Sissejuhatus

Ba/F3-rakud, mida tuntakse ka sünonüümide BA/F3, BaF3, BAF3 ja Baf3 all (Cellosaurus’e registreerimisnumber CVCL_0161), on hiire luuüdist pärinev interleukiin-3 (IL-3)-sõltuv pro-B-rakuliin. Seda liini kirjeldasid esmakordselt Palacios ja Steinmetz 1985. aastal pidevalt paljunevate, IL-3-sõltuvate luuüdi kloonide rühma hulgas, mis kandsid B-rakkude liini markerit B-220 ja säilitasid oma immunoglobuliinigeenid sugurakkude konfiguratsioonis. ^[19] Esialgu väideti, et see pärineb BALB/c hiirest, kuid hilisem SNP-maatriksi analüüs näitas, et tegelikult on see liin tuletatud C3H hiirest. ^[1] Alates nende väljatöötamisest on Ba/F3-rakud muutunud üheks kõige laialdasemalt kasutatavaks mudelisüsteemiks vereloome signaalimise uurimisel ja onkoloogiliste ravimite väljatöötamisel. Nende ellujäämise ja proliferatsiooni range sõltuvus IL-3-st muudab need rakud erakordselt puhtaks uurimisplatvormiks: onkogeense kinaasi või fusioonvalgu sisseviimine muudab rakud faktorist sõltumatuks, pakkudes võimsat ja kvantifitseeritavat tulemust. Teadlased kasutavad seda omadust rutiinselt BCR-ABL-fusioonvalkude, FLT3-mutatsioonide, JAK2-fusioonide ja paljude teiste kliiniliselt oluliste kinaasi-onkogeenide iseloomustamiseks, samuti väikemolekuliliste kinaasiinhibiitorite profiilide koostamiseks suure läbilaskevõimega meetoditega.

Peamised järeldused

• Ba/F3 on C3H-hiire luuüdist saadud IL-3-sõltuv hiire pro-B-rakuliin, mis on registreeritud Cellosaurus’e kataloogis numbri CVCL_0161 all.
• IL-3 eemaldamine võimaldab läbi viia ranget selektsioonikatse: vanemrakud surevad, samas kui rakud, mis ekspresseerivad aktiivset onkogeenset kinaasi – või mis tahes muud konstrukti, mis annab konstitutiivset kasvusignaali –, jäävad ellu ja paljunevad.
• Seda rakuliini on laialdaselt kasutatud BCR-ABL-fusioonvalkude, FLT3-mutatsioonide, JAK–STAT-signaalimise ja tsütokiiniretseptorite bioloogia uurimiseks.
• Ba/F3-rakud sobivad üha paremini kinaasiinhibiitorite suure läbilaskevõimega sõelumiseks, mistõttu on need muutunud sihtotstarbeliste vähiravimite väljatöötamise nurgakiviks. ^[2]
• Ba/F3-st on loodud sadu tuletatud rakuliine, millel on kindlaksmääratud onkogeensed mutatsioonid, hõlmates EGFR-i, ALK-i, ROS1-i, RET-i, NTRK-i, FLT3-i ja paljusid teisi kliiniliselt olulisi sihtmärke.

Mis on Ba/F₃?

Ba/F3 on faktorist sõltuv hiire pro-B-rakuliin, mis on loodud C3H-hiire luuüdist; doonori sugu ja vanus ei ole selle liini puhul Cellosaurus andmebaasis registreeritud. Emaliinil ei esine teadaolevaid aktiveeriva kinaasi mutatsioone ning selle ellujäämiseks on vaja eksogeenset IL-3-d. Selle rakkude kahekordistumisaeg on standardsetes kultiveerimistingimustes ligikaudu 20 tundi. Liini peamine eristav tunnus on selle range sõltuvus IL-3-st, mis tähendab, et mis tahes geneetilist manipuleerimist, mis tagab faktorist sõltumatu kasvu, on võimalik kiiresti ja üheselt tuvastada. See omadus koos segavate endogeensete kinaasimutatsioonide puudumisega on teinud Ba/F3-rakkudest asendamatu vahendi kinaasifusioonide, punktmutatsioonide ja konstitutiivselt aktiivsete signaalmolekulide onkogeense potentsiaali analüüsimiseks nii vereloome- kui ka tahkete kasvajate bioloogias. Tuleb märkida, et mutatsioonide märkimata jätmine ei tähenda sama, mis geneetiliselt puhas taust: Cellosaurus salvestab selle liini kohta ka SNP-maatriksist saadud variatsioonianalüüsi andmeid.

