Cellekulturmedier: En oversikt

Innenfor biovitenskapene er cellekultur en av de viktigste metodene. Begrepet «cellekultur» refererer til uttak av celler, vev eller organer fra et dyr eller en plante og påfølgende implantering av disse cellene, vevene eller organene i et kunstig miljø som er gunstig for deres overlevelse og/eller vekst. De grunnleggende miljøkravene for optimal celleutvikling er kontrollert temperatur, et underlag for cellefesting, et passende vekstmedium og en inkubator som opprettholder optimal pH og osmolalitet. Cellene må ha disse forholdene for å kunne vokse til sitt fulle potensial.

Valget av et egnet vekstmedium for in vitro-dyrking er den fasen i cellekulturen som er både den mest kritiske og den viktigste. Et vekstmedium, også kjent som dyrkningsmedium, er en væske eller gel som er sammensatt for å fremme organismers utvikling på mikroskopisk, cellulært eller planteaktig nivå. Mediet som brukes til å dyrke celler inneholder ofte en tilstrekkelig tilførsel av energi og stoffer som regulerer cellesyklusen. Hovedkomponentene i et dyrkningsmedium inkluderer aminosyrer, vitaminer, uorganiske salter, glukose og serum. Serumet tilsettes mediet fordi det fungerer som en kilde til vekstfaktorer, hormoner og vedheftsfaktorer. I tillegg til å tilføre næringsstoffer, bidrar mediet også til å opprettholde pH- og osmolalitetsnivåene.

Typer av medier som brukes i cellekultur

Både menneskelige og dyreceller kan dyrkes enten i et kunstig eller syntetisk medium eller i et helt naturlig medium som er tilsatt naturlige elementer. I det følgende gir vi deg en oversikt over de ulike medietyper som er tilgjengelige i dag.

Naturlige medier

Naturlige medier inneholder kun biologiske væsker som finnes i sin naturlige tilstand. Naturlige medier er svært nyttige og enkle å bruke for dyrking av et bredt spekter av dyrecelletyper. Manglende forståelse av de nøyaktige komponentene som utgjør naturlige medier, er den viktigste faktoren som bidrar til den lave repeterbarheten av resultater oppnådd ved bruk av naturlige medier.

Kunstige medier

Fremstillingen av kunstige eller syntetiske medier innebærer tilsetning av næringsstoffer (både organiske og uorganiske), serumproteiner, karbohydrater, kofaktorer, vitaminer og salter, samt O₂- og CO₂-gassfaser [1].

Det er utviklet ulike typer kunstige medier for å oppfylle en eller flere av følgende funksjoner: 1) Umiddelbar overlevelse (en balansert saltløsning med nøyaktig pH og osmotisk trykk). 2) Langvarig overlevelse (en balansert saltløsning tilsatt ulike formuleringer av organiske kjemikalier og/eller serum). 3) Ubegrenset utvikling. 4) Spesialiserte funksjoner.

Det finnes fire forskjellige klassifiseringer av kunstige medier:

Serumholdige medier

Den vanligste typen tilsetning i medier som brukes til dyrking av dyreceller er føtalt bovint serum. Det tilsettes dyrkingsmediet som et kostnadseffektivt tilskudd for å oppnå best mulige vekstforhold. I tillegg til å fungere som transportør eller chelator for næringsstoffer som er ustabile eller vannuoppløselige, hormoner og vekstfaktorer, proteasehemmere og andre stoffer, binder og nøytraliserer serumet også skadelige molekyler.

Serumfritt medium

Tilstedeværelsen av serum i mediet har en rekke ulemper og kan potensielt føre til alvorlige tolkningsfeil i immunologisk forskning [2, 3]. Det er utviklet en rekke ulike serumfrie medier [4, 5]. Disse mediene er generelt spesielt formulert for å støtte dyrking av én enkelt celletype, slik som Knockout Serum Replacement og Knockout DMEM fra Thermo Fisher Scientific, samt mTESR-mediet fra Stem Cell Technologies [6], beregnet på stamceller [7].

