Sissejuhatus

AML12-rakud, mida tuntakse ka nimetustega AML-12, AML 12 ja Alpha Mouse Liver 12, on laialt tunnustatud hiire hepatotsüütide rakuliin, mida kasutatakse laialdaselt biomeditsiinilistes uuringutes. Wu, Merlino ja Fausto lõid selle liini 1994. aastal transgeense hiire maksast, milles üleväljendub inimese transformatiivne kasvufaktor alfa (TGF-α) – tugev hepatotsüütide mitogeen. [1] Erinevalt esmasest hepatotsüütidest säilitavad AML12-rakud paljude passaažide jooksul olulised diferentseerunud funktsioonid – sealhulgas peroksisomide ekspressiooni ja sapikanalikulaarsete struktuuride olemasolu – ilma et muutuksid kasvajate tekitajateks. See stabiilsuse ja säilinud hepatotsüütide fenotüübi kombinatsioon on muutnud need rakud eelistatud in vitro platvormiks lipiidide ainevahetuse, mittealkoholist tingitud rasvmaksahaiguse, kemikaalide ja ravimite poolt põhjustatud maksakahjustuste, insuliiniresistentsuse ning hepatotsüütide apoptoosi uurimiseks. Nende hiirepäritolu võimaldab otsest võrdlust transgeensete ja knockout-loommudelitega, laiendades nende rakenduslikku kasulikkust mitmesugustes maksahaiguste uurimiskontekstides.

Peamised järeldused

• AML12-rakud on diferentseerunud, mittetumorigeensed hiire hepatotsüüdid, mis on saadud TGF-α transgeensetelt hiirtelt. [1]
• Need säilitavad hepatotsüütidele iseloomulikke tunnuseid, nagu peroksisomid, sapikanalikulaarsed struktuurid ja maksaspetsiifiliste seerumvalkude kõrged mRNA tasemed, kuigi mõnede nende ekspressioon väheneb pikemaajalise passaažimise käigus. [1]
• Seda rakuliini kasutatakse laialdaselt mittealkoholist rasvmaksahaiguse, ravimite põhjustatud maksakahjustuse ja lipiidide ainevahetushäirete modelleerimiseks.
• AML12-rakud reageerivad peamistele maksast pärinevatele signaalidele, sealhulgas TGF-β-le, TNF-ile, insuliinile ja retinoehappele.
• Kuna need rakud on muutumatud, sobivad nad eriti hästi normaalse hepatotsüüdi füsioloogia ja toksikoloogia uurimiseks.
• Need sobivad kokku adenoviirusliku transfektsiooni, antisense-oligonukleotiidide ja CRISPR-põhiste geeniredigeerimismeetoditega.
• Molekulaarne iseloomustus on näidanud peaaegu tetraploidset aneuploidset kariotüüpi ja osalist dediferentseerumist, mistõttu tuleks AML12-rakke täiendada primaarsete hepatotsüütidega või in vivo mudelitega, kui uuritakse tulemusnäitajaid, mis eeldavad täielikult küpsete hepatotsüütide funktsioneerimist. [18]

Mis on AML12?

AML12 saadi 5-kuuse isashiire (tüvi CD-1, liin MT42) hepatotsüütidest, mis olid transgeensed inimese transformatiivse kasvufaktori alfa suhtes, mida reguleeris tsink-indutseeritav metallotioneiini 1 promootor. Wu, Merlino ja Fausto rajasid selle liini 1994. aastal ja iseloomustasid seda spontaanselt surematuks muutunud, mittetransformeeritud hepatotsüütide liinina. [1] Rakud kannavad Cellosaurus’e registreerimisnumbrit CVCL_0140 ja nende autentsus on tõendatud 18-markerilise hiire STR-võrdlusprofiili alusel. Esialgses publikatsioonis on esitatud kahekordistumisaeg 37 tundi (tarnija andmete kohaselt 36–48 tundi) ning mikrokiipanalüüsidest saadud transkriptoomilised andmed on avalikult kättesaadavad. Algne uuring andis tulemuseks kaks liini, AML12 ja AML14, mida mõlemat säilitati üle 1,5 aasta ja üle 80 passaaži. AML12 säilitas oma hepatotsüütide identiteedi ja jäi kogu aja jooksul mittetumorigeenseks, kuigi mõnede seerumvalkude mRNA tasemed langesid passaažide käigus järk-järgult ning neid oli võimalik taastada kultiveerimisel seerumivabas keskkonnas. Seevastu AML14 kaotas pikaajalise passaažimise käigus nii diferentseerunud markerite kui ka transgeeni mRNA ekspressiooni, kusjuures hepatotsüütilised omadused olid vaid osaliselt taastatavad. [1]