SNP-maatriksi profiili koostamine parandas selle liini päritolu kohta pikka aega valitsenud eksiarvamust. Varasemates allikates kirjeldati Ba/F3-t kui BALB/c hiirest pärinevat, kuid genoomianalüüs kinnitas selle C3H päritolu. ^[1] Selles uuringus uuritud 99 hiire rakuliinist oli Ba/F3 ainus liin, mille geneetiline taust ei vastanud selle kohta avaldatud päritolutüvele; seda lahknevust kinnitas sõltumatult ka liini levitaja RIKEN ning morfoloogiline võrdlus teiste C3H-st pärinevate liinidega näitas, et Ba/F3 on eraldiseisev rakuliin, mitte ristkontaminatsiooni tulemus. See leid rõhutab rutiinse rakuliinide autentimise tähtsust, eriti hiireliinide puhul, kus STR-profiili määramine üksi võib olla ebapiisav sissekasvatatud tüvede eristamiseks. Ba/F3-d kasutavad teadlased peaksid viitama Cellosaurusele registreerimisnumbriga CVCL_0161, et tagada publikatsioonides selge identifitseerimine.

Teave rakukultuuride kohta

Ba/F₃-elementide eelised

Ba/F3-rakkude olulisim eelis on nende kaheosaline, IL-3-st sõltuv ellujäämislüliti. IL-3 puudumisel läbivad algsed Ba/F3-rakud kiiresti apoptoosi. Onkogeense kinaasi või fusioonvalgu sisseviimine päästab rakud surmast, võimaldades stabiilselt transformeeritud kloonide lihtsat valimist ilma keeruliste reporterkonstruktsioonideta. Seda omadust on kasutatud arvukates analüüsimeetodites, alates klassikalistest koloonia ellujäämisanalüüsidest kuni kaasaegseteni suure läbilaskevõimega proliferatsioonisõelumisteni ühendite profiilide määramiseks. ^[2] Tulemuste lugemise lihtsus ja usaldusväärsus teevad Ba/F₃-põhistest analüüsidest laialdaselt kasutatava esmase hindamissüsteemi kinaasiinhibiitorite toime tugevuse järjestamiseks, kuigi absoluutsed toime tugevuse väärtused sõltuvad ikkagi konkreetsest analüüsist ja laborist ning neid tuleks uuringute vahel võrrelda ettevaatlikult. ^[21]

Ba/F3-rakud on samuti geneetiliselt muudetavad ning neid on lihtne transfekteerida või transduktsioonile allutada. Retroviirus-, lentiviirus- ja elektroporatsioonipõhine ekspressioonikonstruktide sisseviimine annab tõhusalt stabiilselt ekspresseerivaid alaliine. See on võimaldanud luua sadu derivaatliine, mis kannavad kliiniliselt olulisi mutatsioone sihtmärkides nagu EGFR, FLT3, BCR-ABL, EML4-ALK ja RET, ning paljudes teistes. Emaliinis segavate endogeensete kinaasimutatsioonide puudumine tagab, et fenotüübilised reaktsioonid on seotud konkreetselt sisseviidud transgeeniga. Lisaks toetab ligikaudu 20-tunnine kahekordistumisaeg kiiret eksperimentaalse läbilaskevõimet, lühendades analüüside ajakava märkimisväärselt võrreldes aeglasemalt kasvavate esmaste rakukultuuridega.

Ba/F3-platvorm on osutunud eriti sobivaks signaaljärjestuste avastamise rakendustele. Kojima ja Kitamura kasutasid konstitutiivselt aktiivset tsütokiiniretseptori konstrukti, et suunata Ba/F3-rakkude kasvu sõltuvus signaalpeptiidi sisaldavate valkude rakupinnale lokaliseerumisest, võimaldades suuremahulist cDNA-sõelumist sekreteeritud ja membraanile suunatud geenitoodete identifitseerimiseks. ^[3] See loominguline rakendus näitab, kuidas Ba/F3-rakkude IL-3-sõltuvust saab kasutada palju laiemalt kui lihtsalt kinaasi-onkogeenide uurimisel, muutes selle rakuliini mitmekülgseks geneetilise sõelumise platvormiks.

