kinaasi-inhibiittorien kykyä kääntää tekijästä riippumaton kasvu. ^[2]Katsauksessa korostettiin, että Ba/F3-solut sopivat huomattavan laajalle valikoimalle onkogeenisiä kinaaseja, mikä tekee niistä yleispätevän alustan syöpään liittyvien kinomivariaanttien alustavalle profilointille ennen siirtymistä monimutkaisempiin ihmisen solumalleihin.

Kojiman ja Kitamuran kehittämä signaalisekvenssiansa otti osoitti, että Ba/F3-soluja voidaan käyttää paitsi kinaasi-onkogeenitutkimuksiin myös toiminnallisten cDNA-kirjastojen seulontaan. ^[3]Yhdistämällä konstitutiivisesti aktiivisen sytokiinireseptorin signaalipeptidin toimintaan yksi ainoa pilottikoe tuotti 150 aiemmin tunnettua kloonia – jotka kaikki koodasivat erittyviä tai solupinnan proteiineja – sekä 48 uutta cDNA-kloonia, mukaan lukien tyypin II membraaniproteiineja, jotka olivat jääneet huomaamatta aikaisemmissa signaalisekvenssipyydysstrategioissa. Tämä lähestymistapa havainnollistaa Ba/F3-alustan skaalautuvuutta perinteisen lääkekohteiden validoinnin ulkopuolelle.

Cellosaurukseen nyt luetteloitujen Ba/F3-johdannaislinjojen äärimmäinen monimuotoisuus – joka kattaa satoja EGFR-variantteja, ALK-fuusioita, RET-uudelleenjärjestelyjä, NTRK-fuusioita ja resistenssimutaatioita – korostaa, kuinka emolinja Ba/F3 on tullut täsmäonkologian tutkimuksen perustaksi. Jokainen johdannaislinja säilyttää puhtaan IL-3-riippuvaisen taustan ja lisää siihen yhden määritellyn geneettisen muuttujan, mikä mahdollistaa systemaattiset rakenne–aktiivisuus-suhdetutkimukset solutasolla.

FLT3-mutaatiot ja akuutti myelooinen leukemia

Yksi Ba/F3-solujen merkittävimmistä sovelluksista on ollut FLT3-mutaatioiden (fms-tyyppinen tyrosiinikinaasi 3) karakterisointi akuutissa myelooisessa leukemiassa (AML). FLT3:n sisäinen tandemduplikaatio on yksi AML:n yleisimmistä onkogeenisistä vaurioista, ja sitä raportoidaan noin 20–30 prosentissa tapauksista kohortista ja havaitsemismenetelmästä riippuen. ^[4][20]Hayakawa ja kollegat osoittivat, että kahteen IL-3-riippuvaiseen solulinjaan (32D ja Ba/F3) tuotu tandemduplikoitunut FLT3 aktivoi jatkuvasti sekä STAT5:n että MAP-kinaasia ja mahdollistaa itsenäisen, IL-3:sta riippumattoman kasvun, kun taas villityyppinen FLT3 tuki vain vähäistä proliferaatiota jopa jatkuvan ligandin stimulaation alaisena.^[4] Tämä merkkitapahtumana pidetty tutkimus vakiinnutti Ba/F3-solut ensisijaiseksi toiminnalliseksi testijärjestelmäksi FLT3-mutaatioiden validoimiseksi, ja se on edelleen metodologinen viitekehys alalla.

