Introdução

Células Ba/F3, também conhecida pelos sinónimos BA/F3, BaF3, BAF3 e Baf3 (número de acesso no Cellosaurus: CVCL_0161), é uma linha celular murina de células pro-B dependentes da interleucina-3 (IL-3), derivada da medula óssea. A linha foi descrita pela primeira vez por Palacios e Steinmetz em 1985, no âmbito de um painel de clones da medula óssea em proliferação contínua e dependentes de IL-3, que apresentavam o marcador de linhagem das células B B-220 e mantinham os seus genes de imunoglobulina na configuração da linha germinativa. ^[19] Inicialmente, pensava-se que esta linhagem tivesse origem num rato BALB/c; no entanto, uma análise posterior com um painel de SNP revelou que a linhagem é, na verdade, derivada de um rato C3H. ^[1] Desde o seu desenvolvimento, as células Ba/F3 tornaram-se um dos sistemas-modelo mais amplamente utilizados na investigação sobre a sinalização hematopoiética e na descoberta de fármacos oncológicos. A sua dependência estrita da IL-3 para a sobrevivência e proliferação torna-as uma plataforma excepcionalmente pura: a introdução de uma quinase oncogénica ou de uma proteína de fusão torna as células independentes do fator, proporcionando uma leitura poderosa e quantificável. Os investigadores exploram rotineiramente esta propriedade para caracterizar proteínas de fusão BCR-ABL, mutações no FLT3, fusões do JAK2 e muitos outros oncogenes de quinase clinicamente relevantes, bem como para caracterizar inibidores de quinase de moléculas pequenas em formatos de alto rendimento.

Pontos-chave

• Ba/F3 é uma linha celular de células pro-B dependentes de IL-3 murina, derivada da medula óssea do rato C3H, catalogada no Cellosaurus com o número de acesso CVCL_0161.
• A retirada da IL-3 constitui um ensaio de seleção rigoroso: as células parentais morrem, enquanto as células que expressam uma quinase oncogénica ativa — ou qualquer outra construção que forneça um sinal de crescimento constitutivo — sobrevivem e proliferam.
• Esta linha celular tem sido amplamente utilizada para estudar as proteínas de fusão BCR-ABL, as mutações no FLT3, a via de sinalização JAK–STAT e a biologia dos recetores de citocinas.
• As células Ba/F3 estão cada vez mais adaptadas à triagem de inibidores de quinases em grande escala, tornando-se assim um pilar fundamental na descoberta de medicamentos direcionados contra o cancro. ^[2]
• Foram geradas centenas de linhas celulares derivadas a partir de Ba/F3, portadoras de mutações oncogénicas definidas, abrangendo EGFR, ALK, ROS1, RET, NTRK, FLT3 e muitos outros alvos clinicamente relevantes.

O que é o Ba/F₃?

A Ba/F3 é uma linha celular murina de células pro-B dependente de fatores, estabelecida a partir da medula óssea de ratos C3H; o sexo e a idade do dador não estão registados nos dados do Cellosaurus relativos a esta linha. A linha parental não apresenta mutações conhecidas em quinases ativadoras e requer IL-3 exógena para a sobrevivência. O seu tempo de duplicação é de aproximadamente 20 horas em condições de cultura padrão. A principal característica definidora da linha é a sua dependência estrita da IL-3, o que significa que qualquer manipulação genética que confira crescimento independente de fatores pode ser detetada de forma rápida e inequívoca. Esta propriedade, combinada com a ausência de mutações endógenas de quinase que possam causar confusão, tornou as células Ba/F3 uma ferramenta indispensável para analisar o potencial oncogénico de fusões de quinase, mutações pontuais e moléculas de sinalização constitutivamente ativas na biologia dos tumores hematopoiéticos e sólidos. É de salientar que a ausência de uma anotação de mutação não equivale a um contexto geneticamente imaculado: o Cellosaurus também regista dados de variação derivados de matrizes de SNP para esta linha.