Ba/F₃-rakkude piirangud

Hoolimata oma paljudest eelistest on Ba/F3-rakkudel olemuslikud bioloogilised piirangud, mida tuleb eksperimentaalsete andmete tõlgendamisel arvesse võtta. Kuna tegemist on hiire pro-B-rakuliiniga, puuduvad neil paljud signaaladaptoorid ja ko-retseptorid, mis on olemas inimese vähirakkudes. Ba/F3-rakkudes täheldatud inhibiitorite toime tugevus ja sellele järgnevad signaalimisreaktsioonid ei pruugi täpselt kajastada aktiivsust primaarsetes inimese kasvajarakkudes või patsiendilt pärit materjalis. Näiteks kopsu adenokartsinoomi sihtterapiate resistentsust uurivad teadlased peavad enne kliiniliste järelduste tegemist valideerima Ba/F3-põhiseid tulemusi füsioloogiliselt asjakohasemates inimrakkude mudelites.

Ka selle liini genoomilist tausta on valesti iseloomustatud. Mitmeid kümnendeid peeti Ba/F3 päritoluks BALB/c, kuid SNP-maatriksi analüüs näitas, et see pärineb C3H-hiirest. ^[1] Samas uuringus leiti aneuploidia tunnuseid ligikaudu 42% uuritud hiire rakuliinidest, sealhulgas märkimisväärne osa liinidest, mis olid saadud pigem normaal- kui kasvajakoest; Ba/F3 puhul märgiti pigem valet identifitseerimist kui koopiaarvu muutust, kuid üldine leid näitab, kui kergesti koguneb kultuuris kariotüübi triiv. Selline ebastabiilsus suurel passaažiarvul võib mõjutada signaalimise tulemusi, ravimite tundlikkuse mõõtmisi ja transformeeritud fenotüüpide reprodutseeritavust. Seetõttu peaksid teadlased töötama madala passaažiarvuga ja oma rakuliine regulaarselt autentima.

Lõpuks ei kajasta Ba/F3-rakud täielikult kasvajate mikrokeskkonda ega stromaalseid vastasmõjusid, mis esinevad hematoloogilistes pahaloomulistes kasvajates. Neis puudub ka paljude inimese signaalikomponentide endogeenne ekspressioon, mis tähendab, et onkogeeni funktsioonile olulised ko-retseptori vastasmõjud võivad puududa või olla erinevad. Komplekssete mitme alarühma tsütokiiniretseptorite või glükosüleerimisest sõltuvat signaalimist vajavate retseptorite uuringutes võib bioloogiliselt kehtivate järelduste saavutamiseks olla vaja täiendavaid inimrakkude süsteeme. Hoolimata nendest piirangutest on Ba/F3-rakud endiselt võimas ja laialdaselt tunnustatud esmane vahend kinaasibioloogias.

Vaata täielikke tehnilisi andmeid ja telli

Rakendused

Kinaaside ravimite avastamine ja onkogeenide sõelumine

Ba/F3-rakud on muutunud domineerivaks rakulise platvormiks kinaasidele suunatud ravimite avastamisel. Warmuth ja kolleegid esitasid selle eesmärgi jaoks Ba/F3-süsteemi põhjaliku hinnangu, kirjeldades, kuidas IL-3-sõltumatuse analüüsi saab kohandada suure läbilaskevõimega formaatidele, et hinnata nii kinaasimutatsioonide onkogeenset potentsiaali kui ka väikemolekuliliste kinaasiinhibiitorite võimet pöörata tagasi faktorist sõltumatu kasvu. ^[2]Ülevaates rõhutati, et Ba/F3-rakud sobivad märkimisväärselt laia onkogeensete kinaaside spektri uurimiseks, muutes need universaalseks platvormiks vähiga seotud kinaasivariantide esialgseks profiilimiseks enne üleminekut keerukamatele inimrakkude mudelitele.

Kojima ja Kitamura poolt välja töötatud signaaljärjestuse lõks näitas, et Ba/F3-rakke saab kasutada mitte ainult kinaasi-onkogeenide uurimiseks, vaid ka funktsionaalse cDNA-raamatukogu sõelumiseks. ^[3]Ühendades konstitutiivselt aktiivse tsütokiiniretseptori signaalpeptiidi funktsiooniga, andis üksainus pilooteksperiment 150 varem teadaolevat klooni – mis kõik kodeerivad sekreteeritud või rakupinnal asuvaid valke – ning 48 uut cDNA-klooni, sealhulgas II tüüpi membraanvalke, mis olid varasemate signaaljärjestuse lõksustrateegiate käest pääsenud. See lähenemisviis illustreerib Ba/F3-platvormi skalpeeruvust, mis ulatub kaugemale klassikalisest ravimisihtmärkide valideerimisest.

