Terreni di coltura cellulare: una panoramica

Nel campo delle scienze della vita, una delle metodologie più importanti è la coltura cellulare. Con l'espressione "coltura cellulare" si intende il prelievo di cellule, tessuti o organi da un animale o da una pianta e il successivo impianto di tali cellule, tessuti o organi in un ambiente artificiale favorevole alla loro sopravvivenza e/o crescita. I requisiti ambientali fondamentali per uno sviluppo cellulare ottimale sono: temperatura controllata, un substrato per l’adesione cellulare, un terreno di coltura adeguato e un’incubatrice che mantenga il pH e l’osmolalità ottimali. Le cellule devono disporre di queste condizioni per poter crescere al massimo del loro potenziale.

La scelta di un terreno di coltura adeguato per la coltivazione in vitro rappresenta la fase più critica e al contempo più vitale della coltura cellulare. Un terreno di coltura, noto anche come mezzo di coltura, è un liquido o un gel formulato per favorire lo sviluppo degli organismi su scala microscopica, cellulare o vegetale. Il terreno utilizzato per la coltura delle cellule contiene spesso un apporto adeguato di energia e sostanze che regolano il ciclo cellulare. I componenti principali di un terreno di coltura includono aminoacidi, vitamine, sali inorganici, glucosio e siero. Il siero viene aggiunto al terreno perché funge da fonte di fattori di crescita, ormoni e fattori di adesione. Oltre a fornire nutrienti, il terreno contribuisce anche al mantenimento dei livelli di pH e osmolalità.

Tipi di terreno utilizzati nella coltura cellulare

Sia le cellule umane che quelle animali possono essere coltivate in un terreno artificiale o sintetico oppure in un terreno interamente naturale, integrato con elementi naturali. Di seguito vi forniremo una panoramica dei diversi tipi di terreni attualmente disponibili.

Terreni naturali

Nei terreni naturali si trovano solo fluidi biologici presenti allo stato naturale. I terreni naturali sono molto utili e semplici da utilizzare per la coltura di un’ampia varietà di tipi di cellule animali. La scarsa comprensione dei componenti precisi che costituiscono i terreni naturali è il fattore principale che contribuisce alla bassa ripetibilità dei risultati ottenuti utilizzando tali terreni.

Terreni artificiali

La preparazione di terreni di coltura artificiali o sintetici comporta l’aggiunta di nutrienti (sia organici che inorganici), proteine sieriche, carboidrati, cofattori, vitamine e sali, nonché delle fasi gassose di O₂ e CO₂ [1].

Sono stati sviluppati vari tipi di terreni di coltura artificiali al fine di soddisfare una o più delle seguenti funzioni: 1) Sopravvivenza immediata (una soluzione salina bilanciata con pH e pressione osmotica precisi). 2) Sopravvivenza prolungata (una soluzione salina bilanciata integrata con diverse formulazioni di sostanze chimiche organiche e/o siero). 3) Sviluppo a tempo indeterminato. 4) Funzioni specializzate.

Esistono quattro classificazioni distinte per i terreni di coltura artificiali:

Terreni contenenti siero

Il tipo più comune di integratore presente nei terreni di coltura utilizzati per la crescita delle cellule animali è il siero fetale bovino. Viene aggiunto al terreno di coltura come integratore a basso costo al fine di ottenere le migliori condizioni di crescita possibili. Oltre a fungere da trasportatore o chelante per nutrienti instabili o insolubili in acqua, ormoni e fattori di crescita, inibitori della proteasi e altre sostanze, il siero lega e neutralizza anche le molecole nocive.

Terreni privi di siero

La presenza di siero nei terreni di coltura presenta una serie di svantaggi e può causare gravi errori di interpretazione nella ricerca immunologica [2, 3]. Sono stati sviluppati diversi tipi di terreni di coltura privi di siero [4, 5]. Questi terreni sono generalmente formulati in modo specifico per supportare la coltura di un singolo tipo di cellula, come il Knockout Serum Replacement e il Knockout DMEM di Thermo Fisher Scientific, e il terreno mTESR di Stem Cell Technologies [6], destinati alle cellule staminali [7].