Myöhemmät tutkimukset ovat laajasti perustuneet tähän pohjaan. Ydinfukosylaatiota koskevat tutkimukset osoittivat, että Fut8-geenin CRISPR/Cas9-knockout villityyppistä FLT3:a ilmentävissä Ba/F3-soluissa riitti ajamaan IL-3-riippumatonta proliferaatiota — vaikutusta, jota ei havaittu emosoluissa — ja siihen liittyi lisääntynyt tyrosiinifosforylaatio sekä STAT5:n, AKT:n ja ERK:n aktivaatio sekä ligandista riippumaton FLT3-dimerisaatio.^[20] Tämä paljasti glykosylaatioon perustuvan säätelymekanismin, jota ei aiemmin ollut tunnistettu tämän reseptorin osalta. FLT3-estäjän gilteritinibin resistenssiä on tutkittu myös Ba/F3 FLT3-ITD-malleissa, joissa resistenssin kehittyminen kliinisesti saavutettavissa olevilla lääkeainepitoisuuksilla vaati tyypillisesti useita sekundaarisia mutaatioita, joista useat olivat aiemmin raportoimattomia. ^[21]Samassa tutkimuksessa arvioitiin systemaattisesti Ba/F3 FLT3-ITD-mallien vahvuuksia ja rajoituksia ja todettiin, että vaikka alusta soveltuu hyvin resistenssimutaatioiden tunnistamiseen ja luokitteluun, se ei jäljittele monimutkaista luuytimen mikroympäristöä, joka muokkaa resistenssiä potilailla.

BCR-ABL-biologia ja krooninen myelooinen leukemia

BCR-ABL-fuusioproteiineilla transfektoidut Ba/F3-solut ovat olleet keskeisessä asemassa kroonisen myelooisen leukemian (CML) molekyylibiologian ymmärtämisessä. Canitrot ja kollegat käyttivät p190- ja p210-BCR-ABL-isoformeja ilmentäviä Ba/F3-soluja osoittaakseen, että BCR-ABL aiheuttaa mutaattorifenotyypin, joka lisää spontaanien mutaatioiden esiintymistiheyttä kolmesta viiteen kertaan verrattuna emosoluihin, ja että tämä genominen epävakaus liittyi DNA-polymeraasi beetan lisääntyneeseen ilmentymiseen. ^[6]Tämä havainto tarjosi mekanismin, jonka avulla BCR-ABL saattaa edistää taudin etenemistä kroonisesta vaiheesta akuuttiin myelooiseen leukemiaan.

Uemura ja hänen kollegansa tutkivat Ba/F3-soluissa adapteriproteiinia CRKL:ää, joka on yksi tärkeimmistä tyrosiinifosfoproteiineista CML-potilaiden leukemiaisissa neutrofiileissä. ^[7]Täyspitkää CRKL:ää yli-ilmentävät solut osoittivat lisääntynyttä adheesiota fibronektiiniin ja muuttunutta morfologiaa fibronektiinillä päällystetyillä pinnoilla, kun taas deleetiomutantit, joilta puuttui joko SH2- tai N-terminaalinen SH3-domaiini, eivät osoittaneet näitä ominaisuuksia – mikä viittaa siihen, että molemmat domeenit ovat välttämättömiä tämän vaikutuksen aikaansaamiseksi. Adheesio estyi anti-beeta1-integriini-vasta-aineen vaikutuksesta, vaikka CRKL:n yli-ilmentyminen ei muuttanut beeta1-integriinin pinta-ilmentymistä eikä spontaanisti indusoinut sen aktivaatioepitooppia. Nämä kokeet viittaavat siihen, että CRKL on mukana signaalinvälitysketjuissa, jotka säätelevät integriinin välittämää adheesiota BCR-ABL:n alapuolella.

Yhteenvetona nämä BCR-ABL-tutkimukset osoittavat, kuinka Ba/F3-solut mahdollistavat onkogeenin ohjaaman signalointireitin selkeän erittelyn poistamalla endogeenisen kinaasiaktiivisuuden monimutkaisuuden. Alusta tukee edelleen BCR-ABL-estäjien resistenssimutaatioiden karakterisointia, ja käytettävissä on nyt erityisiä Ba/F3-BCR-ABL- ja BCR-ABL-T315I-johdannaislinjoja estäjien suoraan profilointiin kliinisesti merkityksellisten resistenssigenotyyppien yhteydessä.