Cellosaurusesse nüüd kataloogitud Ba/F3 derivaatliinide äärmine mitmekesisus – hõlmates sadu EGFR-i variante, ALK-fusioone, RET-ümberkorraldusi, NTRK-fusioone ja resistentsusmutatsioone – rõhutab, kuidas emaliin Ba/F3 on muutunud täppisonkoloogia uurimistöö alusraamistikuks. Iga tuletatud liin säilitab puhta IL-3-sõltuva taustsüsteemi, lisades samal ajal ühe kindlaksmääratud geneetilise muutuja, mis võimaldab süstemaatilisi struktuuri-aktiivsuse seoste uuringuid raku tasandil.

FLT3-mutatsioonid ja äge müeloidne leukeemia

Üks Ba/F3-rakkude mõjukamaid rakendusi on olnud FLT3 (fms-sarnane türosiinkinaas 3) mutatsioonide iseloomustamine ägedas müeloidleukeemias (AML). FLT3 sisemine tandemduplikatsioon on üks sagedasemaid onkogeenseid kahjustusi AML-is, mida esineb sõltuvalt uuringurühmast ja tuvastusmeetodist ligikaudu 20–30% juhtudest. ^[4][20]Hayakawa ja kolleegid näitasid, et tandemduplikatsiooniga FLT3, mis viidi sisse kahte IL-3-sõltuvasse rakuliini 32D ja Ba/F3, aktiveerib konstitutiivselt nii STAT5-d kui ka MAP-kinaasi ning annab autonoomse, IL-3-st sõltumatu kasvu, samas kui looduslik FLT3 toetas isegi pideva ligandi stimuleerimise korral vaid minimaalset proliferatsiooni.^[4] See murranguline uuring kinnitas Ba/F3-rakke peamise funktsionaalse analüüsisüsteemina FLT3-mutatsioonide valideerimiseks ning on siiani selle valdkonna metodoloogiline etalon.

Järgnevad uuringud on sellele alusele ulatuslikult tuginenud. Tuumafukosüleerimise uuringud näitasid, et Fut8-geeni CRISPR/Cas9-knockout looduslikku tüüpi FLT3-d ekspresseerivates Ba/F3-rakkudes oli piisav, et esile kutsuda IL-3-sõltumatu proliferatsiooni – mõju, mida vanemrakkudes ei täheldatud –, millega kaasnes suurenenud türosiini fosforüleerimine ning STAT5, AKT-i ja ERK-i aktiveerimisega ning ligandist sõltumatu FLT3 dimerisatsiooniga.^[20] See paljastas glükosüleerimise kaudu toimuva regulatsiooni tasandi, mida selle retseptori puhul varem ei olnud tähele pandud. FLT3-inhibiitori gilteritinibi suhtes resistentsust on uuritud ka Ba/F3 FLT3-ITD mudelites, kus resistentsuse tekkimine kliiniliselt saavutatavatel ravimikontsentratsioonidel nõudis tavaliselt mitmeid sekundaarseid mutatsioone, millest mitmed olid varem teatamata jäänud. ^[21]Samas uurimistöös kaaluti süstemaatiliselt Ba/F3 FLT3-ITD-mudelite tugevaid külgi ja piiranguid, märkides, et kuigi platvorm sobib hästi resistentsusmutatsioonide tuvastamiseks ja järjestamiseks, ei suuda see jäljendada keerukat luuüdi nišši, mis kujundab resistentsust patsientidel.

BCR-ABL-i bioloogia ja krooniline müeloidleukeemia

BCR-ABL-fusioonvalkudega transfekteeritud Ba/F3-rakud on olnud olulised kroonilise müeloidse leukeemia (CML) molekulaarbioloogia mõistmisel. Canitrot ja kolleegid kasutasid p190 ja p210 BCR-ABL-isovorme ekspresseerivaid Ba/F3-rakke, et näidata, et BCR-ABL annab mutatsioonifenotüübi, suurendades spontaansete mutatsioonide sagedust kolm kuni viis korda võrreldes vanemrakkudega, ning et see genoomiline ebastabiilsus oli seotud DNA-polümeraasi beeta suurenenud ekspressiooniga. ^[6]See avastus selgitas mehhanismi, mille kaudu BCR-ABL võib soodustada haiguse progresseerumist kroonilise faasi CML-ist ägedaks müeloidseks leukeemiaks.