I tillegg inneholder disse mediene definerte mengder rensede vekstfaktorer, lipoproteiner og andre proteiner, som ellers vanligvis tilføres via serumet [8]. Disse mediene kalles ofte «definerte dyrkingsmedier», siden komponentene som inngår i dem er godt kjent.

Kjemisk definerte medier

Disse mediene inneholder ultrarene uorganiske og organiske komponenter som ikke er forurenset av noen form for kontaminasjon. De kan også inneholde tilsetninger av rene proteiner, for eksempel vekstfaktorer.

 Genmodifisering av bakterier eller gjær, sammen med tilsetning av bestemte fettsyrer, vitaminer, kolesterol og aminosyrer, resulterer i produksjonen av deres bestanddeler [9].

Proteinfri næringsmedier

Proteinfri næringsmedier er de som ikke inneholder noe protein i det hele tatt, men i stedet kun består av ikke-proteinholdige elementer. Sammenlignet med næringsmedier med tilsatt serum fremmer bruk av næringsmedier uten tilsatt protein større celleproliferasjon og proteinekspresjon, og gjør det enklere å rense ethvert produkt som genereres i en nedstrømsprosess [10–12]. Protein inngår ikke i formuleringer som MEM og RPMI-1640. Imidlertid kan et proteintilskudd tilsettes dersom det er nødvendig.

Dyrkningsmedier og deres grunnleggende komponenter

Kommersielle dyrkningsmedier kan kjøpes som pulver eller væske og inneholder ofte en rekke næringsstoffer som aminosyrer, glukose, salter, vitaminer og andre kosttilskudd. 

Behovet for disse komponentene varierer fra cellelinje til cellelinje, og disse variasjonene er årsaken til det store antallet ulike formuleringer av medier. Hver komponent har en bestemt funksjon, som vil bli beskrevet i de følgende avsnittene:

Buffersystemer

For å opprettholde optimale vekstforhold må pH-verdien kontrolleres, noe som ofte gjøres ved hjelp av ett av to buffersystemer:

Naturlig buffersystem

Forholdet mellom CO₂ og H₂CO₃ i atmosfæren er det samme som i mediet, noe som skaper en naturlig buffermekanisme. For å bevare denne naturlige buffermekanismen må kulturene holdes i et luftmiljø med 5–10 % CO₂, noe som ofte oppnås ved bruk av en CO₂-inkubator. En av de største fordelene ved å bruke en naturlig buffer er at den er billig og sikker.

HEPES

Kjemisk buffering ved hjelp av zwitterionen HEPES har større bufferevne i pH-området 7,2–7,4 og krever ikke et regulert gassmiljø. For visse celletyper kan en større dose HEPES være skadelig. Medier som inneholder HEPES er også mye mer utsatt for de fototoksiske effektene av fluorescerende lys [13].

Fenolrødt

pH-indikatoren fenolrød inngår ofte i kommersielt tilgjengelige dyrkningsmedier, noe som muliggjør kontinuerlig overvåking av pH. Når cellene vokser, forårsaker metabolittene som produseres av disse cellene en endring i pH og dermed en fargeendring i mediet. Fenolrød har en dobbel effekt på mediets farge: det blir gult ved surt pH og lilla ved alkalisk pH. pH 7,4, den optimale verdien for cellekultur, gjør at mediet fremstår som fluorescerende rødt.

Men fenolrød har noen ulemper: For det første kan fenolrød etterligne virkningen av en rekke steroidhormoner, først og fremst østrogen [14]. Derfor anbefales det å bruke et medium uten fenolrød når man studerer østrogenfølsomme celler som brystvev. Natrium-kaliumbalansen forstyrres av tilstedeværelsen av fenolrødt i flere serumfrie formuleringer. Tilsetning av serum eller hypofysehormon fra storfe til mediet kan motvirke denne effekten [15]. For det tredje hindres deteksjonen i strømningscytometriske eksperimenter av tilstedeværelsen av fenolrødt.