JAK–STAT-signalointireitit

Ba/F3-solut ovat toimineet ensisijaisena mallina sen selvittämisessä, mitkä sytokiinireseptoreiden alavirran signalointitapahtumat ovat tosiasiallisesti välttämättömiä solujen kasvulle. Liu ja kollegat rakensivat kimeerisen molekyylin (beta/JAK2), joka koostui betac-proteiinin solunulkoisesta ja transmembraanisesta osasta fuusioituna JAK2:een, ja ilmentivät sitä Ba/F3-soluissa. ^[8]Kimeerinen molekyyli oli jatkuvasti fosforyloitunut, ja se riitti ohjaamaan IL-3:sta riippumatonta selviytymistä ja proliferaatiota. Huomionarvoista oli, että STAT5:tä, Shc:tä ja SHP-2:ta ei fosforyloitu näissä soluissa eikä beeta-kaseiinin ja c-fos-promoottorin aktiivisuutta vahvistettu, kun taas c-myc-transkriptio oli jatkuvasti aktivoitunut. Kirjoittajat päättelivät, että pelkkä JAK2:n aktivaatio riittää eloonjäämiseen ja proliferaatioon ja että STAT5:n ja MAP-kinaasin aktivaatiota ei tarvita näiden tiettyjen vaikutusten aikaansaamiseksi — mikä on hyödyllinen muistutus siitä, että tekijästä riippumaton kasvu Ba/F3-soluissa ei sinänsä tarkoita STAT:n aktivaatiota.

Jaster ja kollegat tutkivat STAT5:n roolia IFN-alfa-signaloinnissa Ba/F3-soluissa ja osoittivat, että IFN-alfa aktivoi STAT5A:n ja STAT5B:n DNA:han sitoutumista, mutta että IL-3 on huomattavasti tehokkaampi molempien isoformien indusoija. ^[9]Dominantti-negatiivinen JAK2-mutaatio esti IL-3:n, mutta ei IFN-alfa:n, aiheuttamaa STAT5:n aktivaatiota, mikä paljasti, että nämä kaksi sytokiinia käyttävät toisistaan riippumattomia ylävirran mekanismeja päätyäkseen samaan transkriptiotekijään; kirjoittajat päättelivät kuitenkin, että STAT5 ei ole keskeinen tekijä IFN-alfa-signaloinnissa tässä järjestelmässä.

Konstitutiivista JAK–STAT-aktivaatiota on mallinnettu Ba/F3-soluissa käyttämällä TEL–JAK2-fuusioproteiinia, joka on T-solujen akuuttiin lymfoblastiseen leukemiaan liittyvä onkogeeninen fuusio. Ho ja kollegat osoittivat, että TEL:n pointed-domeenin fuusio toiminnalliseen JAK2-kinaasidomeeniin (JH1) muutti Ba/F3-solut tekijästä riippumattomiksi, kun taas fuusio pseudokinaasidomeeniin (JH2) tai kinaasi-inaktiiviseen JH1-domeeniin ei aiheuttanut tätä muutosta; aktiiviset konstruktit aiheuttivat STAT1:n, STAT3:n ja STAT5:n konstitutiivisen tyrosiinifosforylaation.^[5] Viime aikoina on havaittu, että metotreksaatti estää TEL–JAK2:n aiheuttamaa STAT3:n ja STAT5:n fosforylaatiota Ba/F3-soluissa foolihapon aineenvaihdunnasta riippuvaisen mekanismin kautta: vaikutus kumoutui foliniinihapolla, toistui dihydrofolaattireduktaasin CRISPR/Cas9-knockoutilla eikä sitä jäljitelty 5-fluorourasiililla. ^[22]

Gingras ja kollegat tutkivat STAT6:n välittämää IL-4-signalointia ja osoittivat, että p300/CBP-koaktivaattorit ovat välttämättömiä STAT6:n välittämälle transkriptioinduktiolle ja että p300/CBP:n yli-ilmentyminen tehostaa IL-4:n ohjaamaa raportointigeenin aktiivisuutta. ^[10]Suurin osa tästä tutkimuksesta tehtiin COS7- ja HeLa-soluissa; Ba/F3-solut tarjosivat keskeisen endogeenisen todisteen, nimittäin natiivin STAT6:n ja CBP:n yhteisimmunopresipitaation.