AML12 rakukultuuri teave

AML12-rakkude eelised

AML12-rakkude peamine eelis on see, et nad säilitavad diferentseerunud hepatotsüütide fenotüübi ka pikaajalise kultiveerimise käigus. Erinevalt paljudest hepatoma rakuliinidest sisaldavad AML12-rakud peroksisoome ja sapikanalikulaarsetele struktuuridele sarnaseid struktuure, ekspresseerivad kõrgel tasemel maksaspetsiifiliste seerumvalkude, sealhulgas albumiini, alfa-1-antitrüpsiini ja transferriini, mRNA-d ning eritavad albumiini. [1] Need ei kasva pehmes agaris ja jäävad alasti hiirtel mittetumorigeenilisteks, mis kinnitab, et immortaliseerumine toimus ilma funktsionaalse pahaloomulise transformatsioonita. See transformatsioonivaba seisund on otsustava tähtsusega uuringutes, mis nõuavad füsioloogiliselt asjakohast algseisundit, näiteks insuliini signaalimise, lipiidide ainevahetuse või hepatotoksilisuse uurimisel. Geenitasandil on aga hiljem selgunud, et see liin kannab märkimisväärseid kromosoomianomaaliaid, mida käsitletakse jaotises „Piirangud“. [18]

AML12-rakud on geneetilise manipuleerimise seisukohast väga mitmekülgsed. Need võimaldavad adenoviirusvektoritel põhinevat geenide üleväljendamist, nagu on näidanud aktiiviini alarühmade uuringud. [2] [3] Need võimaldavad ka stabiilset tetratsükliiniga reguleeritavat transgeeni ekspressiooni, mis omakorda võimaldab luua indutseeritavaid mudeleid B-hepatiidi viiruse X-valgu aktiivsuse uurimiseks. [4] Lisaks on antisense-oligonukleotiidide manustamine osutunud tõhusaks, mistõttu sobivad AML12-rakud RNA-le suunatud uuringuteks, [5] ning CRISPR/Cas9-põhised knock-out-derivaadid on edukalt loodud. [21] Nende hiirepäritolu võimaldab eksperimentaalseid tulemusi vahetult ristvalideerida transgeensete ja knockout-hiirte andmetega, tugevdades seeläbi in vitro ja in vivo vahelist üleminekusilda.

Praktilisest seisukohast reageerivad AML12-rakud tugevalt mitmesugustele füsioloogilistele ärritajatele. Dokumenteeritud reaktsioonide hulka kuuluvad transkriptsiooni aktiveerimine retinoehappe, PPARα-ligandide, TGF-β, TNF ja insuliini signaalitee modulaatorite poolt. [6] [7] Selline signaalidele reageerimise ulatus muudab selle seeria kasulikuks mitmes uurimisvaldkonnas korraga, vähendades vajadust vahetada platvormi erinevate eksperimentaalsete kontekstide vahel.

AML12-rakkude piirangud

Hoolimata oma eristuvast fenotüübist ei ole AML12-rakud igas funktsionaalses mõttes võrdsed primaarsete hepatotsüütidega. Võrdlusuuring, milles võrreldi AML12-, HepG2- ja THLE-2-rakkude insuliinisignalisatsiooni ja hepatokiinide geeniekspressiooni, näitas, et AML12-rakkude insuliinireageerivus oli häiritud, kui rakke kasvatati soovitatud kasvukeskkonnas, kuid muutus HepG2-rakkudega võrreldavaks, kui kasutati insuliinivaegset keskkonda. [8] Insuliiniretseptori valgu tasemed AML12-s olid sarnased HepG2-ga, samas kui AML12-s oli mitmete glükoneogeensete ensüümide ja hepatokiinide transkripti tasemed madalad või tuvastamatud. Autorid järeldasid, et glükoneogeneesi ja hepatokiinide ekspressiooni osas näisid HepG2-rakud hoolimata oma kasvajate tekitavast päritolust olevat lähemal in vivo olukorrale. Seetõttu tuleks AML12-rakkude kasutamisel insuliiniresistentsuse modelleerimiseks hoolikalt arvestada kasvukeskkonna koostist ja oluliste signaalvalkude kontsentratsiooni.

AML12-rakkude hiirepäritolu toob kaasa ka liigispetsiifilised erinevused võrreldes inimese hepatotsüütidega. Ravimite ainevahetusradad, lipiidide töötlemine ja teatud põletikulised reaktsioonid erinevad hiire ja inimese maksarakkude vahel. Seetõttu tuleb AML12-rakkudes saadud tulemusi hoolikalt hinnata enne nende ekstrapoleerimist inimese füsioloogiale, eriti ravimiarenduse kontekstis, kus liigispetsiifiline tsütokroom P450 aktiivsus võib tulemusi moonutada.