Uemura ja kolleegid uurisid Ba/F3-rakkudes adaptervalku CRKL, mis on üks peamisi türosiinifosfoproteiine CML-patsientide leukeemilistes neutrofiilides. ^[7]Täispikkuses CRKL-i üleväljendavad rakud näitasid suurenenud adhesiiooni fibronektiini suhtes ja muutunud morfoloogiat fibronektiiniga kaetud pindadel, samas kui SH2- või N-terminaalse SH3-domeeni puudumisega deleetsioonmutandid seda ei teinud – mis viitab sellele, et mõlemat domeeni on selle toime saavutamiseks vaja. Adhesiooni blokeeris anti-beeta1-integriini antikeha, kuigi CRKL-i üleväljendamine ei muutnud beeta1-integriini pinnal avaldumist ega indutseerinud spontaanselt selle aktiveerimise epitoopi. Need katsed viitavad CRKL-i osalusele signaaliteedes, mis reguleerivad integriini vahendatud adhesiooni BCR-ABL-ist allavoolu.

Kokkuvõttes näitavad need BCR-ABL-uuringud, kuidas Ba/F3-rakud võimaldavad onkogeeni poolt juhitava signaalimise selget analüüsimist, kõrvaldades endogeense kinaasi aktiivsuse keerukuse. Platvorm toetab jätkuvalt BCR-ABL-inhibiitorite suhtes resistentsust põhjustavate mutatsioonide iseloomustamist, kusjuures spetsiaalsed Ba/F3 BCR-ABL-i ja BCR-ABL-T315I derivaatliinid on nüüd kättesaadavad inhibiitorite otseseks profiilimiseks kliiniliselt oluliste resistentsusgenotüüpide kontekstis.

JAK–STAT signaaliteed

Ba/F3-rakud on olnud peamiseks mudeliks, et selgitada välja, millised tsütokiiniretseptoritest allavoolu aset leidvad signaalimisprotsessid on kasvu jaoks tegelikult vajalikud. Liu ja kolleegid konstrueerisid kimeerilise molekuli (beta/JAK2), mis koosnes betac-i ekstratsellulaarsest ja transmembraansest piirkonnast, mis oli ühendatud JAK2-ga, ning ekspresseerisid seda Ba/F3-rakkudes. ^[8]Kimeer oli konstitutiivselt fosforüleeritud ja piisav IL-3-st sõltumatu ellujäämise ja proliferatsiooni soodustamiseks. Tähelepanuväärne oli, et STAT5, Shc ja SHP-2 nendes rakkudes fosforüleeritud ei olnud ning beeta-kaseiini ja c-fos promootori aktiivsust ei suurendatud, samas kui c-myc transkriptsioon oli konstitutiivselt aktiveeritud. Autorid järeldasid, et ellujäämiseks ja proliferatsiooniks piisab ainuüksi JAK2 aktiveerimisest ning et STAT5 ja MAP-kinaasi aktiveerimine ei ole nende konkreetsete tulemuste saavutamiseks vajalik – see on kasulik meeldetuletus, et faktorist sõltumatu kasv Ba/F3-rakkudes ei tähenda iseenesest veel STAT-i aktiveerimist.

STAT5 rolli IFN-alfa signaalimisel uurisid Ba/F3-rakkudes Jaster ja kolleegid, kes näitasid, et IFN-alfa aktiveerib STAT5A ja STAT5B DNA-sidumist, kuid et IL-3 on mõlema isoformi palju tugevam indutseerija. ^[9]Dominant-negatiivne JAK2-mutant pärssis IL-3 poolt indutseeritud, kuid mitte IFN-alfa poolt indutseeritud STAT5 aktiveerumist, paljastades, et need kaks tsütokiinid kasutavad sõltumatuid ülesvoolu mehhanisme, et mõjutada sama transkriptsioonifaktorit; autorid järeldasid siiski, et STAT5 ei ole selles süsteemis IFN-alfa signaalimise jaoks otsustava tähtsusega.