Inoltre, questi terreni incorporano quantità definite di fattori di crescita purificati, lipoproteine e altre proteine, che altrimenti sarebbero tipicamente fornite dal siero [8]. Questi terreni vengono spesso definiti «terreni di coltura definiti», poiché i componenti che li costituiscono sono ben noti.

Terreni chimicamente definiti

Questi terreni includono componenti inorganici e organici ultrapuri che non sono stati contaminati da alcun tipo di contaminante. Possono anche includere aggiunte di proteine pure, come i fattori di crescita.

 La modificazione genetica di batteri o lieviti, insieme all’aggiunta di particolari acidi grassi, vitamine, colesterolo e aminoacidi, porta alla produzione dei loro componenti [9].

Terreni privi di proteine

I terreni privi di proteine sono quelli che non contengono alcuna proteina, ma solo elementi non proteici. Rispetto ai terreni con aggiunta di siero, l’uso di terreni privi di proteine aggiunte favorisce una maggiore proliferazione cellulare e l’espressione proteica e facilita la purificazione di qualsiasi prodotto generato in un processo a valle [10-12]. Le proteine non sono incluse in formulazioni quali MEM e RPMI-1640. Tuttavia, se necessario, è possibile somministrare un integratore proteico.

Terreni di coltura e loro componenti di base

I terreni di coltura commerciali possono essere acquistati in polvere o in forma liquida e spesso includono una varietà di nutrienti quali aminoacidi, glucosio, sali, vitamine e altri integratori alimentari. 

Il fabbisogno di questi componenti varia a seconda della linea cellulare e tali variazioni sono all’origine dell’ampia varietà di formulazioni dei terreni di coltura. Ciascun componente svolge una determinata funzione, che verrà illustrata nei paragrafi seguenti:

Sistemi tampone

Per mantenere condizioni di crescita ottimali, è necessario controllare il pH, cosa che spesso avviene tramite uno dei due sistemi tampone:

Sistema tampone naturale

Il rapporto CO₂/H₂CO₃ nell’atmosfera è uguale a quello del terreno di coltura, creando un meccanismo tampone naturale. Per preservare il loro meccanismo tampone naturale, le colture devono essere mantenute in un ambiente con il 5-10% di CO₂, cosa che spesso si ottiene utilizzando un’incubatrice a CO₂. Uno dei principali vantaggi dell’utilizzo di un tampone naturale è il suo costo contenuto e la sua sicurezza.

HEPES

Il tamponamento chimico che utilizza lo zwitterione HEPES presenta una maggiore capacità tampone nell’intervallo di pH compreso tra 7,2 e 7,4 e non richiede un ambiente gassoso regolato. Per particolari tipi di cellule, una dose maggiore di HEPES può risultare dannosa. Allo stesso modo, i terreni contenenti HEPES sono molto più sensibili agli effetti fototossici della luce fluorescente [13].

Rosso fenolo

L’indicatore di pH rosso fenolo è spesso incluso nei terreni di coltura disponibili in commercio, consentendo il monitoraggio continuo del pH. Man mano che le cellule si moltiplicano, i metaboliti da esse prodotti causano una variazione del pH e, di conseguenza, un cambiamento di colore del terreno di coltura. Il rosso fenolo ha un duplice effetto sul colore del terreno di coltura, che diventa giallo a pH acido e viola a pH alcalino. Un pH di 7,4, il valore ottimale per la coltura cellulare, fa apparire il terreno di coltura di colore rosso fluorescente.

Tuttavia, il rosso fenolo presenta alcuni svantaggi: in primo luogo, è in grado di simulare l’azione di numerosi ormoni steroidei, in particolare degli estrogeni [14]. Pertanto, quando si studiano cellule sensibili agli estrogeni, come il tessuto mammario, si raccomanda l’uso di un terreno privo di rosso fenolo. L’equilibrio sodio-potassio viene alterato dalla presenza del rosso fenolo in diverse formulazioni prive di siero. L’aggiunta di siero o di ormone ipofisario bovino ai terreni di coltura può contrastare questo effetto [15]. In terzo luogo, la presenza del rosso fenolo ostacola il rilevamento negli esperimenti di citometria a flusso.