Alliklooma transgeenne taust – TGF-α üleväljendamine – võib lisaks mõjutada geenide algseid ekspressioonimustreid ja kasvufaktorite signaaliedastust. TGF-perekonna liikmete bioloogiale keskenduvates uuringutes tuleks andmete tõlgendamisel seda konteksti arvesse võtta.

2026. aastal avaldatud integreeritud tsütogeneetiline ja transkriptomiline iseloomustus täpsustab mudeli piire veelgi. Mitmevärviline FISH-analüüs ja mitmevärviline bandeerimine paljastasid keeruka, peaaegu tetraploidset ja tugevalt aneuploidset kariotüüpi (81<4n>), millel esinevad korduvad struktuurilised ümberkorraldused, sealhulgas del(X)(A3)×2, dikentriline dic(X;17), del(17)(D1)×2 ja derivaatkromosoomi der(3)t(2;3), koos mitmete tervete kromosoomide lisandumiste ja kadudega; mõlemad Y-kromosoomid on kadunud, hoolimata liini meessoost päritolust. [18] Kui tekkinud koopiaarvu tasakaalustamatused kaardistati ortoloogilistele inimese tsütobändidele, kattus 57,5–68 % neist muutustega, mida on korduvalt kirjeldatud inimese hepatotsellulaarse kartsinoomi puhul. Samas uuringus läbi viidud RNA sekveneerimine kinnitas selget hepatotsüütide diferentseerumisprogrammi, kuid dokumenteeris ka osalist dediferentseerumist: albumiini ekspressioon oli tagasihoidlik, uureatsükli ja glükoneogeneesi ensüümide, nagu Cps1, Otc, Pck1 ja G6pc, olid madalad või puudusid üldse ning peamised sapphappeid ja ravimeid metaboliseerivad tsütokroomid, sealhulgas Cyp7a1 ja Cyp3a perekond, olid vaevu tuvastatavad, samal ajal kui indutseeriti duktuulide ja eellaste markereid. Funktsionaalses mõttes mittetumorigeenilisus ei tähenda seega veel genoomilist stabiilsust. Lõpptulemuste puhul, mis nõuavad küpset ksenobiootilist ainevahetust, lämmastiku käitlemist või sapphappe sünteesi, soovitavad autorid täiendada AML12-d primaarsete hepatotsüütide, organoidide või in vivo mudelitega. Uuringus tuvastati ka kaks seotud klooni, mille suhtelised osakaalud võivad muutuda passaažide arvu ja kasvatustingimustega, mis toetab väikese passaažiarvuga algkultuuride kasutamist, piiratud passaažide arvu ja regulaarset autentimist kehtestatud STR-viiteprofiili alusel. [18]

Vaata täielikke tehnilisi andmeid ja telli

Rakendused

Apoptoos ja rakusurma signaalid

AML12-rakke on laialdaselt kasutatud tsütokiinide ja kasvufaktorite poolt vallandatud hepatotsüütide apoptoosi uurimiseks. Pierce ja kolleegid näitasid, et AML12-rakud, nagu ka hepatotsüüdid in vivo, ei ole tundlikud ainult TNF-i suhtes, kuid läbivad apoptoosi, kui TNF-i kombineeritakse väikese annusega aktinomütsiini D-ga. [9] Nende uuringud näitasid, et TNF-i poolt AML12-rakkudes esile kutsutud apoptoos hõlmab redoks-homeostaasi häireid, kus NAD(P)H ja glutatiooni kadu eelneb mitokondriaalsele kahjustusele, tsütokroom C vabanemisele ja kaspaasi aktiveerumisele. Kahjustust mõjutas suuresti rakkude glutatiooni sisaldus ning antioksüdant alfa-lipoehape takistas täielikult mitokondrite kahjustumist ja apoptoosi. Need tulemused kinnitasid, et AML12-rakud on sobiv mudel TNF-vahendatud hepatotsüütide kahjustuse aluseks olevate oksüdatiivsete mehhanismide uurimiseks.

