Meios de cultura celular: uma visão geral

No domínio das ciências da vida, uma das metodologias mais importantes é a cultura celular. A remoção de células, tecidos ou órgãos de um animal ou planta e a subsequente implantação dessas células, tecidos ou órgãos num ambiente artificial favorável à sua sobrevivência e/ou crescimento é o que se entende por «cultura celular». As necessidades ambientais fundamentais para o desenvolvimento celular ideal são a temperatura controlada, um substrato para a adesão celular, um meio de crescimento adequado e uma incubadora que mantenha o pH e a osmolalidade ideais. As células necessitam destas condições para crescerem até ao seu pleno potencial.

A seleção de um meio de crescimento adequado para o cultivo in vitro é a etapa da cultura celular que é simultaneamente a mais crítica e a mais vital. Um meio de crescimento, também conhecido como meio de cultura, é um líquido ou gel formulado para estimular o desenvolvimento de organismos à escala microscópica, celular ou vegetal. O meio utilizado para cultivar células contém frequentemente um fornecimento adequado de energia e substâncias que controlam o ciclo celular. Os principais componentes de um meio de cultura incluem aminoácidos, vitaminas, sais inorgânicos, glicose e soro. O soro é adicionado ao meio porque atua como fonte de fatores de crescimento, hormonas e fatores de adesão. Além de fornecer nutrientes, o meio também contribui para a manutenção dos níveis de pH e osmolalidade.

Tipos de meio utilizados na cultura celular

Tanto as células humanas como as animais podem ser cultivadas num meio artificial ou sintético, ou num meio inteiramente natural, suplementado com elementos naturais. A seguir, apresentamos uma visão geral dos diferentes tipos de meios atualmente disponíveis.

Meios naturais

Nos meios naturais, só se encontram fluidos biológicos que existem no seu estado natural. Os meios naturais são muito úteis e fáceis de utilizar para o cultivo de uma ampla variedade de tipos de células animais. A falta de conhecimento sobre os componentes exatos que constituem os meios naturais é o principal fator que contribui para a baixa repetibilidade dos resultados obtidos com a utilização destes meios.

Meios artificiais

A preparação de meios artificiais ou sintéticos envolve a adição de nutrientes (tanto orgânicos como inorgânicos), proteínas séricas, hidratos de carbono, cofatores, vitaminas e sais, bem como as fases gasosas de O₂ e CO₂ [1].

Foram desenvolvidos vários tipos de meios artificiais com o objetivo de cumprir uma ou mais das seguintes funções: 1) Sobrevivência imediata (uma solução salina equilibrada com um pH e uma pressão osmótica precisos). 2) Sobrevivência prolongada (uma solução salina equilibrada suplementada com diferentes formulações de compostos orgânicos e/ou soro). 3) Desenvolvimento por tempo indeterminado. 4) Funções especializadas.

Existem quatro classificações distintas para os meios artificiais:

Meios contendo soro

O tipo de suplemento mais frequente encontrado nos meios utilizados para o crescimento de células animais é o soro fetal bovino. É adicionado ao meio de cultura como um suplemento de baixo custo, a fim de alcançar as melhores condições de crescimento possíveis. Para além de atuar como transportador ou quelante de nutrientes instáveis ou insolúveis em água, hormonas e fatores de crescimento, inibidores de proteases e outras substâncias, o soro também se liga a moléculas nocivas e neutraliza-as.

Meio sem soro

A presença de soro nos meios de cultura apresenta várias desvantagens e tem o potencial de causar erros graves na interpretação da investigação imunológica [2, 3]. Foram criados diversos meios de cultura isentos de soro [4, 5]. Estes meios são geralmente formulados especificamente para suportar a cultura de um único tipo de célula, tais como o Knockout Serum Replacement e o Knockout DMEM da Thermo Fisher Scientific, e o meio mTESR da Stem Cell Technologies [6], para células estaminais [7].