Sytokiinireseptorien signalointi ja hematopoieettisten solujen biologia

GM-CSF/IL-3/IL-5-reseptorijärjestelmä on kartoitettu laajasti Ba/F3-soluilla. Itoh ja kollegat suorittivat systemaattisen mutaatioanalyysin yhteisen beeta-alayksikön (betac) kahdeksasta sytoplasmisesta tyrosiinijäämästä ilmentämällä sarjaa tyrosiini-fenyylialaniini-mutaatioita yhdessä villityyppisen ihmisen alfa-alayksikön kanssa Ba/F3-soluissa selvittääkseen, mitkä jäämät välittävät spesifisiä signaalituloksia. ^[12]Tarkastellessaan rinnakkaista mutageneesisarjaa Okuda ja kollegat raportoivat, että kaikkien kahdeksan sytoplasmisen tyrosiinijäämän mutaatio GMR-beeta-alayksikössä vähensi itse reseptorin, SHP2:n ja SHC:n fosforylaatiota, mutta ei estänyt lyhytaikaista proliferaatiosignalointia eikä JAK2:n ja STAT5:n fosforylaatiota, mikä havainnollisti reseptoridomeenien toimintojen hierarkiaa. ^[13]RON-reseptorityrosiinikinaasin osoitettiin aktivoivan IL-3-beeta-reseptorireitin Ba/F3-soluissa indusoidakseen morfologisia muutoksia, joihin liittyi F-aktinin uudelleenjakautumista ja ainutlaatuisia tumamuutoksia, mikä paljasti vuorovaikutuksen reseptorityrosiinikinaasi- ja sytokiinireseptorijärjestelmien välillä. ^[14]

Myös IL-2-reseptorin alidomeenivaatimuksia on tutkittu. Transfektoitujen Ba/F3-solulinjojen avulla Hunt ja kollegat tunnistivat IL-2-reseptorin beeta-ketjun happaman domeenin ja kalvoon läheisen seriinirikkaan alueen välttämättömiksi p38- ja p54-MAP-kinaasien aktivoitumiselle, jolloin Tyr338 – Shc:n sitoutumiskohta – toimii kriittisenä välittäjänä. ^[11]Koska happoalue ei ole välttämätön IL-2:n ohjaamalle proliferaatiolle, kirjoittajat päättelivät, ettei p38- eikä p54-MAP-kinaasin aktivaatiota itse asiassa tarvita IL-2:n ohjaamassa Ba/F3-solujen kasvussa; tämä erottelu pätee myös primaarisiin T-soluihin.

Myös hematopoieettisten esisolujen solusyklin säätelyä on tutkittu Ba/F3-solujen avulla. Mahmud ja kollegat osoittivat, että TGF-beta1 hidasti G1-vaiheesta S-vaiheeseen siirtymistä Ba/F3-soluissa, ja he liittivät tämän kasvun hidastumisen Bcl-2-proteiinin ja CDK-inhibiittori p27:n ilmentymisen lisääntymiseen. ^[15]Levings ja kollegat tutkivat IL-4:n synergiaa aktivoituneen Raf-1:n kanssa Ba/F3-solujen pitkäaikaisen proliferaation aikaansaamiseksi. He havaitsivat, että IL-4 yksinään ei kyennyt tukemaan kasvua, mutta se pystyi toimimaan yhdessä aktivoituneen Ras- tai Raf-1-proteiinin kanssa ylläpitämään jatkuvaa proliferaatiota, joka oli verrattavissa IL-3:n vaikutukseen. ^[16]