A análise por matriz de SNP corrigiu uma atribuição errada de longa data relativamente à origem desta linhagem. A literatura inicial descrevia o Ba/F3 como derivado de um rato BALB/c, mas a análise genómica confirmou a sua origem C3H. ^[1] Das 99 linhas celulares de ratinho analisadas nesse estudo, a Ba/F3 foi a única linha cujo perfil genético não correspondia à estirpe de origem indicada; a discrepância foi confirmada de forma independente pelo RIKEN, um distribuidor da linha, e uma comparação morfológica com outras linhas derivadas da C3H indicou que a Ba/F3 é uma linha celular distinta, em vez de ser o resultado de uma contaminação cruzada. Esta descoberta sublinha a importância da autenticação de rotina das linhas celulares, particularmente no caso das linhas de ratos, em que a análise de perfis STR, por si só, pode ser insuficiente para distinguir estirpes consanguíneas. Os investigadores que utilizem a Ba/F3 devem referir o número de acesso CVCL_0161 do Cellosaurus para garantir uma identificação inequívoca nas publicações.

Informações sobre a cultura celular

Vantagens das células Ba/F₃

A vantagem mais significativa das células Ba/F3 é o seu mecanismo binário de sobrevivência, dependente da IL-3. Na ausência de IL-3, as células Ba/F3 parentais sofrem rapidamente apoptose. A introdução de uma quinase oncogénica ou de uma proteína de fusão salva as células da morte, permitindo a seleção direta de clones transformados de forma estável sem a necessidade de construções repórteres complexas. Esta propriedade tem sido explorada em inúmeros formatos de ensaio, desde os ensaios clássicos de sobrevivência de colónias até aos modernos rastreios de proliferação de alto rendimento para a caracterização de compostos. ^[2] A simplicidade e a robustez da leitura tornam os ensaios baseados em Ba/F₃ um sistema de primeira linha amplamente utilizado para classificar a potência dos inibidores de quinase, embora os valores absolutos de potência continuem a depender do ensaio e do laboratório e devam ser comparados entre estudos com cuidado. ^[21]

As células Ba/F3 são também geneticamente maleáveis e fáceis de transfectar ou transduzir. A introdução de construções de expressão por via retroviral, lentiviral e por eletroporação permite, de forma eficiente, a obtenção de sublinhas com expressão estável. Isto permitiu a geração de centenas de linhas derivadas portadoras de mutações clinicamente relevantes em alvos como o EGFR, FLT3, BCR-ABL, EML4-ALK e RET, entre muitos outros. A ausência de mutações endógenas de quinases que possam causar confusão na linha parental garante que as respostas fenotípicas sejam atribuíveis especificamente ao transgene introduzido. Além disso, o tempo de duplicação de aproximadamente 20 horas permite um rápido rendimento experimental, encurtando consideravelmente os prazos dos ensaios em comparação com culturas de células primárias de crescimento mais lento.

A plataforma Ba/F3 revelou-se especialmente adequada para aplicações de descoberta de sequências de sinalização. Kojima e Kitamura utilizaram uma construção de recetor de citocinas constitutivamente ativo para redirecionar a dependência de crescimento das células Ba/F3 para a localização na superfície celular de proteínas portadoras de péptidos de sinalização, permitindo um rastreio em grande escala de cDNA para identificar produtos génicos secretados e direcionados para a membrana. ^[3] Esta aplicação criativa ilustra como a dependência das células Ba/F3 em relação à IL-3 pode ser aproveitada para muito mais do que o simples estudo de oncogenes de quinase, estabelecendo esta linha como uma plataforma versátil de rastreio genético.

Limitações das células Ba/F3

Apesar das suas inúmeras vantagens, as células Ba/F3 apresentam limitações biológicas inerentes que devem ser tidas em conta na interpretação dos dados experimentais. Por se tratarem de uma linha celular murina de células pro-B, carecem de muitos adaptadores de sinalização e co-receptores presentes nas células cancerígenas humanas. Os valores de potência dos inibidores e as respostas de sinalização a jusante observadas nas células Ba/F3 podem não refletir com precisão a atividade em células tumorais humanas primárias ou em material derivado de doentes. Os investigadores que estudam a resistência a terapias direcionadas para o adenocarcinoma do pulmão, por exemplo, devem validar os resultados baseados nas células Ba/F3 em modelos de células humanas mais relevantes do ponto de vista fisiológico antes de tirar conclusões clínicas.