TGF-β1 on veel üks selles mudelis uuritud hepatotsüütide apoptoosi peamine indutseerija. Liao ja kolleegid näitasid, et AML12-rakud ilmutavad TGF-β1-ga töötlemisel klassikalisi apoptootilisi tunnuseid – kromatiini kondensatsiooni, tuuma lagunemist ja DNA fragmentatsiooni – ning et tsükloheksimiid blokeeris selle protsessi täielikult, viidates aktiivse valgusünteesi osalusele rakusurma signaalitees. [10] Dooley ja kolleegid kasutasid lisaks esmaseid hepatotsüütide kasvukultuure ja AML12-rakke koos, et iseloomustada TGF-β poolt indutseeritud epiteel-mesenküümne üleminekut, näidates, et Smad7 üleväljendamine hepatotsüütides nõrgendas TGF-β poolt vahendatud fibrogeeneesi ja kaitseks maksakahjustuse eest. [11]

AML12-rakkudes on iseloomustatud ka aktiviini alarühmade bioloogiat. Wada ja kolleegid leidsid, et aktiviini βC-alarühma üleväljendamine soodustas AML12-rakkude proliferatsiooni ja ellujäämist, samas kui βE-alarühma üleväljendamine vähendas proliferatsiooni ja käivitas apoptoosi madala seerumitaseme tingimustes. [2] [3] Kokkuvõttes rõhutavad need uuringud AML12-rakkude väärtust põletikuliste ja fibroosiliste maksahaiguste puhul hepatotsüütide saatust määravate vastandlike ellujäämist soodustavate ja apoptoosi soodustavate signaalide analüüsimisel.

Lipidide ainevahetus ja PPAR-signaalimine

PPARα signaalitee on maksa lipiidide ainevahetuse keskne regulaator ning AML12-rakud on osutunud eriti kasulikuks selle farmakoloogiliste ainetega moduleerimise uurimisel. Clemenz ja kolleegid kasutasid AML12-rakke, et näidata, et angiotensiini tüüp 1 retseptori blokaator telmisartaan toimib osalise PPARα-agonistina: see indutseeris PPARα sihtgeeni, pika ahelaga atsüül-CoA-süntaasi perekonna liiget 1 (ACSL1) hiire AML12 rakkudes ja karnitiinpalmitoyltransferaasi 1A (CPT1A) inimese HepG2 rakkudes, pakkudes molekulaarset alust selle kliiniliselt täheldatud triglütseriidide alandavale toimele. [7] Toitumusest tingitud rasvumisega hiirtel suurendas telmisartaan maksa ACSL1-i ja CPT1A-i ekspressiooni ning vähendas märkimisväärselt maksa ja seerumi triglütseriidide taset. Samamoodi näitasid Huang ja kolleegid, et fenofibraat, mis on PPARα-ligand, suurendas AML12-rakkudes madala tihedusega lipoproteiini retseptori ekspressiooni maksas ja taastas LDL-i seondumisvõime, kusjuures tulemused kinnitati in vivo. [12]

Aldoosireduktaas (AR) on osutunud ootamatuks PPARα aktiivsuse regulaatoriks hepatotsüütides. Qiu ja kolleegid näitasid AML12-rakkudes, et AR-i üleväljendamine pärssis tugevalt PPARα aktiivsust ja vähendas rasvhapete oksüdatsiooni geene; neid toimeid nõrgendas selektiivne AR-inhibiitor zopolrestat. [13] AR-i üleväljendamine tõstis ka fosforüülitud PPARα ja ERK1/2 taset ning PPARα aktiivsuse pärssimine pöördus tagasi ERK1/2 inhibeerimise abil — seostades polüoolide sünteesi rada lipiidide homöostaasiga kinaasist sõltuvate mehhanismide kaudu. Need tulemused näitavad, kuidas AML12-rakud võivad paljastada ootamatuid seoseid ainevahetus- ja signaalimisradade vahel, mis on seotud mittealkoholist rasvmaksahaigusega ja diabeetiliste maksakomplikatsioonidega.

Nikotiinamiid-N-metüültransferaas (NNMT) on veel üks ensüüm, mida on AML12-rakkudes uuritud seoses maksa lipiidide regulatsiooniga. Nnmt-i RNAi-vahendatud allasurumine AML12-rakkudes põhjustas S-adenosüülmetioniini (SAM) ja S-adenosüülhomotsüsteiini kogunemist ning 1-metüülnikotinaamiidi (MNAM) taseme langusega, millega kaasnesid lipogeensete geenide (nt Srebf1) ekspressiooni vähenemine ning neutraalsete lipiidide koguhulga mõõdetav vähenemine – seostades ühe süsiniku ainevahetust maksa lipogeneesiga. [19] Eraldi tuvastati, et endoplasmaatilise retikuli valk TXNDC5 on AML12-rakkudes PRDX6 ja HSPA9 interaktsioonipartner; TXNDC5 defitsiit vähendas PRDX6 ja HSPA9 valkude taset ning vähendas märkimisväärselt lipiidide peroksüdatsiooni, redutseeritud glutatiooni ja iPLA2 aktiivsust. [20] Sama mudeli põhjal kaitsevad PLGA-nanopartiklitesse laaditud skvaleenid AML12-rakke oksüdatiivse ja endoplasmaatilise retikuluumi stressi eest TXNDC5-sõltival viisil, kusjuures 30 µM kontsentratsioonil täheldati kiiret ja tõhusat rakulist omastamist – need leiud on olulised rasvmaksa haiguse tulevaste ravistrateegiate seisukohalt. [21]