Além disso, estes meios incorporam quantidades definidas de fatores de crescimento purificados, lipoproteínas e outras proteínas, que, de outra forma, seriam normalmente fornecidas pelo soro [8]. Estes meios são frequentemente designados por «meios de cultura definidos», uma vez que os componentes que os constituem são bem conhecidos.

Meios quimicamente definidos

Estes meios incluem componentes inorgânicos e orgânicos ultrapuros que não foram afetados por qualquer tipo de contaminação. Podem também incluir adições de proteínas puras, tais como fatores de crescimento.

 A modificação genética de bactérias ou leveduras, juntamente com a adição de ácidos gordos específicos, vitaminas, colesterol e aminoácidos, resulta na produção dos seus componentes [9].

Meios isentos de proteínas

Os meios isentos de proteínas são aqueles que não incluem qualquer proteína e, em vez disso, incluem apenas elementos não proteicos. Quando comparados com meios com soro adicionado, a utilização de meios sem proteínas adicionadas promove uma maior proliferação celular e expressão proteica e facilita a purificação de qualquer produto gerado num processo a jusante [10-12]. A proteína não está incluída em formulações como o MEM e o RPMI-1640. No entanto, pode ser administrado um suplemento proteico, caso seja necessário.

Meios de cultura e os seus componentes básicos

Os meios de cultura comerciais podem ser adquiridos na forma de pó ou líquido e incluem frequentemente uma variedade de nutrientes, tais como aminoácidos, glicose, sais, vitaminas e outros suplementos alimentares. 

As necessidades destes componentes variam consoante a linha celular, e estas variações são responsáveis pela grande diversidade de formulações de meios de cultura. Cada componente desempenha uma determinada função, que será descrita nos parágrafos seguintes:

Sistemas tampão

Para manter condições de crescimento ideais, o pH deve ser controlado, o que é frequentemente feito por um de dois sistemas tampão:

Sistema tampão natural

A proporção de CO₂/H₂CO₃ na atmosfera é igual à do meio, criando um mecanismo tampão natural. Para preservar este mecanismo tampão natural, as culturas devem ser mantidas num ambiente com 5-10% de CO₂, o que é frequentemente conseguido através da utilização de uma incubadora de CO₂. Uma das principais vantagens da utilização de um tampão natural é o facto de ser económico e seguro.

HEPES

A tamponagem química utilizando o zwitterião HEPES apresenta uma maior capacidade de tamponagem na faixa de pH de 7,2 a 7,4 e não requer um ambiente gasoso regulado. Para determinados tipos de células, uma dose mais elevada de HEPES pode ser prejudicial. Os meios que contêm HEPES são, da mesma forma, muito mais suscetíveis aos efeitos fototóxicos da luz fluorescente [13].

Vermelho de fenol

O indicador de pH vermelho de fenol é frequentemente incluído em meios de cultura disponíveis no mercado, permitindo a monitorização contínua do pH. À medida que as células se multiplicam, os metabolitos por elas produzidos provocam uma alteração no pH e, consequentemente, uma mudança de cor do meio. O vermelho de fenol tem um efeito duplo na cor do meio, tornando-o amarelo em pH ácido e roxo em pH alcalino. O pH 7,4, o valor ideal para a cultura celular, faz com que o meio apresente uma cor vermelha fluorescente.

No entanto, o vermelho de fenol apresenta algumas desvantagens: em primeiro lugar, é capaz de simular a ação de várias hormonas esteróides, principalmente o estrogénio [14]. Por conseguinte, ao estudar células sensíveis ao estrogénio, como o tecido mamário, recomenda-se a utilização de um meio isento de vermelho de fenol. O equilíbrio sódio-potássio é perturbado pela presença de vermelho de fenol em várias formulações sem soro. A adição de soro ou de hormona hipofisária bovina aos meios pode contrariar este efeito [15]. Em terceiro lugar, a deteção em experiências de citometria de fluxo é dificultada pela presença de vermelho de fenol.