Muunneltuja reseptorinvaihtojärjestelmiä on hyödynnetty Ba/F3-solujen IL-3-riippuvuuden avulla geeniterapiasovelluksissa. Kume ja kollegat kehittivät bakteerin gyraasi B:hen fuusioidun G-CSF-reseptorin (GcrGyr), jossa dimeroituva antibiootti kumermysiini laukaisi IL-3:sta riippumattoman Ba/F3-solujen proliferaation. Tämä toimi proof-of-concept-tyyppisenä selektiivisenä vahvistajagenijärjestelmänä geneettisesti muunnettujen hematopoieettisten solujen lisäämiseksi. ^[17]Vastaavasti IL-11:n ja liukoisen IL-11-reseptorin fuusioproteiinin osoitettiin toimivan superagonistina gp130:llä transfektoiduissa Ba/F3-soluissa, joista puuttui membraaniin sitoutunut IL-11-reseptori-alfa, mikä osoitti, että liukoiset reseptorikomponentit voivat toiminnallisesti korvata transmembraaniset alayksiköt. ^[18]

Johtopäätös

Ba/F3-solut (CVCL_0161) edustavat yhtä nykyaikaisen biolääketieteellisen tutkimuksen monipuolisimmista ja laajimmin validoiduista hiirisolulinja-alustoista. Niiden tiukka IL-3-riippuvuus tarjoaa tyylikkään ja toistettavan toiminnallisen testimenetelmän onkogeenisille kinaaseille — mukaan lukien BCR-ABL-fuusioproteiinit, FLT3-mutaatiot, sekä JAK2-fuusioita – sekä pienimolekyylisiä kinaasi-inhibiittoreita, joilla on kliinistä merkitystä kroonisen myelooisen leukemian, akuutin myelooisen leukemian, esisolujen lymfoblastisen leukemian ja lymfooman sekä keuhkojen adenokarsinooman hoidossa. Vuosikymmenten tutkimustyö on vahvistanut JAK–STAT-signaloinnin, sytokiinireseptoribiologian ja hematopoieettisten solujen säätelyn olevan Ba/F3-solulinjan keskeisiä sovellusalueita. Solulinjan mukautuvuus on mahdollistanut satojen johdannaismallien luomisen, joissa on määriteltyjä resistenssimutaatioita, mikä tekee siitä korvaamattoman kohdennetun hoidon kehittämisessä. Jos haluatte perustaa tai laajentaa kinaasibiologian tai lääkekehitysohjelmaanne, Ba/F3-soluja on saatavilla osoitteessa cytion.com – käykää tuotesivulla tiedustelemassa tai tekemässä tilaus jo tänään.