Insuliini signaalimine ja ainevahetushaigused

AML12-rakke on kasutatud in vitro vahendina insuliini signaalimise ja selle patoloogilise häire uurimiseks. Butler ja kolleegid kasutasid AML12-rakke, et valideerida antisense-oligonukleotiidide strateegiat, mis on suunatud PTEN-ile – lipiidfosfataasile, mis reguleerib negatiivselt PI3K-signaaliteed. PTEN-i antisense-oligonukleotiidide transfektsioon AML12-rakkudesse vähendas PTEN-i mRNA ja valgu tasemeid ning suurendas insuliini poolt stimuleeritud Akt-i fosforüleerimist, pakkudes mehhanistlikku tõestust enne süsteemset manustamist db/db- ja ob/ob-hiirtele, mille veresuhkru kontsentratsioon normaliseerus. [14] See uuring näitas AML12-rakkude väärtust esmase sõelumisplatvormina insuliiniresistentsusele suunatud ainevahetuslike sekkumiste puhul.

Sefriedi ja kolleegide võrdlusuuringus hinnati otseselt AML12-rakkude sobivust insuliini signaalimise ja hepatokiinide geeniekspressiooni uurimiseks. [8] Võrreldes AML12-rakke HepG2- ja THLE-2-rakkudega leidsid autorid, et AML12-rakkude äge insuliinireageerivus sõltus tugevalt kasvatuskeskkonda koostisest ning et AML12-rakkudes ekspresseeriti mitmeid glükoneogeenseid ja hepatokiinide transkripte vaid madalal või tuvastamatul tasemel. PPARδ-sõltuv geeniregulatsioon oli AML12 ja HepG2 rakkude vahel võrreldav, kuid ainult HepG2 rakud suutsid taastada cAMP-vahendatud maksa glükoneogeneesi regulatsiooni. Autorid järeldasid, et nende konkreetsete tulemusnäitajate puhul sarnanesid HepG2-rakud hoolimata oma kasvajate tekitavast päritolust rohkem in vivo olukorraga – see on võtmetähtsusega kaalutlus insuliiniresistentsuse või 2. tüüpi diabeedi uurimise mudeli valimisel.

Tomatini võimet parandada glükoosimetabolismi ja mitokondriaalset hingamist kõrge glükoositasemega indutseeritud insuliiniresistentsetes AML12- ja HepG2-rakkudes on uuritud. [22] Tomatiin suurendas annusest sõltuvalt glükoosi tarbimist, taastas glükoositransportija Glut2 ja glükoneogeneesiga seotud geenide ekspressiooni, aktiveeris AMPK fosforüleerimist ja ülesreguleeris PGC1α-d ning parandas hapniku tarbimise kiirust, ATP tootmist ja mitokondriaalse oksüdatiivse fosforüleerimise kompleksi valke. Nii AMPK geneetiline kui ka farmakoloogiline pärssimine tühistasid need positiivsed mõjud, kinnitades selle signaalitee keskset rolli ja muutes AML12-rakud kasulikuks platvormiks diabeedivastase potentsiaaliga looduslike ühendite sõelumiseks. Need tulemused tugevdavad selle rakuliini olulisust lipiidide ainevahetuse, insuliiniresistentsuse ja rasvmaksahaiguse mehhanismide uurimisel.

Hepatotsellulaarse kartsinoomi ja viirushepatiidi uurimine

AML12-rakkude transformatsioonivaba seisund teeb neist ideaalse kontroll- või lähtrakkude liini hepatotsellulaarse kartsinoomi (HCC) uurimisel. Lee ja kolleegid konstrueerisid tetratsükliiniga reguleeritavaid B-hepatiidi viiruse X-valgu (pX) ekspresseerivaid AML12-rakkude derivaate, et luua pX-vahendatud transformatsiooni mudeleid. [4] Võrreldes diferentseerunud, transformatsiooni läbinud alamliini (3pX-1) dediferentseerunud, transformatsiooni läbimata alamliiniga (4pX-1), määratlesid autorid selged rakutsükli muutused, mis on seotud püsiva Ras-Raf-MAPK ja JNK signaaliteede aktiveerumisega, näidates, kuidas AML12 emaliine saab kasutada kontrollitud taustana onkogeensete signaalide analüüsimiseks.

