Cellodlingsmedier: En översikt

Inom biovetenskapen är cellodling en av de viktigaste metoderna. Med begreppet ”cellodling” avses uttag av celler, vävnader eller organ från ett djur eller en växt och den efterföljande implanteringen av dessa celler, vävnader eller organ i en artificiell miljö som främjar deras överlevnad och/eller tillväxt. De grundläggande miljökraven för optimal cellutveckling är kontrollerad temperatur, ett substrat för cellfästning, ett lämpligt odlingsmedium och en inkubator som upprätthåller optimalt pH och osmolalitet. Cellerna måste ha dessa förhållanden för att kunna växa till sin fulla potential.

Valet av ett lämpligt odlingsmedium för in vitro-odling är det steg i cellodlingen som är både det mest kritiska och det viktigaste. Ett odlingsmedium, även kallat odlingsmiljö, är en vätska eller gel som är sammansatt för att främja organismers utveckling på mikroskopisk, cellulär eller växtliknande nivå. Det medium som används för att odla celler innehåller ofta en tillräcklig tillförsel av energi och ämnen som reglerar cellcykeln. De viktigaste beståndsdelarna i ett odlingsmedium är aminosyror, vitaminer, oorganiska salter, glukos och serum. Serum tillsätts till mediet eftersom det fungerar som en källa till tillväxtfaktorer, hormoner och vidhäftningsfaktorer. Förutom att tillföra näringsämnen bidrar mediet också till att upprätthålla pH-värdet och osmolaliteten.

Typer av odlingsmedier som används vid cellodling

Både mänskliga och djurceller kan odlas i antingen ett artificiellt eller syntetiskt medium eller i ett helt naturligt medium som kompletteras med naturliga beståndsdelar. Nedan ger vi en översikt över de olika typer av odlingsmedier som finns tillgängliga idag.

Naturliga odlingsmedier

Naturliga medier innehåller endast biologiska vätskor som förekommer i sitt naturliga tillstånd. Naturliga medier är mycket användbara och lämpliga för odling av en bred variation av djurcelltyper. Bristen på kunskap om de exakta beståndsdelarna i naturliga medier är den främsta faktorn som bidrar till den låga repeterbarheten hos resultat som erhålls med naturliga medier.

Konstgjorda odlingsmedier

Framställningen av artificiella eller syntetiska odlingsmedier innebär tillsats av näringsämnen (både organiska och oorganiska), serumproteiner, kolhydrater, kofaktorer, vitaminer och salter, samt gasfaserna O₂ och CO₂ [1].

Olika typer av artificiella odlingsmedier har utvecklats för att uppfylla en eller flera av följande funktioner: 1) Omedelbar överlevnad (en balanserad saltlösning med exakt pH-värde och osmotiskt tryck). 2) Förlängd överlevnad (en balanserad saltlösning kompletterad med olika formuleringar av organiska kemikalier och/eller serum). 3) Utveckling under obegränsad tid. 4) Specialiserade funktioner.

Det finns fyra olika klassificeringar av artificiella odlingsmedier:

Seruminnehållande medier

Den vanligaste typen av tillskott i odlingsmedier för djurceller är fetalt bovint serum. Det tillsätts till odlingsmediet som ett kostnadseffektivt tillskott för att uppnå bästa möjliga tillväxtförhållanden. Förutom att fungera som transportör eller kelator för näringsämnen som är instabila eller vattenolösliga, hormoner och tillväxtfaktorer, proteasinhibitorer och andra ämnen, binder och neutraliserar serumet även skadliga molekyler.

Serumfria odlingsmedier

Förekomsten av serum i odlingsmediet har ett antal nackdelar och kan leda till allvarliga tolkningsfel inom immunologisk forskning [2, 3]. En rad olika serumfria odlingsmedier har tagits fram [4, 5]. Dessa odlingsmedier är i allmänhet specifikt framtagna för att stödja odling av en enda celltyp, såsom Knockout Serum Replacement och Knockout DMEM från Thermo Fisher Scientific, samt mTESR-mediet från Stem Cell Technologies [6], avsett för stamceller [7].

Dessutom innehåller dessa odlingsmedier definierade mängder av renade tillväxtfaktorer, lipoproteiner och andra proteiner, som annars vanligtvis tillförs via serumet [8]. Dessa odlingsmedier kallas ofta för ”definierade odlingsmedier”, eftersom de komponenter som ingår i dem är välkända.