Uorganiske salter

Medier som inneholder uorganiske salter, som natrium-, kalium- og kalsiumioner, bidrar til å opprettholde osmotisk likevekt og regulere membranpotensialet.

Aminosyrer

Siden aminosyrer er de grunnleggende komponentene i protein, er de en essensiell del av hvert eneste cellevekstmedium som noensinne er utviklet. Fordi celler ikke er i stand til å produsere visse aminosyrer på egen hånd, er det viktig at dyrkningsmediet inneholder essensielle aminosyrer. De er nødvendige for celleproliferasjon, og konsentrasjonen de forekommer i bestemmer den maksimale celletettheten som kan oppnås. Spesielt er L-glutamin, en essensiell aminosyre, av avgjørende betydning.

L-glutamin fungerer som en sekundær energikilde for stoffskiftet og bidrar med nitrogen til produksjonen av NAD, NADPH og nukleotider. Siden L-glutamin er en ustabil aminosyre som over tid omdannes til en form som cellene ikke kan utnytte, må den tilsettes mediet.

I tillegg kan ikke-essensielle aminosyrer tilsettes vekstmediet for å erstatte de som er blitt forbrukt under vekstprosessen. Cellenes vekst stimuleres og levedyktigheten økes når vekstmediet tilsettes ikke-essensielle aminosyrer.

Karbohydrater

Karbohydrater i form av sukker er den viktigste energikilden. Mange av mediene inneholder også maltose og fruktose i tillegg til de mer vanlige sukkerartene glukose og galaktose.

Proteiner og peptider

Albumin, transferrin og fibronektin er de mest brukte proteinene og peptidene. De er spesielt viktige i medier som ikke inneholder serum. Albumin, transferrin, aprotinin, fetuin og fibronektin er noen av proteinene som kan finnes i serum, som er en rik proteinkilde.

Albumin er det viktigste proteinet i blodet, og dets funksjon er å binde og transportere ulike stoffer, blant annet vann, salter, frie fettsyrer, hormoner og vitaminer, mellom ulike organer og celler. Albumins evne til å binde seg til kjemikalier gjør det til et effektivt middel for å fjerne skadelige forbindelser fra mediet der cellene dyrkes.

Aprotinin er et beskyttende middel i cellekultursystemer, siden det er stabilt ved nøytral og sur pH, samt motstandsdyktig mot høye temperaturer og nedbrytning som kan forårsakes av proteolytiske enzymer. Det er i stand til å hemme en rekke serinproteaser, blant annet trypsin.

Fetuin er et glykoprotein som kan påvises i større mengder i serumet til foster og nyfødte dyr sammenlignet med serum fra voksne. I tillegg fungerer det som en serinproteasehemmer. Proteinet fibronektin er en essensiell komponent i prosessen med celleadhesjon. Transferrin er et protein som transporterer jern og er ansvarlig for å levere jern til cellemembranene.

Fettsyrer og lipider

De spiller en avgjørende rolle i serumfritt medium når serum mangler.

Vitaminer

Mange vitaminer er nødvendige for cellenes utvikling og proliferasjon. Vitaminer kan ikke produseres i tilstrekkelige mengder av cellene og er derfor essensielle i vevskultur som kosttilskudd.

I cellekultur er serum den primære kilden til vitaminer; imidlertid tilsettes også ulike vitaminer i mediet for å tilpasse det til en bestemt celletype. Vanligvis brukes B-vitaminer for å stimulere veksten.

Sporstoffer

Kjemiske elementer som kobber, sink, selen og trikarboxylsyre-mellomprodukter kalles sporstoffer. Sporstoffer tilsettes ofte i medier som ikke inneholder serum for å erstatte de som vanligvis finnes i serum. Disse elementene er viktige kjemiske komponenter som er nødvendige for en sunn celleutvikling. Mange biokjemiske reaksjoner er avhengige av visse mikronæringsstoffer, for eksempel enzymaktivitet.