Tärkeimmät julkaisut

1. Didion JP, Buus RJ, Naghashfar Z (2014) Hiirisolulinjojen SNP-array-profilointi tunnistaa niiden alkuperäiset kannat ja paljastaa ristikontaminaatiota sekä laajalle levinnyttä aneuploidiaa. BMC Genomics. PMID: 25277546
2. Warmuth M, Kim S, Gu XJ (2007) Ba/F3-solut ja niiden käyttö kinaasilääkekehityksessä. Current Opinion in Oncology. PMID: 17133113
3. Kojima T, Kitamura T (1999) Konstitutiivisesti aktiiviseen sytokiinireseptoriin perustuva signaalisekvenssiansa. Nature Biotechnology. PMID: 10331810
4. Hayakawa F, Towatari M, Kiyoi H (2000) Tandem-duplikoitu Flt3 aktivoi jatkuvasti STAT5:tä ja MAP-kinaasia ja saa aikaan itsenäisen solujen kasvun IL-3-riippuvaisissa solulinjoissa. Oncogene. PMID: 10698507
5. Ho JM, Beattie BK, Squire JA (1999) Ets-transkriptiotekijän TEL:n fuusio Jak2:n kanssa johtaa konstitutiiviseen Jak-Stat-signalointiin. Blood. PMID: 10361134
6. Canitrot Y, Lautier D, Laurent G (1999) BCR–ABL:llä transfektoitujen Ba/F3-solulinjojen mutaattorifenotyyppi ja sen yhteys DNA-polymeraasi beetan lisääntyneeseen ilmentymiseen. Oncogene. PMID: 10348341
7. Uemura N, Salgia R, Ewaniuk DS (1999) Adapteriproteiinin CRKL:n osuus integriinivälitteisessä adheesiossa. Oncogene. PMID: 10362355
8. Liu CB, Itoh T, Arai K (1999) JAK2:n konstitutiivinen aktivaatio mahdollistaa BA/F3-solujen interleukiini-3:sta riippumattoman selviytymisen ja proliferaation. The Journal of Biological Chemistry. PMID: 10037724
9. Jaster R, Tschirch E, Bittorf T (1999) STAT5:n rooli interferoni-alfa-signaalinsiirrossa BA/F3-soluissa. Cellular Signalling. PMID: 10376805
10. Gingras S, Simard J, Groner B (1999) p300/CBP on välttämätön interleukiini-4:n indusoimalle transkriptiolle ja se on vuorovaikutuksessa Stat6:n kanssa. Nucleic Acids Research. PMID: 10373589
11. Hunt AE, Lali FV, Lord JD (1999) Interleukiini (IL)-2-reseptorin beeta-ketjun alidomeenien ja Shc:n rooli p38-mitogeenin aktivoiman proteiinin (MAP) kinaasin ja p54-MAP-kinaasin aktivoinnissa. The Journal of Biological Chemistry. PMID: 10066828
12. Itoh T, Liu R, Arai K (1999) Yhteisen reseptorin beeta-alayksikön tyrosiinijäämien erilainen vaikutus ihmisen GM-CSF:n indusoimiin moniin signaaleihin. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. PMID: 10329850
13. Okuda K, Foster R, Griffin JD (1999) GM-CSF/IL-3/IL-5-reseptorin beeta-C-ketjun signalointialueet. Annals of the New York Academy of Sciences. [Katsaus] PMID: 10372132
14. Mera A, Suga M, Ando M (1999) Solun muodon muutosten indusointi interleukiini-3:n yhteisen beeta-ketjun reseptorin aktivoinnin kautta RON-reseptorityyppisellä tyrosiinikinaasilla. The Journal of Biological Chemistry. PMID: 10336478
15. Mahmud N, Katayama N, Nishii K (1999) Bcl-2:n mahdollinen osallisuus hematopoieettisten solujen solusyklin etenemisen säätelyssä transformoivan kasvutekijän beeta-1:n välityksellä. British Journal of Haematology. PMID: 10233423
16. Levings MK, Bessette DC, Schrader JW (1999) Interleukiini-4 toimii synergistisesti Raf-1:n kanssa edistääkseen c-jun N-terminaalisen kinaasin pitkäaikaista proliferaatiota ja aktivaatiota. Blood. PMID: 10339476
17. Kume A, Ito K, Ueda Y (1999) G-CSF-reseptorin ja gyrase B:n fuusiogeeni: uudenlainen molekyylikytkin geneettisesti muunnettujen hematopoieettisten solujen lisääntymiselle. Biochemical and Biophysical Research Communications. PMID: 10381335
18. Pflanz S, Tacken I, Grötzinger J (1999) Interleukiini-11:n ja liukoisen interleukiini-11-reseptorin fuusioproteiini toimii superagonistina gp130:tä ilmentävissä soluissa. FEBS Letters. PMID: 10350068
19. Palacios R, Steinmetz M (1985) IL-3-riippuvaiset hiirikloonit, jotka ilmentävät B-220-pinta-antigeeniä, sisältävät Ig-geenejä sukusolukon konfiguraatiossa ja tuottavat B-lymfosyyttejä in vivo. Cell. PMID: 3924409
20. Duan C, Fukuda T, Isaji T (2020) Ydinfukosylaation puute aktivoi FLT3-ilmentymisestä riippuvaa solusignalointia Ba/F3-solujärjestelmässä. The FASEB Journal. PMID: 31908039
21. Yang J, Friedman R (2025) Ba/F3-solujen vahvuudet ja rajoitukset FLT3:n ohjaaman AML-resistenssin mallintamisessa. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. PMID: 41183623
22. Saito M, Takeda K, Yoshino M (2026) Metotreksaatti estää TEL-JAK2-STAT-signaalireittiä foolihappometaboliaan perustuvan mekanismin kautta Ba/F3-soluissa. International Immunopharmacology. PMID: 42287956