Sais inorgânicos

Os meios que contêm sais inorgânicos, tais como iões de sódio, potássio e cálcio, ajudam a manter o equilíbrio osmótico e a regular o potencial de membrana.

Aminoácidos

Uma vez que os aminoácidos são os componentes fundamentais das proteínas, constituem um componente essencial de todos os meios de crescimento celular alguma vez concebidos. Como as células são incapazes de produzir determinados aminoácidos por si próprias, é importante que o meio de cultura inclua aminoácidos essenciais. São necessários para a proliferação celular, e a concentração em que se encontram determina a densidade celular máxima que pode ser atingida. Em particular, a L-glutamina, um aminoácido essencial, é especialmente crucial.

A L-glutamina funciona como fonte secundária de energia para o metabolismo e fornece azoto para a produção de NAD, NADPH e nucleótidos. Dado que a L-glutamina é um aminoácido instável que, com o tempo, se transforma numa forma que as células não conseguem utilizar, deve ser adicionada ao meio de cultura.

Além disso, os aminoácidos não essenciais podem ser fornecidos ao meio de cultura, a fim de repor aqueles que foram consumidos ao longo do processo de crescimento. O crescimento das células é estimulado e a sua viabilidade é aumentada quando o meio de cultura é suplementado com aminoácidos não essenciais.

Hidratos de carbono

Os hidratos de carbono sob a forma de açúcares são a principal fonte de energia. Muitos dos meios incluem também maltose e frutose, para além dos açúcares mais comuns, como a glicose e a galactose.

Proteínas e péptidos

A albumina, a transferrina e a fibronectina são as proteínas e os péptidos mais frequentemente utilizados. São especialmente importantes em meios que não incluem soro. A albumina, a transferrina, a aprotinina, a fetuína e a fibronectina são algumas das proteínas que podem ser encontradas no soro, que constitui uma fonte rica em proteínas.

A albumina é a principal proteína presente no sangue e a sua função consiste em ligar e transportar várias substâncias — incluindo água, sais, ácidos gordos livres, hormonas e vitaminas — entre diferentes órgãos e células. A capacidade da albumina de se ligar a substâncias químicas torna-a uma candidata eficaz para remover compostos nocivos do meio em que as células são cultivadas.

A aprotinina é um agente protetor em sistemas de cultura celular, uma vez que é estável em pH neutro e ácido, bem como resistente a altas temperaturas e à destruição que pode ser causada por enzimas proteolíticas. É capaz de inibir várias proteases de serina, incluindo a tripsina, entre outras.

A fetuína é uma glicoproteína que pode ser detetada em quantidades mais elevadas no soro de fetos e recém-nascidos, em comparação com o soro de adultos. Além disso, atua como inibidor de proteases de serina. A proteína fibronectina é um componente essencial no processo de adesão celular. A transferrina é uma proteína que transporta ferro e é responsável pelo fornecimento de ferro às membranas celulares.

Ácidos gordos e lípidos

Desempenham um papel crucial em meios sem soro, quando este está ausente.

Vitaminas

São necessárias inúmeras vitaminas para o desenvolvimento e a proliferação celular. As vitaminas não podem ser produzidas em quantidades adequadas pelas células, sendo, por isso, essenciais na cultura de tecidos como suplementos alimentares.

Na cultura celular, o soro é a principal fonte de vitaminas; no entanto, os meios também são enriquecidos com várias vitaminas para se adequarem a um tipo específico de célula. Normalmente, as vitaminas do grupo B são utilizadas para estimular o crescimento.

Oligoelementos

Elementos químicos como o cobre, o zinco, o selénio e os intermediários do ácido tricarboxílico são conhecidos como oligoelementos. Os oligoelementos são frequentemente adicionados a meios que não incluem soro, a fim de substituir aqueles que estão normalmente presentes no soro. Estes elementos são componentes químicos importantes, necessários para o desenvolvimento saudável das células. Muitas reações bioquímicas dependem de determinados micronutrientes, como a atividade enzimática.