Konstitutiivset JAK–STAT-aktiveerimist on modelleeritud Ba/F3-rakkudes, kasutades TEL–JAK2-fusioonvalku – onkogeenset fusiooni, mis on seotud T-rakkude ägeda lümfoblastilise leukeemiaga. Ho ja kolleegid näitasid, et TEL-i terava domeeni fusioon funktsionaalse JAK2 kinaasi (JH1) domeeniga muutis Ba/F3-rakud faktorist sõltumatuks, samas kui fusioon pseudokinaasi (JH2) domeeniga või kinaasi-inaktiivse JH1 domeeniga seda ei teinud; aktiivsed konstruktid põhjustasid STAT1, STAT3 ja STAT5 konstitutiivset türosiini fosforüleerimist.^[5] Hiljuti leiti, et metotreksaat pärsib TEL–JAK2, STAT3 ja STAT5 fosforüleerimist Ba/F3-rakkudes foolhappe ainevahetusest sõltuva mehhanismi kaudu: seda mõju pööras tagasi folinhape, seda suudeti taasesitada dihydrofolaatreduktaasi CRISPR/Cas9-knockouti abil ning seda ei suutnud jäljendada 5-fluorouratsiil. ^[22]

IL-4 signaalimist STAT6 kaudu uurisid Gingras ja kolleegid, kes näitasid, et p300/CBP koaktivaatorid on vajalikud STAT6-vahendatud transkriptsiooni indutseerimiseks ning et p300/CBP üliekspressioon tugevdab IL-4 poolt juhitavat reportergeeni aktiivsust. ^[10]Suurem osa sellest tööst viidi läbi COS7- ja HeLa-rakkudes; Ba/F3-rakud andsid olulise endogeense tõendusmaterjali, nimelt natiivse STAT6 ja CBP koimmunopretsipitatsiooni.

Tsütokiiniretseptorite signaalimine ja hematopoeetiliste rakkude bioloogia

GM-CSF/IL-3/IL-5 retseptorisüsteemi on Ba/F3-rakkude abil põhjalikult kaardistatud. Itoh ja kolleegid viisid läbi ühise beeta-alajaotuse (betac) kaheksa tsütoplasmaatilise türosiinijäägi süstemaatilise mutatsioonianalüüsi, ekspresseerides Ba/F3-rakkudes seeria türosiinist fenüülalaniiniks muundatud mutante koos loodusliku tüüpi inimese alfa-alajaotusega, et kindlaks teha, millised jäägid vahendavad spetsiifilisi signaaliväljundeid. ^[12]Paralleelset mutageneesisarja läbi vaadates teatasid Okuda ja kolleegid, et kõigi kaheksa tsütoplasmaatilise türosiini mutatsioon GMR-beeta-alajaos vähendas retseptori enda, SHP2 ja SHC fosforüleerimist, kuid ei kaotanud lühiajalist proliferatiivset signaalimist ega JAK2 ja STAT5 fosforüleerimist, illustreerides retseptori domeenide funktsioonide hierarhiat. ^[13]Näidati, et RON-retseptori türosiinkinaas aktiveerib Ba/F3-rakkudes IL-3-beeta-retseptori signaaliteed, indutseerides morfoloogilisi muutusi, mis hõlmavad F-aktini ümberjaotumist ja unikaalseid tuuma kuju muutusi, paljastades retseptori türosiinkinaasi ja tsütokiiniretseptori süsteemide vahelist vastastikust mõju. ^[14]

IL-2 retseptori puhul on samuti uuritud retseptori subdomeenide nõudeid. Transfekteeritud Ba/F3 rakuliinide abil tuvastasid Hunt ja kolleegid, et IL-2 retseptori beeta-ahela happeline domeen ja membraanile lähedal asuv seriinirikas piirkond on vajalikud p38 ja p54 MAP-kinaaside aktiveerimiseks, kusjuures Tyr338 – Shc-sidumiskoht – toimib kriitilise vahendajana. ^[11]Kuna happeline domeen ei ole IL-2 poolt indutseeritud proliferatsiooni jaoks hädavajalik, järeldasid autorid, et Ba/F3-rakkude IL-2 poolt indutseeritud kasvuks ei ole tegelikult vaja ei p38 ega p54 MAP-kinaasi aktiveerimist – see seose puudumine kehtis ka primaarsete T-rakkude puhul.