A origem genómica desta linhagem também tem sido alvo de interpretações erradas. Durante décadas, atribuiu-se à linhagem Ba/F3 uma origem BALB/c, mas a análise de SNPs demonstrou que esta tem origem num rato C3H. ^[1] O mesmo estudo encontrou indícios de aneuploidia em cerca de 42% das linhas celulares murinas analisadas, incluindo uma fração substancial de linhas derivadas de tecido normal, em vez de tecido tumoral; a própria linha Ba/F3 foi identificada como tendo sido mal identificada, em vez de apresentar uma alteração no número de cópias, mas a conclusão geral ilustra a facilidade com que a deriva cariotípica se acumula em cultura. Essa instabilidade em números elevados de passagens pode influenciar os resultados da sinalização, as medições de sensibilidade aos fármacos e a reprodutibilidade dos fenótipos transformados. Os investigadores devem, por conseguinte, trabalhar com números baixos de passagens e autenticar as suas reservas de forma rotineira.

Por fim, as células Ba/F3 não reproduzem na íntegra o microambiente tumoral nem as interações estromais presentes nas neoplasias hematológicas. Além disso, carecem da expressão endógena de muitos componentes de sinalização humanos, o que significa que as interações com co-receptores importantes para a função dos oncogenes podem estar ausentes ou ser divergentes. Os estudos sobre recetores de citocinas complexos com múltiplas subunidades ou recetores que requerem sinalização dependente de glicosilação podem necessitar de sistemas celulares humanos complementares para se chegar a conclusões biologicamente válidas. Apesar destas ressalvas, as células Ba/F3 continuam a ser uma ferramenta de primeira linha poderosa e amplamente aceite na biologia das cinases.

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Aplicações

Descoberta de fármacos para quinases e rastreio de oncogenes

As células Ba/F3 tornaram-se a plataforma celular dominante para a descoberta de fármacos direcionados às cinases. Warmuth e colegas apresentaram uma avaliação abrangente do sistema Ba/F3 para este fim, descrevendo como o ensaio de independência da IL-3 pode ser adaptado a formatos de alto rendimento para avaliar tanto a potência oncogénica das mutações nas cinases como a capacidade dos inibidores de cinases de moléculas pequenas de reverter o crescimento independente de fatores. ^[2]A revisão destacou que as células Ba/F3 acomodam uma amplitude notável de quinases oncogénicas, tornando-as uma plataforma universal para a caracterização inicial de variantes do quinoma associadas ao cancro antes de se avançar para modelos de células humanas mais complexos.

A armadilha de sequência de sinal desenvolvida por Kojima e Kitamura demonstrou que as células Ba/F3 podem ser utilizadas não só para trabalhos com oncogenes de quinase, mas também para o rastreio funcional de bibliotecas de cDNA. ^[3]Ao acoplar um recetor de citocinas constitutivamente ativo à função do péptido de sinalização, uma única experiência-piloto produziu 150 clones já conhecidos — todos a codificar proteínas secretadas ou de superfície celular —, juntamente com 48 novos clones de cDNA, incluindo proteínas de membrana do tipo II que tinham escapado a estratégias anteriores de armadilha de sequência de sinalização. Esta abordagem ilustra a escalabilidade da plataforma Ba/F3 para além da validação clássica de alvos farmacológicos.

A extrema diversidade de linhas derivadas de Ba/F3 agora catalogadas no Cellosaurus — abrangendo centenas de variantes do EGFR, fusões de ALK, rearranjos de RET, fusões de NTRK e mutações de resistência — sublinha como a linha parental Ba/F3 se tornou uma base fundamental para a investigação em oncologia de precisão. Cada linha derivada preserva o fundo «limpo» dependente de IL-3, ao mesmo tempo que adiciona uma única variável genética definida, permitindo estudos sistemáticos da relação estrutura-atividade ao nível celular.