Sali inorganici

I terreni di coltura contenenti sali inorganici, quali ioni sodio, potassio e calcio, contribuiscono a mantenere l’equilibrio osmotico e a regolare il potenziale di membrana.

Aminoacidi

Poiché gli aminoacidi sono i componenti fondamentali delle proteine, costituiscono una componente essenziale di ogni singolo terreno di coltura cellulare mai concepito. Poiché le cellule non sono in grado di produrre autonomamente determinati aminoacidi, è importante che il terreno di coltura includa aminoacidi essenziali. Essi sono necessari per la proliferazione cellulare e la loro concentrazione determina la densità cellulare massima raggiungibile. In particolare, la L-glutammina, un amminoacido essenziale, riveste un’importanza cruciale.

La L-glutammina funge da fonte secondaria di energia per il metabolismo e apporta azoto alla produzione di NAD, NADPH e nucleotidi. Poiché la L-glutammina è un amminoacido instabile che, con il tempo, si trasforma in una forma che le cellule non sono in grado di utilizzare, deve essere aggiunta al terreno di coltura.

Inoltre, è possibile aggiungere al terreno di coltura aminoacidi non essenziali per reintegrare quelli consumati durante il processo di crescita. L’integrazione del terreno di coltura con aminoacidi non essenziali stimola la crescita delle cellule e ne aumenta la vitalità.

Carboidrati

I carboidrati sotto forma di zuccheri costituiscono la principale fonte di energia. Molti terreni di coltura contengono, oltre agli zuccheri più comuni quali il glucosio e il galattosio, anche maltosio e fruttosio.

Proteine e peptidi

L'albumina, la transferrina e la fibronectina sono le proteine e i peptidi più comunemente utilizzati. Sono particolarmente importanti nei terreni di coltura che non contengono siero. L'albumina, la transferrina, l'aprotinina, la fetuina e la fibronectina sono alcune delle proteine che si possono trovare nel siero, che costituisce una ricca fonte proteica.

L’albumina è la principale proteina presente nel sangue e la sua funzione è quella di legare e trasportare varie sostanze, tra cui acqua, sali, acidi grassi liberi, ormoni e vitamine, tra i diversi organi e le cellule. La capacità dell’albumina di legarsi alle sostanze chimiche la rende un candidato efficace per la rimozione dei composti nocivi dal terreno in cui vengono coltivate le cellule.

L’aprotinina è un agente protettivo nei sistemi di coltura cellulare, poiché è stabile a pH neutro e acido, oltre che resistente alle alte temperature e alla distruzione che può essere causata dagli enzimi proteolitici. È in grado di inibire numerose proteasi seriniche, tra cui la tripsina, per citarne alcune.

La fetuina è una glicoproteina che può essere rilevata in quantità maggiori nel siero di animali fetali e neonati rispetto al siero degli adulti. Inoltre, agisce come inibitore delle proteasi seriniche. La proteina fibronectina è un componente essenziale nel processo di adesione cellulare. La transferrina è una proteina che trasporta il ferro ed è responsabile del suo apporto alle membrane cellulari.

Acidi grassi e lipidi

Svolgono un ruolo cruciale nel terreno di coltura privo di siero, in assenza di siero.

Vitamine

Numerose vitamine sono necessarie per lo sviluppo e la proliferazione cellulare. Le cellule non sono in grado di produrre vitamine in quantità adeguate; pertanto, nella coltura tissutale sono indispensabili come integratori alimentari.

Nella coltura cellulare, il siero è la fonte primaria di vitamine; tuttavia, i terreni di coltura vengono anche arricchiti con varie vitamine per renderli adatti a un tipo specifico di cellula. In genere, le vitamine del gruppo B vengono utilizzate per stimolare la crescita.

Oligoelementi

Elementi chimici quali rame, zinco, selenio e intermedi dell’acido tricarbossilico sono noti come oligoelementi. Gli oligoelementi vengono spesso aggiunti ai terreni di coltura privi di siero al fine di sostituire quelli tipicamente presenti nel siero. Questi elementi sono importanti componenti chimici necessari per uno sviluppo cellulare sano. Molte reazioni biochimiche dipendono da determinati micronutrienti, come l’attività enzimatica.