Ba/F3-rakkude abil on uuritud ka vereloome eellaste rakutsükli regulatsiooni. Mahmud ja kolleegid näitasid, et TGF-beeta1 aeglustas Ba/F3-rakkudes G1-faasist S-faasi üleminekut, seostades seda kasvu aeglustumist Bcl-2 valgu ja CDK-inhibiitori p27 ülesreguleerimisega. ^[15]IL-4 sünergistlikku toimet aktiveeritud Raf-1-ga Ba/F3-rakkude pikaajalise proliferatsiooni soodustamisel uurisid Levings ja kolleegid, kes leidsid, et IL-4 üksi ei suutnud kasvu toetada, kuid võis koostöös aktiveeritud Ras-i või Raf-1-ga säilitada IL-3-ga võrreldavat pidevat proliferatsiooni. ^[16]

Geneetiliselt muundatud retseptori lülitussüsteemides on Ba/F3-rakkude IL-3-sõltuvust kasutatud geeniteraapia rakendustes. Kume ja kolleegid arendasid välja G-CSF-retseptori, mis oli ühendatud bakteriaalse gürasega B (GcrGyr), kus dimeriseeruv antibiootikum kumermütsiin käivitas IL-3-st sõltumatu Ba/F3 proliferatsiooni kui kontseptsiooni tõestava selektiivse võimendava geenisüsteemi geneetiliselt muundatud vereloome rakkude paljundamiseks. ^[17]Samamoodi näidati, et IL-11 ja lahustuva IL-11 retseptori fusioonvalk toimib superagonistina gp130-ga transfekteeritud Ba/F3-rakkudel, millel puudub membraaniga seotud IL-11 retseptori alfa-alamühik, tõestades, et lahustuvad retseptori komponendid võivad funktsionaalselt asendada transmembraanseid alamühikuid. ^[18]

Järeldus

Ba/F3-rakud (CVCL_0161) on üks mitmekülgseimaid ja laialdaselt valideeritud hiire rakuliini platvorme kaasaegses biomeditsiinilises uurimistöös. Nende range IL-3-sõltuvus pakub elegantset ja reprodutseeritavat funktsionaalset analüüsi onkogeensete kinaaside jaoks — sealhulgas BCR-ABL-fusioonvalkude, FLT3-mutatsioonide, ja JAK2-fusioone – ning väikemolekuliliste kinaasiinhibiitorite uurimiseks, millel on kliiniline tähtsus kroonilise müeloidse leukeemia, ägeda müeloidse leukeemia, eellaste lümfoblastilise leukeemia-lümfoomi ja kopsu adenokartsinoomi puhul. Kümnete aastate pikkused uuringud on kinnitanud, et JAK–STAT-signaalimine, tsütokiiniretseptorite bioloogia ja hematopoeetiliste rakkude regulatsioon on Ba/F3 rakendamise põhivaldkonnad. Selle liini kohanemisvõime on võimaldanud luua sadu tuletatud mudeleid, millel on määratletud resistentsusmutatsioonid, muutes selle asendamatuks sihtterapia arendamisel. Kui soovite luua või laiendada oma kinaasibioloogia- või ravimiavastamisprogrammi, on Ba/F3-rakud saadaval veebilehel cytion.com – külastage tootelehte, et küsida lisateavet või esitada tellimus juba täna.