Mutações no FLT3 e leucemia mielóide aguda

Uma das aplicações mais impactantes das células Ba/F3 tem sido a caracterização das mutações do FLT3 (tirosina quinase 3 semelhante à fms) na leucemia mielóide aguda (LMA). A duplicação em tandem interna do FLT3 está entre as lesões oncogénicas mais frequentes na LMA, sendo relatada em cerca de 20% a 30% dos casos, dependendo da coorte e do método de deteção. ^[4][20]Hayakawa e colegas demonstraram que o FLT3 com duplicação em tandem, introduzido nas duas linhas dependentes de IL-3, 32D e Ba/F3, ativa constitutivamente tanto a STAT5 como a MAP quinase e confere crescimento autónomo e independente da IL-3, enquanto o FLT3 de tipo selvagem suportava apenas uma proliferação mínima, mesmo sob estimulação contínua do ligando.^[4] Este estudo marcante estabeleceu as células Ba/F3 como um sistema de ensaio funcional primário para a validação de mutações no FLT3 e continua a ser uma referência metodológica na área.

Trabalhos subsequentes basearam-se amplamente nesta base. Estudos sobre a fucosilação do núcleo demonstraram que o knockout do gene Fut8 por CRISPR/Cas9 em células Ba/F3 que expressam FLT3 de tipo selvagem foi suficiente para induzir a proliferação independente da IL-3 — um efeito não observado nas células parentais — acompanhada por um aumento da fosforilação da tirosina e da ativação de STAT5, AKT e ERK, bem como pela dimerização do FLT3 independente de ligando.^[20] Isto revelou uma via de regulação por glicosilação até então não reconhecida para este recetor. A resistência ao inibidor de FLT3 gilteritinib também foi analisada em modelos Ba/F3 FLT3-ITD, nos quais a resistência a concentrações do fármaco clinicamente alcançáveis exigia tipicamente múltiplas mutações secundárias, várias das quais ainda não tinham sido relatadas. ^[21]O mesmo trabalho avaliou sistematicamente os pontos fortes e as limitações dos modelos Ba/F3 FLT3-ITD, observando que, embora a plataforma seja adequada para identificar e classificar mutações de resistência, não reproduz o nicho complexo da medula óssea que determina a resistência nos doentes.

Biologia do BCR-ABL e leucemia mielóide crónica

As células Ba/F3 transfectadas com proteínas de fusão BCR-ABL têm sido fundamentais para a compreensão da biologia molecular da leucemia mielóide crónica (LMC). Canitrot e colegas utilizaram células Ba/F3 que expressavam as isoformas p190 e p210 do BCR-ABL para demonstrar que o BCR-ABL confere um fenótipo mutador, aumentando a frequência de mutações espontâneas entre três a cinco vezes em comparação com as células parentais, e que esta instabilidade genómica estava associada a uma expressão aumentada da polimerase de ADN beta. ^[6]Esta descoberta revelou um mecanismo pelo qual o BCR-ABL pode impulsionar a progressão da doença da fase crónica da LMC para a leucemia mielóide aguda.

A proteína adaptadora CRKL, uma das principais fosfoproteínas de tirosina nos neutrófilos leucémicos de doentes com LMC, foi estudada em células Ba/F3 por Uemura e colegas. ^[7]As células que sobreexpressavam a CRKL na sua forma completa apresentaram uma adesão aumentada à fibronectina e uma morfologia alterada em superfícies revestidas com fibronectina, ao passo que os mutantes de deleção que não possuíam o domínio SH2 ou o domínio SH3 N-terminal não o fizeram — indicando que ambos os domínios são necessários para o efeito. A adesão foi bloqueada por um anticorpo anti-integrina beta1, embora a sobreexpressão da CRKL não tenha alterado a expressão da integrina beta1 na superfície nem induzido espontaneamente o seu epítopo de ativação. Estas experiências implicam a CRKL em vias de sinalização que regulam a adesão mediada por integrinas a jusante do BCR-ABL.

Em conjunto, estes estudos sobre o BCR-ABL ilustram como as células Ba/F3 permitem uma análise clara da sinalização impulsionada por oncogenes, eliminando a complexidade da atividade quinásica endógena. A plataforma continua a apoiar a caracterização de mutações de resistência aos inibidores do BCR-ABL, estando agora disponíveis linhas derivadas dedicadas de Ba/F3 BCR-ABL e BCR-ABL-T315I para a análise direta do perfil dos inibidores no contexto de genótipos de resistência clinicamente relevantes.