AML12-rakke on kasutatud ka taimset päritolu vähivastaste ainete hindamiseks hepatotsüütide kontekstis. Choedon ja kolleegid testisid Calotropis procera kuivatatud lateksi fraktsioone hepatoma liini Huh-7, mitte-hepatoma liini COS-1 ja transformeerimata AML12 hepatotsüütide suhtes. Metanooliekstrakt ja selle fraktsioon 8 põhjustasid Huh-7- ja COS-1-rakkudes ulatuslikku rakusurma ja DNA-fragmentatsiooni, samas kui AML12-rakud jäid puutumata; paralleelselt kaitse kuivatatud lateksi suukaudne manustamine X15-myc-transgeenseid hiiri täielikult hepatokartsinogeneesi eest. [15] Sellised selektiivsuskatsed, milles kasutatakse AML12-rakke mittepahaloomuliste hepatotsüütide võrdlusena, on levinud strateegia selliste kandidaatühendite tuvastamiseks, mis avaldavad eelistatult toksilist mõju kasvajarakkudele, mitte normaalse maksaparenhüümile.

Retinoehappe (RA) signaalimine, mis on seotud HCC pärssimisega, on AML12-rakkudes põhjalikult kaardistatud, kasutades 39 000 hiiregeeni cDNA-mikrokiipanalüüsi. Mamoon ja kolleegid tuvastasid 15 geeni, mille ekspressioon oli vähemalt kahekordselt suurenenud, ja 3 geeni, mille ekspressioon oli vähemalt kahekordselt vähenenud pärast 3-tunnist all-trans-RA-ravi, ning 26 geeni, mille ekspressioon oli suurenenud, ja 48 geeni, mille ekspressioon oli vähenenud pärast 24 tundi. [6] Ventura-Holmani ja kolleegide järelkatses kasutati mikrokiipanalüüsi AML12-rakkudel, mis olid stabiilselt transfekteeritud v-erbA-ga — onkoproteiini, millel on teadaolevalt domineeriv-negatiivne mõju retinoehappe retseptoritele —, et kindlaks teha, milliseid RA-le reageerivaid geene mõjutab v-erbA, samuti v-erbA poolt basaalse transkriptsiooni tasandil reguleeritavaid geene, millest mitmed on seotud kartsinogeneesiga. [16]

Oksüdatiivne stress ja isheemia-reperfusioonikahjustus

Išemia-reperfusioonikahjustus (I/R) on maksaoperatsioonide ja -siirdamise puhul suur kliiniline väljakutse ning AML12-rakke on kasutatud selle aluseks olevate oksüdatiivsete mehhanismide modelleerimiseks. Haga ja kolleegid näitasid, et hüpoksia/reoksügenatsiooni tingimustesse asetatud AML12-rakkudes tekkis kiiresti oksüdatiivne stress, mille tagajärjel paljud rakud läbisid apoptoosi. [17] ShcA p66-isoformi (p66shc) väljalülitamine RNAi abil vähendas märkimisväärselt rakkude oksüdatiivset stressi ja H/R-i poolt indutseeritud apoptoosi ning andis vastupidavuse vesinikperoksiidile. Kaitsev toime oli pigem seotud ROS-i kõrvaldamise tõhustumisega kui ROS-i tekke pärssimisega: antioksüdantsete valkude MnSOD ja Ref-1 ning apoptoosi pärssiva valgu Bcl-xL ekspressioon suurenes, samas kui apoptoosi soodustava valgu FLICE ekspressioon vähenes, kuid katalüüsi ekspressioon jäi muutumatuks. Need tulemused tõestasid, et p66shc on potentsiaalne ravisihte maksa isheemia-reperfusioonikahjustuse korral.

Antisense-oligonukleotiidide tehnoloogiat on iseloomustatud AML12-rakkudes Fas-vahendatud rakusurma kontekstis. Thonberg ja kolleegid võrdlesid kuut fosforotioaadi oligonukleotiidi, mis olid suunatud Fas-i mRNA-le AML12-rakkudes, ning leidsid, et neli neist vähendasid märkimisväärselt mRNA taset ja üks neist tekitas stabiilse 3′-mRNA lõhustumisfragmendi, mis vastas antisense-komplementaarsele järjestusele. [5] See uuring tõi esile AML12-rakud kui sobiva mudeli antisense-efektiivsuse hindamiseks ja RNase H-vahendatud RNA lagunemise mehhanismide uurimiseks maksa rakkudes.