Olulisemad publikatsioonid

1. Didion JP, Buus RJ, Naghashfar Z (2014) Hiire rakuliinide SNP-maatriksi profiilimine tuvastab nende päritolutüved ning paljastab ristsaastumise ja laialt levinud aneuploidia. BMC Genomics. PMID: 25277546
2. Warmuth M, Kim S, Gu XJ (2007) Ba/F3-rakud ja nende kasutamine kinaaside ravimite avastamisel. Current Opinion in Oncology. PMID: 17133113
3. Kojima T, Kitamura T (1999) Konstitutiivselt aktiivsel tsütokiiniretseptoril põhinev signaaljärjestuse lõks. Nature Biotechnology. PMID: 10331810
4. Hayakawa F, Towatari M, Kiyoi H (2000) Tandemduplikaadiga Flt3 aktiveerib konstitutiivselt STAT5-i ja MAP-kinaasi ning indutseerib autonoomset rakkude kasvu IL-3-sõltuvates rakuliinides. Oncogene. PMID: 10698507
5. Ho JM, Beattie BK, Squire JA (1999) Ets-transkriptsioonifaktori TELi fusioon Jak2-ga põhjustab konstitutiivset Jak-Stat-signaalimist. Blood. PMID: 10361134
6. Canitrot Y, Lautier D, Laurent G (1999) BCR–ABL-ga transfekteeritud Ba/F3 rakuliinide mutatsioonifenotüüp ja selle seos DNA-polümeraasi beeta suurenenud ekspressiooniga. Oncogene. PMID: 10348341
7. Uemura N, Salgia R, Ewaniuk DS (1999) Adaptervalgu CRKL osalus integriinide vahendatud adhesiivis. Oncogene. PMID: 10362355
8. Liu CB, Itoh T, Arai K (1999) JAK2 konstitutiivne aktiveerimine tagab BA/F3-rakkude hiire interleukiin-3-st sõltumatu ellujäämise ja proliferatsiooni. The Journal of Biological Chemistry. PMID: 10037724
9. Jaster R, Tschirch E, Bittorf T (1999) STAT5 roll interferoon-alfa signaaliülekandes BA/F3-rakkudes. Cellular Signalling. PMID: 10376805
10. Gingras S, Simard J, Groner B (1999) p300/CBP on vajalik interleukiin-4 poolt indutseeritud transkriptsiooniks ja see interakteerub Stat6-ga. *Nucleic Acids Research*. PMID: 10373589
11. Hunt AE, Lali FV, Lord JD (1999) Interleukiin (IL)-2 retseptori beeta-ahela aladomeenide ja Shc roll p38 mitogeeni poolt aktiveeritud valgu (MAP) kinaasi ja p54 MAP-kinaasi aktiveerimisel. The Journal of Biological Chemistry. PMID: 10066828
12. Itoh T, Liu R, Arai K (1999) Ühise retseptori beeta-alamühiku türosiinijääkide erinev mõju inimese GM-CSF-i poolt indutseeritud mitmetele signaalidele. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. PMID: 10329850
13. Okuda K, Foster R, Griffin JD (1999) GM-CSF/IL-3/IL-5 retseptori beeta-c-ahela signaalidomeenid. Annals of the New York Academy of Sciences. [Ülevaade] PMID: 10372132
14. Mera A, Suga M, Ando M (1999) Rakkude kuju muutuste indutseerimine interleukiin-3 ühise beeta-ahela retseptori aktiveerimise kaudu RON-retseptori tüüpi türosiinkinaasi poolt. The Journal of Biological Chemistry. PMID: 10336478
15. Mahmud N, Katayama N, Nishii K (1999) Bcl-2 võimalik osalus hemopoeetiliste rakkude rakutsükli kulgemise reguleerimises transformatiivse kasvufaktori beeta-1 kaudu. British Journal of Haematology. PMID: 10233423
16. Levings MK, Bessette DC, Schrader JW (1999) Interleukiin-4 toimib sünergistlikult Raf-1-ga, soodustades c-jun N-terminaalse kinaasi pikaajalist proliferatsiooni ja aktiveerimist. Blood. PMID: 10339476
17. Kume A, Ito K, Ueda Y (1999) G-CSF-retseptori ja gürase B fusioonigeen: uut tüüpi molekulaarne lüliti geneetiliselt muundatud hematopoeetiliste rakkude paljunemiseks. Biochemical and Biophysical Research Communications. PMID: 10381335
18. Pflanz S, Tacken I, Grötzinger J (1999) Interleukiin-11 ja lahustuva interleukiin-11 retseptori fusioonvalk toimib superagonistina gp130-d ekspresseerivatel rakkudel. FEBS Letters. PMID: 10350068
19. Palacios R, Steinmetz M (1985) IL-3-sõltuvad hiire kloonid, mis ekspresseerivad B-220 pinnantigeeni, sisaldavad Ig-geene sugurakkude konfiguratsioonis ja toodavad B-lümfotsüüte in vivo. Cell. PMID: 3924409
20. Duan C, Fukuda T, Isaji T (2020) Tuumfukosüleerimise puudulikkus aktiveerib FLT3 ekspressioonist sõltuvat rakusignalisatsiooni Ba/F3 rakusüsteemis. The FASEB Journal. PMID: 31908039
21. Yang J, Friedman R (2025) Ba/F3-rakkude tugevused ja piirangud FLT3-st tingitud AML-resistentsuse modelleerimisel. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. PMID: 41183623
22. Saito M, Takeda K, Yoshino M (2026) Metotreksaat pärsib Ba/F3-rakkudes TEL-JAK2-STAT-signaaliteed foolhappe ainevahetusest sõltuva mehhanismi kaudu. International Immunopharmacology. PMID: 42287956