Suplementos para meios de cultura

O meio de crescimento completo recomendado para determinadas linhas celulares necessita de componentes adicionais que estão ausentes dos meios de base e do soro. Estes suplementos alimentares apoiam o crescimento celular e o funcionamento metabólico adequado.

Embora as hormonas, os fatores de crescimento e as moléculas de sinalização sejam essenciais para a proliferação adequada de determinadas linhas celulares, devem ser sempre tomadas as seguintes precauções: uma vez que a adição de suplementos pode alterar a osmolalidade do meio de crescimento completo, o que pode inibir o desenvolvimento celular, é sempre aconselhável verificar a osmolalidade após a adição dos suplementos. Para a maioria das linhas celulares, a osmolalidade ideal situa-se entre 260 e 320 mOSM/kg.

Antibióticos

Os antibióticos são frequentemente utilizados para inibir o desenvolvimento de contaminantes bacterianos e fúngicos [16], embora não sejam essenciais para o crescimento celular. Uma vez que os antibióticos podem ocultar a contaminação por micoplasmas e bactérias resistentes, a sua utilização de rotina não é recomendada para a cultura celular [17, 18].

Além disso, os antibióticos podem perturbar o metabolismo de células hipersensíveis. São frequentemente utilizadas as combinações de penicilina e estreptomicina fabricadas pela MilliporeSigma e pela Life Technologies. A plasmocina tem sido utilizada na cultura das linhas celulares de glioma TS603, TS516 e BT260 [19], tendo-se revelado eficaz na remoção da contaminação por micoplasma (20).

Soro

O soro contém albuminas, fatores de crescimento e inibidores de crescimento. O soro é um dos componentes mais importantes do meio de cultura celular, pois fornece aminoácidos, proteínas, vitaminas (especialmente vitaminas lipossolúveis, como A, D, E e K), hidratos de carbono, lípidos, hormonas, fatores de crescimento, minerais e oligoelementos.

O soro de origem fetal e de vitelo bovino é frequentemente utilizado para promover o desenvolvimento de células em cultura. O soro fetal é uma fonte abundante de fatores de crescimento e é adequado para a clonagem celular e o desenvolvimento de células sensíveis. Devido às suas capacidades reduzidas de promoção do crescimento, o soro de vitelo é utilizado em experiências de inibição por contacto. Os meios de crescimento normais incluem frequentemente 2% a 10% de soro. A adição de soro ao meio de cultura tem os seguintes objetivos [21]:

• O soro fornece os nutrientes essenciais às células (tanto em solução como ligados a proteínas).

• O soro contém vários fatores de crescimento e hormonas envolvidos na promoção do crescimento e na atividade celular especializada.

• Fornece muitas proteínas de ligação, como a albumina e a transferrina, que transportam outras substâncias químicas para o interior da célula. Por exemplo, a albumina transporta gorduras, vitaminas, hormonas, etc., para as células.

• Fornece também proteínas, como a fibronectina, que aumentam a adesão celular ao substrato. Além disso, produz elementos de espalhamento que auxiliam na expansão celular antes da divisão.

• Fornece inibidores de proteases que impedem a proteólise nas células.

• Contém ainda minerais como Na+, K+, Zn2+ e Fe2+.

• Aumenta a viscosidade do meio, protegendo assim as células de lesões mecânicas durante a agitação da cultura em suspensão.

• Funciona também como tampão.