Põhjalik tsütogeneetiline ja transkriptomiline profiilimine on kinnitanud, et AML12-rakud säilitavad selge hepatotsüütide liini programmi, milles on tugevalt ekspresseeritud Hnf4a, Foxa2 ja Prox1 tugeva ekspressiooni, tuumases HNF4α valgu olemasolu ning maksastellaatrakkude, kolangiootsüütide ja Kupfferi rakkude liini määravate markerite puudumist. [18] Samas andmekogumist selgus aga selge stressi- ja eellastega seotud transkriptsiooniline signatuur, sealhulgas väga kõrge Spp1/osteopontini, Ccl2 ja Plscr1 ekspressioon koos duktuulide markeritega nagu Krt19, Sox9, Hnf1b ja Jag1. See kahjustusele kohandunud, eellastele sarnane algseisund teeb AML12-st praktilise mudeli hepatotsüütidele omase stressi, põletikuliste signaalide ja epiteeli plastilisuse uurimiseks, eeldusel, et algseisundit võetakse arvesse oksüdatiivse stressi ja toksikoloogiliste uuringute tulemuste tõlgendamisel.

Järeldus

AML12-rakud on endiselt üks laialdasemalt kasutatavaid hiire hepatotsüütide mudeleid maksauuringutes, pakkudes unikaalset tasakaalu diferentseerunud hepatotsüütide funktsiooni ja pikaajalise in vitro stabiilsuse vahel. Selle liini lõid 1994. aastal Wu, Merlino ja Fausto [1] ning sellest ajast alates on seda kasutatud uurimistöös, mis hõlmab mittealkoholist rasvmaksahaigust, ravimite põhjustatud maksakahjustust, lipiidide ainevahetust, insuliiniresistentsust, apoptoosi, hepatotsellulaarset kartsinoomi ja isheemia-reperfusioonikahjustust. Sefriedi ja kolleegide võrdlusuuring piiritles nende insuliinisignalisatsiooni võime piire ning näitas, et glükoneogeneesi ja hepatokiinide näitajate puhul võivad HepG2-rakud tegelikult olla sobivam mudel. [8] Hiljutised tsütogeneetilised ja transkriptoomilised uuringud on dokumenteerinud peaaegu tetraploidset, aneuploidset kariotüüpi ja osalist dediferentseerumist, mis toetab täiendavat valideerimist primaarsetes hepatotsüütides, organoidides või in vivo mudelites, kus on vaja täielikult küpset hepatotsüütide funktsiooni. [18] Neid hoiatusi silmas pidades – olgu siis PPARα farmakoloogia, viirushepatiidi modelleerimise või oksüdatiivse stressi uurimise puhul – pakuvad AML12-rakud usaldusväärset ja hästi iseloomustatud platvormi hüpoteesipõhiseks maksabioloogia uurimiseks. AML12-rakkude tellimiseks või spetsifikatsioonide kohta küsimuste esitamiseks külastage veebilehte cytion.com.