Integratori per terreni di coltura

Il terreno di coltura completo raccomandato per determinate linee cellulari necessita di componenti aggiuntivi che non sono presenti nei terreni di base e nel siero. Questi integratori favoriscono la crescita cellulare e il corretto funzionamento metabolico.

Sebbene gli ormoni, i fattori di crescita e le molecole di segnalazione siano essenziali per la corretta proliferazione di particolari linee cellulari, è necessario adottare sempre le seguenti precauzioni: poiché l’aggiunta di integratori potrebbe alterare l’osmolalità del terreno di coltura completo, inibendo lo sviluppo cellulare, è sempre consigliabile verificare l’osmolalità dopo l’aggiunta degli integratori. Per la maggior parte delle linee cellulari, l’osmolalità ottimale varia tra 260 e 320 mOSM/kg.

Antibiotici

Gli antibiotici vengono spesso impiegati per inibire lo sviluppo di contaminanti batterici e fungini [16], sebbene non siano essenziali per la crescita cellulare. Poiché gli antibiotici potrebbero mascherare la contaminazione da micoplasmi e batteri resistenti, il loro uso di routine non è raccomandato per la coltura cellulare [17, 18].

Inoltre, gli antibiotici possono alterare il metabolismo delle cellule ipersensibili. Vengono spesso utilizzate le combinazioni di penicillina e streptomicina prodotte da MilliporeSigma e Life Technologies. Il Plasmocin è stato utilizzato nella coltura delle linee cellulari di glioma TS603, TS516 e BT260 [19] e si è dimostrato efficace nell’eliminare la contaminazione da micoplasmi (20).

Siero

Nel siero sono presenti albumine, fattori di crescita e inibitori della crescita. Il siero è uno dei componenti più significativi del terreno di coltura cellulare poiché fornisce aminoacidi, proteine, vitamine (in particolare quelle liposolubili come A, D, E e K), carboidrati, lipidi, ormoni, fattori di crescita, minerali e oligoelementi.

Il siero di origine fetale e da vitello viene spesso utilizzato per favorire lo sviluppo delle cellule in coltura. Il siero fetale è una fonte abbondante di fattori di crescita ed è adatto alla clonazione cellulare e allo sviluppo di cellule sensibili. A causa delle sue ridotte capacità di stimolare la crescita, il siero di vitello viene impiegato negli esperimenti di inibizione da contatto. I terreni di coltura standard contengono spesso dal 2% al 10% di siero. L’aggiunta di siero al terreno di coltura ha i seguenti scopi [21]:

• Il siero fornisce i nutrienti essenziali per le cellule (sia in soluzione che legati alle proteine).

• Il siero contiene diversi fattori di crescita e ormoni coinvolti nella promozione della crescita e nell’attività cellulare specializzata.

• Fornisce numerose proteine leganti, come l’albumina e la transferrina, che trasportano altre sostanze chimiche all’interno della cellula. Ad esempio, l’albumina trasporta grassi, vitamine, ormoni, ecc. nelle cellule.

• Fornisce inoltre proteine, come la fibronectina, che aumentano l’adesione cellulare al substrato. Inoltre, produce elementi di espansione che favoriscono l’espansione cellulare prima della divisione.

• Fornisce inibitori delle proteasi che impediscono la proteolisi nelle cellule.

• Contiene inoltre minerali quali Na+, K+, Zn2+ e Fe2+.

• Aumenta la viscosità del mezzo, proteggendo così le cellule da lesioni meccaniche durante l’agitazione della coltura in sospensione.

• Funge anche da tampone.