Vias de sinalização JAK–STAT

As células Ba/F3 têm servido como modelo principal para analisar quais os eventos de sinalização a jusante dos recetores de citocinas que são efetivamente necessários para o crescimento. Liu e colegas construíram uma molécula quimérica (beta/JAK2) constituída pelas regiões extracelulares e transmembranares da beta-cascina fundidas com a JAK2 e expressaram-na em células Ba/F3. ^[8]A molécula quimérica estava constitutivamente fosforilada e era suficiente para impulsionar a sobrevivência e a proliferação independentes da IL-3. Notavelmente, o STAT5, o Shc e o SHP-2 não estavam fosforilados nestas células e a atividade dos promotores da beta-caseína e do c-fos não estava aumentada, enquanto a transcrição do c-myc estava constitutivamente ativada. Os autores concluíram que a ativação da JAK2, por si só, é suficiente para a sobrevivência e a proliferação e que a ativação da STAT5 e da MAP quinase não é necessária para estes resultados específicos — um lembrete útil de que o crescimento independente de fatores nas células Ba/F3 não implica, por si só, a ativação da STAT.

O papel do STAT5 na sinalização do IFN-alfa foi examinado em células Ba/F3 por Jaster e colegas, que demonstraram que o IFN-alfa ativa a ligação do STAT5A e do STAT5B ao ADN, mas que a IL-3 é um indutor muito mais potente de ambas as isoformas. ^[9]Um mutante JAK2 dominante-negativo suprimiu a ativação do STAT5 induzida pela IL-3, mas não a induzida pelo IFN-alfa, revelando que as duas citocinas acionam mecanismos a montante independentes para convergir para o mesmo fator de transcrição; os autores concluíram, no entanto, que o STAT5 não é essencial para a sinalização do IFN-alfa neste sistema.

A ativação constitutiva da via JAK–STAT foi modelada em células Ba/F3 utilizando a proteína de fusão TEL–JAK2, uma fusão oncogénica associada à leucemia linfoblástica aguda de células T. Ho e colegas demonstraram que a fusão do domínio pontiagudo da TEL com o domínio funcional da quinase JAK2 (JH1) transformou as células Ba/F3 em células independentes de fatores, ao passo que a fusão com o domínio da pseudocinase (JH2) ou com um domínio JH1 inativo em termos de quinase não o fez; as construções ativas induziram a fosforilação constitutiva da tirosina em STAT1, STAT3 e STAT5.^[5] Mais recentemente, verificou-se que o metotrexato suprime a fosforilação de TEL–JAK2, STAT3 e STAT5 nas células Ba/F3 através de um mecanismo dependente do metabolismo do folato: o efeito foi revertido pelo ácido folínico, reproduzido pelo knockout da di-hidrofolato redutase por CRISPR/Cas9 e não imitado pelo 5-fluorouracilo. ^[22]

A sinalização da IL-4 através do STAT6 foi investigada por Gingras e colegas, que demonstraram que os coativadores p300/CBP são necessários para a indução transcricional mediada pelo STAT6 e que a sobreexpressão de p300/CBP potencia a atividade do gene repórter induzida pela IL-4. ^[10]A maior parte desse trabalho foi realizada em células COS7 e HeLa; as células Ba/F3 forneceram a evidência endógena fundamental, nomeadamente a coimunoprecipitação do STAT6 nativo juntamente com o CBP.

Sinalização dos recetores de citocinas e biologia das células hematopoiéticas

O sistema de recetores GM-CSF/IL-3/IL-5 foi extensivamente mapeado utilizando células Ba/F3. Itoh e colegas realizaram uma análise mutacional sistemática dos oito resíduos de tirosina citoplasmáticos da subunidade beta comum (betac), expressando uma série de mutantes de tirosina para fenilalanina juntamente com a subunidade alfa humana de tipo selvagem em células Ba/F3, para determinar quais os resíduos que medeiam respostas de sinalização específicas. ^[12]Ao analisar uma série paralela de mutagénese, Okuda e colegas relataram que a mutação de todas as oito tirosinas citoplasmáticas no GMR-beta reduziu a fosforilação do próprio recetor, do SHP2 e do SHC, mas não inibiu a sinalização proliferativa a curto prazo nem a fosforilação de JAK2 e STAT5, ilustrando uma hierarquia das funções dos domínios do recetor. ^[13]Demonstrou-se que a quinase de tirosina do recetor RON ativa a via do recetor beta da IL-3 nas células Ba/F3 para induzir alterações morfológicas que envolvem a redistribuição da F-actina e alterações únicas na forma nuclear, revelando uma interação entre os sistemas de quinases de tirosina dos recetores e dos recetores de citocinas. ^[14]