Olulisemad publikatsioonid

1. Wu JC, Merlino G, Fausto N (1994) Transformeeriva kasvufaktori alfa transgeensetest hiirtest pärinevate diferentseerunud, mittetransformeeritud hepatotsüütide rakuliinide loomine ja iseloomustamine. Ameerika Ühendriikide Rahvusliku Teaduste Akadeemia toimetised. PMID: 7904757
2. Wada W, Maeshima A, Zhang YQ (2004) Aktiviini beeta-C-alajao funktsiooni hindamine kultiveeritud hepatotsüütides. American Journal of Physiology. Endokrinoloogia ja ainevahetus. PMID: 15039147
3. Wada W, Medina JJ, Kuwano H (2005) Aktiviini beeta(C)- ja beeta(E)-alarühmade funktsiooni võrdlus AML12 hepatotsüütides. Endokriiniajakiri. PMID: 15863943
4. Lee S, Tarn C, Wang WH (2002) B-hepatiidi viiruse X-valk reguleerib erinevalt rakutsükli kulgu X-transformeeruvates ja mittetransformeeruvates hepatotsüütide (AML12) rakuliinides. The Journal of Biological Chemistry. PMID: 11756437
5. Thonberg H, Dahlgren C, Wahlestedt C (2004) Antisense-indutseeritud Fas-mRNA lagunemine toodab kohaspetsiifilist stabiilset 3'-mRNA-fragmenti eksonukleaasi lõhustamise teel komplementaarsel järjestusel. Oligonukleotiidid. PMID: 15625917
6. Mamoon A, Ventura-Holman T, Maher JF (2008) Retinoehappele reageerivad geenid hiire hepatotsüütide rakuliinis AML 12. Gene. PMID: 18006250
7. Clemenz M, Frost N, Schupp M (2008) Maksaspetsiifilise peroksisomide proliferatsiooni aktiveeriva retseptori alfa sihtgeenide regulatsioon angiotensiini tüübi 1 retseptori blokaatori telmisartaani poolt. Diabetes. PMID: 18184928
8. Sefried S, Häring HU, Weigert C (2018) Hepatotsüütide rakuliinide HepG2, AML12 ja THLE-2 sobivus insuliini signaalimise ja hepatokiinide geeniekspressiooni uurimiseks. Open biology. PMID: 30355754
9. Pierce RH, Campbell JS, Stephenson AB (2000) Redoks-homeostaasi häire tuumornekroosifaktori poolt indutseeritud apoptoosis hiire hepatotsüütide rakuliinis. The American Journal of Pathology. PMID: 10880392
10. Liao JH, Zhou BH, Chai MQ (2001) Tsükloheksimiid blokeerib TGF-beeta1-indutseeritud apoptoosi hiire hepatotsüütides. „Acta pharmacologica Sinica”. PMID: 11741524
11. Dooley S, Hamzavi J, Ciuclan L (2008) Hepatotsüütidele spetsiifiline Smad7-i ekspressioon nõrgendab TGF-beeta poolt vahendatud fibrogeeneesi ja kaitseb maksakahjustuste eest. „Gastroenterology“. PMID: 18602923
12. Huang Z, Zhou X, Nicholson AC (2008) Peroksisomide proliferatsiooni aktiveeriva retseptori alfa aktiveerimine hiirtel indutseerib maksa madala tihedusega lipoproteiini retseptori ekspressiooni. British Journal of Pharmacology. PMID: 18852694
13. Qiu L, Wu X, Chau JF (2008) Aldoosireduktaas reguleerib maksa peroksisomaalse proliferatsiooni aktivaatori poolt aktiveeritud alfa-retseptori fosforüleerimist ja aktiivsust, mõjutades seeläbi lipiidide homöostaasi. The Journal of biological chemistry. PMID: 18445591
14. Butler M, McKay RA, Popoff IJ (2002) PTEN-i ekspressiooni spetsiifiline pärssimine pöörab diabeetilistel hiirtel hüperglükeemia tagasi. Diabetes. PMID: 11916922
15. Choedon T, Mathan G, Arya S (2006) Calotropis procera lateksi vähivastased ja tsütotoksilised omadused hepatotsellulaarse kartsinoomi transgeenses hiiremudelis. World Journal of Gastroenterology. PMID: 16688796
16. Ventura-Holman T, Mamoon A, Subauste JS (2008) Onkoproteiini v-erbA poolt reguleeritud RA-sõltuvate geenide ekspressiooni modulatsioon. Gene. PMID: 18775481
17. Haga S, Terui K, Fukai M (2008) Hepatotsüütide hüpoksia/reoksügenatsiooni kahjustuste ennetamine p66(shc) ablatsiooni abil: antioksüdantide ja antiapoptootiliste valkude ülesreguleerimine. Journal of hepatology. PMID: 18191273
18. Asar DY, Kankel S, Keller DT (2026) Hiire AML12 (Alpha Mouse Liver 12) hepatotsüütide rakuliini põhjalik tsütogeneetiline ja genoomiline profiil. Cells. PMID: 41827824
19. Yoda M, Mizuno R, Izumi Y (2023) Nikotiinamiid-N-metüültransferaas reguleerib AML12 hepatotsüütide rakuliinis lipiidide ainevahetust SAM-i ja 1-metüülnikotiinamiidi kaudu. Journal of biochemistry. PMID: 37014628
20. Bidooki SH, Sánchez-Marco J, Martínez-Beamonte R (2023) Endoplasmaatilise retikuluumi valk TXNDC5 suhtleb PRDX6 ja HSPA9-ga, et reguleerida glutatiooni ainevahetust ja lipiidide peroksüdatsiooni maksa AML12 rakuliinis. International Journal of Molecular Sciences. PMID: 38138960
21. Bidooki SH, Alejo T, Sánchez-Marco J (2022) Skvaleeniga täidetud nanokübemed kaitsevad maksa AML12 rakuliine tõhusalt oksüdatiivse ja endoplasmaatilise retikulumi stressi eest TXNDC5-sõltuvalt. Antioxidants. PMID: 35326231
22. Lee YG, Kim D (2025) Tomatiin parandab glükoosi ainevahetust ja mitokondriaalset hingamist insuliiniresistentsetes hepatotsüütide rakuliinides AML12 ja HepG2 AMP-aktiveeritud proteiinkinaasist sõltuva signaalitee kaudu. Cells. PMID: 40072058