Riferimenti

[1] Morgan J, Morton H, Parker R. Nutrizione delle cellule animali nella coltura tissutale; studi iniziali su un terreno di coltura sintetico. Proc Soc Exp Biol Med. 1950;73:1-8

[2] Kerbel R, Blakeslee D. Rapido assorbimento di un componente del siero fetale bovino da parte delle cellule di mammiferi in coltura. Una potenziale fonte di artefatti negli studi sugli antisieri contro antigeni specifici delle cellule. Immunology. 1976;31:881-91

[3] Sula K, Draber P, Nouza K. L’aggiunta di siero al terreno utilizzato per la preparazione di sospensioni cellulari come possibile fonte di artefatti nelle reazioni cellulo-mediate studiate mediante il test del linfonodo popliteo. J Immunogenet. 1980;7:483-9

[4] Mariani E, Mariani A, Monaco M, Lalli E, Vitale M, Facchini A. Terreni commerciali privi di siero: crescita degli ibridomi e produzione di anticorpi monoclonali. J Immunol Methods. 1991;145:175-83

[5] Barnes D, Sato G. Metodi per la crescita di cellule in coltura in terreno privo di siero. Anal Biochem. 1980;102:255-70

[6] Yu H, Lu S, Gasior K, Singh D, Vazquez Sanchez S, Tapia O, et al. Le chaperone HSP70 trasportano la TDP-43 priva di RNA in gusci sferici liquidi intranucleari anisotropi. Science. 2021;371:

[7] Meharena H, Marco A, Dileep V, Lockshin E, Akatsu G, Mullahoo J, et al. La senescenza indotta dalla sindrome di Down altera l’architettura nucleare dei progenitori neurali. Cell Stem Cell. 2022;29:116-130.e7

[8] Iscove N, Melchers F. Sostituzione completa del siero con albumina, transferrina e lipidi di soia in colture di linfociti B reattivi ai lipopolisaccaridi. J Exp Med. 1978;147:923-33

[9] Stoll T, Muhlethaler K, von Stockar U, Marison I. Miglioramento sistematico di un terreno chimicamente definito e privo di proteine per la crescita di ibridomi e la produzione di anticorpi monoclonali. J Biotechnol. 1996;45:111-23

[10] Darfler F. Un terreno privo di proteine per la crescita di ibridomi e altre cellule del sistema immunitario. In Vitro Cell Dev Biol. 1990;26:769-78

[11] Barnes D, Sato G. Coltura cellulare senza siero: un approccio unificante. Cell. 1980;22:649-55

[12] Hamilton W, Ham R. Crescita clonale di linee cellulari di criceto cinese in terreni privi di proteine. In Vitro. 1977;13:537-47

[13] Zigler J, Lepe Zuniga J, Vistica B, Gery I. Analisi degli effetti citotossici di un terreno di coltura contenente HEPES esposto alla luce. In Vitro Cell Dev Biol. 1985;21:282-7

[14] Berthois Y, Katzenellenbogen J, Katzenellenbogen B. Il rosso fenolo nei terreni di coltura tissutale è un estrogeno debole: implicazioni per lo studio delle cellule sensibili agli estrogeni in coltura. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:2496-500

[15] Karmiol S. Sviluppo di terreni di coltura privi di siero. In: Master JRW, a cura di. Animal Cell culture, 3a ed. Oxford: Oxford University Press; 2000.

[16] Perlman D. Uso degli antibiotici nei terreni di coltura cellulare. Methods Enzymol. 1979;58:110-6

[17] McGarrity G. Diffusione e controllo dell’infezione da micoplasma nelle colture cellulari. In Vitro. 1976;12:643-8

[18] Masters J, Stacey G. Sostituzione del terreno di coltura e passaggi delle linee cellulari. Nat Protoc. 2007;2:2276-84

[19] Chakraborty A, Laukka T, Myllykoski M, Ringel A, Booker M, Tolstorukov M, et al. La demetilasi istonica KDM6A rileva direttamente l’ossigeno per controllare la cromatina e il destino cellulare. Science. 2019;363:1217-1222

[20] Molla Kazemiha V, Azari S, Amanzadeh A, Bonakdar S, Shojaei Moghadam M, Habibi Anbouhi M, et al. Efficacia di Plasmocin™ su varie linee cellulari di mammiferi infettate da mollicuti rispetto agli antibiotici comunemente utilizzati nelle colture cellulari: un’esperienza locale. Cytotechnology. 2011;63:609-20

[21] Kragh Hansen U. Aspetti molecolari del legame dei ligandi con l’albumina sierica. Pharmacol Rev. 1981;33:17-53