Referências

[1] Morgan J, Morton H, Parker R. Nutrição de células animais em cultura de tecidos; estudos iniciais sobre um meio sintético. Proc Soc Exp Biol Med. 1950;73:1-8

[2] Kerbel R, Blakeslee D. Adsorção rápida de um componente do soro fetal bovino por células de mamíferos em cultura. Uma fonte potencial de artefactos em estudos de antisoros contra antigénios específicos de células. Immunology. 1976;31:881-91

[3] Sula K, Draber P, Nouza K. A adição de soro ao meio utilizado na preparação de suspensões celulares como possível fonte de artefactos em reações mediadas por células estudadas através do teste do linfonodo poplíteo. J Immunogenet. 1980;7:483-9

[4] Mariani E, Mariani A, Monaco M, Lalli E, Vitale M, Facchini A. Meios comerciais isentos de soro: crescimento de hibridomas e produção de anticorpos monoclonais. J Immunol Methods. 1991;145:175-83

[5] Barnes D, Sato G. Métodos para o crescimento de células em cultura em meio sem soro. Anal Biochem. 1980;102:255-70

[6] Yu H, Lu S, Gasior K, Singh D, Vazquez Sanchez S, Tapia O, et al. As proteínas chaperonas HSP70 transportam a TDP-43, isenta de ARN, para invólucros esféricos líquidos intranucleares anisotrópicos. Science. 2021;371:

[7] Meharena H, Marco A, Dileep V, Lockshin E, Akatsu G, Mullahoo J, et al. A senescência induzida pela síndrome de Down perturba a arquitetura nuclear dos progenitores neurais. Cell Stem Cell. 2022;29:116-130.e7

[8] Iscove N, Melchers F. Substituição completa do soro por albumina, transferrina e lípidos de soja em culturas de linfócitos B reativos ao lipopolissacarídeo. J Exp Med. 1978;147:923-33

[9] Stoll T, Muhlethaler K, von Stockar U, Marison I. Melhoria sistemática de um meio quimicamente definido e isento de proteínas para o crescimento de hibridomas e a produção de anticorpos monoclonais. J Biotechnol. 1996;45:111-23

[10] Darfler F. Um meio isento de proteínas para o crescimento de hibridomas e outras células do sistema imunitário. In Vitro Cell Dev Biol. 1990;26:769-78

[11] Barnes D, Sato G. Cultura celular sem soro: uma abordagem unificadora. Cell. 1980;22:649-55

[12] Hamilton W, Ham R. Crescimento clonal de linhas celulares de hamster chinês em meios isentos de proteínas. In Vitro. 1977;13:537-47

[13] Zigler J, Lepe Zuniga J, Vistica B, Gery I. Análise dos efeitos citotóxicos de um meio de cultura contendo HEPES exposto à luz. In Vitro Cell Dev Biol. 1985;21:282-7

[14] Berthois Y, Katzenellenbogen J, Katzenellenbogen B. O vermelho de fenol nos meios de cultura de tecidos é um estrogénio fraco: implicações para o estudo de células sensíveis ao estrogénio em cultura. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:2496-500

[15] Karmiol S. Desenvolvimento de meios sem soro. Em: Master JRW, editor. Animal Cell culture, 3.ª ed. Oxford: Oxford University Press; 2000.

[16] Perlman D. Utilização de antibióticos em meios de cultura celular. Methods Enzymol. 1979;58:110-6

[17] McGarrity G. Propagação e controlo da infeção por micoplasmas em culturas celulares. In Vitro. 1976;12:643-8

[18] Masters J, Stacey G. Substituição do meio e passagem de linhas celulares. Nat Protoc. 2007;2:2276-84

[19] Chakraborty A, Laukka T, Myllykoski M, Ringel A, Booker M, Tolstorukov M, et al. A desmetilase de histonas KDM6A deteta diretamente o oxigénio para controlar a cromatina e o destino celular. Science. 2019;363:1217-1222

[20] Molla Kazemiha V, Azari S, Amanzadeh A, Bonakdar S, Shojaei Moghadam M, Habibi Anbouhi M, et al. Eficácia do Plasmocin™ em várias linhas celulares de mamíferos infetadas por mollicutes, em comparação com antibióticos habitualmente utilizados em cultura celular: uma experiência local. Cytotechnology. 2011;63:609-20

[21] Kragh Hansen U. Aspectos moleculares da ligação de ligantes à albumina sérica. Pharmacol Rev. 1981;33:17-53