Medietilskudd

Det komplette vekstmediet som anbefales for visse cellelinjer, trenger ekstra komponenter som ikke finnes i basismediet og serumet. Disse kosttilskuddene støtter cellevekst og riktig metabolsk funksjon.

Selv om hormoner, vekstfaktorer og signalmolekyler er avgjørende for riktig proliferasjon av bestemte cellelinjer, bør følgende forholdsregler alltid tas: Siden tilsetning av kosttilskudd kan endre osmolaliteten i det komplette vekstmediet, noe som kan hemme celleutviklingen, anbefales det alltid å kontrollere osmolaliteten etter at kosttilskuddene er tilsatt. For de fleste cellelinjer ligger den optimale osmolaliteten mellom 260 og 320 mOSM/kg.

Antibiotika

Antibiotika brukes ofte for å hemme utviklingen av bakterielle og soppbaserte forurensninger [16], selv om de ikke er avgjørende for cellevekst. Siden antibiotika kan skjule forurensning av mykoplasma og resistente bakterier, anbefales ikke rutinemessig bruk av dem i cellekulturer [17, 18].

I tillegg kan antibiotika forstyrre stoffskiftet i overfølsomme celler. Kombinasjonene av penicillin og streptomycin produsert av MilliporeSigma og Life Technologies brukes ofte. Plasmocin har blitt brukt i dyrking av gliomcellelinjene TS603, TS516 og BT260 [19], og det har vist seg å være effektivt for å fjerne mykoplasmakontaminering (20).

Serum

Albuminer, vekstfaktorer og veksthemmere finnes alle i serum. Serum er en av de viktigste komponentene i cellekulturmedium fordi det tilfører aminosyrer, proteiner, vitaminer (spesielt fettløselige vitaminer som A, D, E og K), karbohydrater, lipider, hormoner, vekstfaktorer, mineraler og sporstoffer.

Serum fra foster og kalv av storfe brukes ofte for å fremme utviklingen av dyrkede celler. Fosterserum er en rik kilde til vekstfaktorer og egner seg for cellekloning og utvikling av følsomme celler. På grunn av dets reduserte evne til å fremme vekst, brukes kalveserum i kontaktinhibisjonsforsøk. Vanlige vekstmedier inneholder ofte 2–10 % serum. Tilsetning av serum til dyrkningsmediet tjener følgende formål [21]:

• Serumet tilfører cellene essensielle næringsstoffer (både i oppløsning og bundet til proteiner).

• Serumet inneholder flere vekstfaktorer og hormoner som er involvert i vekstfremmende prosesser og spesialisert celleaktivitet.

• Det inneholder mange bindingsproteiner, som albumin og transferrin, som transporterer andre kjemikalier inn i cellen. For eksempel transporterer albumin fett, vitaminer, hormoner osv. inn i cellene.

• Det tilfører også proteiner, som fibronektin, som øker cellenes vedheft til underlaget. I tillegg produserer det spredningselementer som bidrar til celleutvidelse før deling.

• Det leverer proteasehemmere som forhindrer proteolyse i celler.

• Det inneholder også mineraler som Na+, K+, Zn2+ og Fe2+.

• Det øker viskositeten i mediet og beskytter dermed cellene mot mekanisk skade under omrøring i suspensjonskulturen.

• Det fungerer også som en buffer.