Os requisitos dos subdomínios do recetor também foram analisados no caso do recetor de IL-2. Utilizando linhas Ba/F3 transfectadas, Hunt e colegas identificaram o domínio ácido e a região rica em serina próxima da membrana da cadeia beta do recetor da IL-2 como necessários para a ativação das MAP-quinases p38 e p54, com a Tyr338 — o local de ligação à Shc — a servir como um intermediário crítico. ^[11]Uma vez que o domínio ácido é dispensável para a proliferação induzida pela IL-2, os autores concluíram que nem a ativação da MAP quinase p38 nem da p54 é, de facto, necessária para o crescimento das células Ba/F3 induzido pela IL-2, uma dissociação que também se verificou nas células T primárias.

A regulação do ciclo celular em progenitores hematopoiéticos também foi estudada utilizando células Ba/F3. Mahmud e colegas demonstraram que o TGF-beta1 retardava a progressão da fase G1 para a fase S nas células Ba/F3, associando esta desaceleração do crescimento à regulação positiva da proteína Bcl-2 e do inibidor de CDK p27. ^[15]A sinergia da IL-4 com o Raf-1 ativado para impulsionar a proliferação a longo prazo das células Ba/F3 foi estudada por Levings e colegas, que descobriram que a IL-4, por si só, não conseguia sustentar o crescimento, mas podia cooperar com o Ras ou o Raf-1 ativados para manter uma proliferação contínua comparável à da IL-3. ^[16]

Sistemas de comutação de recetores modificados geneticamente têm explorado a dependência das células Ba/F3 em relação à IL-3 para aplicações de terapia genética. Kume e colegas desenvolveram um recetor de G-CSF fundido com a girase B bacteriana (GcrGyr), no qual o antibiótico dimerizante coumermicina desencadeava a proliferação de Ba/F3 independente da IL-3, como um sistema genético amplificador seletivo de prova de conceito para a expansão de células hematopoiéticas geneticamente modificadas. ^[17]De forma semelhante, demonstrou-se que uma proteína de fusão entre a IL-11 e o recetor solúvel da IL-11 atuava como um superagonista em células Ba/F3 transfectadas com gp130, desprovidas do recetor alfa da IL-11 ligado à membrana, demonstrando que os componentes do recetor solúvel podem substituir funcionalmente as subunidades transmembranares. ^[18]

Conclusão

As células Ba/F3 (CVCL_0161) representam uma das plataformas de linhas celulares murinas mais versáteis e amplamente validadas na investigação biomédica moderna. A sua dependência estrita da IL-3 proporciona um ensaio funcional elegante e reprodutível para quinases oncogénicas — incluindo proteínas de fusão BCR-ABL, mutações FLT3, e fusões de JAK2 — e para inibidores de quinases de moléculas pequenas com relevância clínica para a leucemia mielóide crónica, a leucemia mielóide aguda, a leucemia-linfoma linfoblástica de células precursoras e o adenocarcinoma pulmonar. Décadas de investigação estabeleceram a via de sinalização JAK–STAT, a biologia dos recetores de citocinas e a regulação das células hematopoiéticas como domínios centrais da aplicação das células Ba/F3. A adaptabilidade desta linha permitiu a criação de centenas de modelos derivados portadores de mutações de resistência definidas, tornando-a indispensável no desenvolvimento de terapias direcionadas. Se pretende estabelecer ou expandir o seu programa de biologia das cinases ou de descoberta de fármacos, as células Ba/F3 estão disponíveis em cytion.com — visite a página do produto para obter mais informações ou efetuar uma encomenda ainda hoje.

Publicações principais

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