Referanser

[1] Morgan J, Morton H, Parker R. Ernæring av dyreceller i vevskultur; innledende studier av et syntetisk medium. Proc Soc Exp Biol Med. 1950;73:1–8

[2] Kerbel R, Blakeslee D. Rask adsorpsjon av en komponent i føtal kalveserum av pattedyrceller i kultur. En potensiell kilde til artefakter i studier av antiserum mot cellespesifikke antigener. Immunology. 1976;31:881-91

[3] Sula K, Draber P, Nouza K. Tilsetning av serum til mediet brukt til fremstilling av cellesuspensjoner som en mulig kilde til artefakter i cellemedierte reaksjoner undersøkt ved hjelp av popliteal lymfeknute-testen. J Immunogenet. 1980;7:483-9

[4] Mariani E, Mariani A, Monaco M, Lalli E, Vitale M, Facchini A. Kommersielle serumfrie medier: hybridomvekst og produksjon av monoklonale antistoffer. J Immunol Methods. 1991;145:175-83

[5] Barnes D, Sato G. Metoder for dyrking av celler i serumfritt medium. Anal Biochem. 1980;102:255-70

[6] Yu H, Lu S, Gasior K, Singh D, Vazquez Sanchez S, Tapia O, m.fl. HSP70-chaperoner transporterer RNA-fritt TDP-43 inn i anisotrope, intranukleære, flytende sfæriske skall. Science. 2021;371:

[7] Meharena H, Marco A, Dileep V, Lockshin E, Akatsu G, Mullahoo J, m.fl. Downsyndrom-indusert senesens forstyrrer kjernestrukturen til nevrale stamceller. Cell Stem Cell. 2022;29:116–130.e7

[8] Iscove N, Melchers F. Fullstendig erstatning av serum med albumin, transferrin og soyalipid i kulturer av lipopolysakkarid-reaktive B-lymfocytter. J Exp Med. 1978;147:923-33

[9] Stoll T, Muhlethaler K, von Stockar U, Marison I. Systematisk forbedring av et kjemisk definert proteinfritt medium for hybridomvekst og produksjon av monoklonale antistoffer. J Biotechnol. 1996;45:111-23

[10] Darfler F. Et proteinfritt medium for vekst av hybridomer og andre celler i immunsystemet. In Vitro Cell Dev Biol. 1990;26:769-78

[11] Barnes D, Sato G. Serumfri cellekultur: en helhetlig tilnærming. Cell. 1980;22:649-55

[12] Hamilton W, Ham R. Klonal vekst av kinesiske hamstercellelinjer i proteinfritt medium. In Vitro. 1977;13:537-47

[13] Zigler J, Lepe Zuniga J, Vistica B, Gery I. Analyse av de cytotoksiske effektene av lysutsatt HEPES-holdig dyrkningsmedium. In Vitro Cell Dev Biol. 1985;21:282-7

[14] Berthois Y, Katzenellenbogen J, Katzenellenbogen B. Fenolrødt i vevskulturmedier er et svakt østrogen: implikasjoner for studiet av østrogenresponsive celler i kultur. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:2496-500

[15] Karmiol S. Utvikling av serumfrie medier. I: Master JRW, red. Animal Cell culture, 3. utg. Oxford: Oxford University Press; 2000.

[16] Perlman D. Bruk av antibiotika i cellekulturmedier. Methods Enzymol. 1979;58:110-6

[17] McGarrity G. Spredning og bekjempelse av mykoplasmainfeksjon i cellekulturer. In Vitro. 1976;12:643-8

[18] Masters J, Stacey G. Bytte av medium og passering av cellelinjer. Nat Protoc. 2007;2:2276–84

[19] Chakraborty A, Laukka T, Myllykoski M, Ringel A, Booker M, Tolstorukov M, et al. Histon-demetylase KDM6A registrerer oksygen direkte for å regulere kromatin og cellenes skjebne. Science. 2019;363:1217-1222

[20] Molla Kazemiha V, Azari S, Amanzadeh A, Bonakdar S, Shojaei Moghadam M, Habibi Anbouhi M, m.fl. Effektiviteten av Plasmocin™ på ulike pattedyrcellelinjer infisert av mollicutes sammenlignet med vanlige antibiotika i cellekultur: en lokal erfaring. Cytotechnology. 2011;63:609-20

[21] Kragh Hansen U. Molekylære aspekter ved ligandbinding til serumalbumin. Pharmacol Rev. 1981;33:17-53