Kemiskt definierade odlingsmedier

Dessa medier innehåller ultrarena oorganiska och organiska komponenter som inte har kontaminerats på något sätt. De kan även innehålla tillsatser av rena proteiner, såsom tillväxtfaktorer.

 Genetisk modifiering av bakterier eller jäst, tillsammans med tillsats av vissa fettsyror, vitaminer, kolesterol och aminosyror, leder till produktion av deras beståndsdelar [9].

Proteinfritt odlingsmedium

Proteinfritt odlingsmedium är sådant som inte innehåller något protein alls utan endast icke-proteinhaltiga beståndsdelar. Jämfört med odlingsmedium med tillsatt serum främjar användningen av odlingsmedium utan tillsatt protein större cellproliferation och proteinexpression samt underlättar reningen av eventuella produkter som genereras i en efterföljande process [10–12]. Protein ingår inte i formuleringar som MEM och RPMI-1640. Ett proteintillskott kan dock administreras om det är nödvändigt.

Odlingsmedier och deras grundläggande beståndsdelar

Kommersiella odlingsmedier kan köpas i pulver- eller flytande form och innehåller ofta en mängd olika näringsämnen, såsom aminosyror, glukos, salter, vitaminer och andra kosttillskott. 

Behovet av dessa komponenter varierar mellan olika cellinjer, och dessa variationer ligger till grund för det stora antalet olika mediesammansättningar. Varje komponent har en specifik funktion, som beskrivs i följande avsnitt:

Buffertsystem

För att upprätthålla optimala odlingsförhållanden måste pH-värdet regleras, vilket ofta sker med hjälp av ett av två buffertsystem:

Naturligt buffertsystem

Förhållandet mellan CO₂ och H₂CO₃ i atmosfären är detsamma som i odlingsmediet, vilket skapar en naturlig buffringsmekanism. För att bevara denna naturliga buffringsmekanism måste odlingarna hållas i en luftmiljö med 5–10 % CO₂, vilket ofta uppnås genom användning av en CO₂-inkubator. En av de största fördelarna med att använda en naturlig buffert är att den är både billig och säker.

HEPES

Kemisk buffring med hjälp av zwitterjonen HEPES har en större buffringsförmåga i pH-intervallet 7,2–7,4 och kräver ingen reglerad gasmiljö. För vissa celltyper kan en högre dos av HEPES vara skadlig. Medier som innehåller HEPES är dessutom betydligt mer känsliga för de fototoxiska effekterna av fluorescerande ljus [13].

Fenolrött

pH-indikatorn fenolrött ingår ofta i kommersiellt tillgängliga odlingsmedier, vilket möjliggör kontinuerlig övervakning av pH-värdet. När cellerna förökar sig orsakar de metaboliter som dessa celler producerar en förskjutning av pH-värdet och därmed en färgförändring i odlingsmediet. Fenolrött har en dubbel effekt på mediets färg: det blir gult vid surt pH och lila vid alkaliskt pH. Vid pH 7,4 – det optimala värdet för cellodling – får mediet en fluorescerande röd färg.

Men fenolrött har några nackdelar: För det första kan fenolrött efterlikna verkan hos ett antal steroidhormoner, främst östrogen [14]. Därför rekommenderas ett medium utan fenolrött vid studier av östrogenkänsliga celler, såsom bröstvävnad. Natrium-kaliumbalansen störs av förekomsten av fenolrött i flera serumfria formuleringar. Tillsats av serum eller bovint hypofyshormon till medierna kan motverka denna effekt [15]. För det tredje hindras detekteringen i flödescytometriska experiment av förekomsten av fenolrött.

Oorganiska salter

Medier som innehåller oorganiska salter, såsom natrium-, kalium- och kalciumjoner, bidrar till att upprätthålla osmotisk jämvikt och reglera membranpotentialen.

Aminosyror

Eftersom aminosyror är de grundläggande beståndsdelarna i protein är de en väsentlig komponent i varje enskilt cellodlingsmedium som någonsin har utvecklats. Eftersom celler inte kan producera vissa aminosyror på egen hand är det viktigt att odlingsmediet innehåller essentiella aminosyror. De är nödvändiga för cellernas förökning, och den koncentration i vilken de förekommer avgör den maximala celltäthet som kan uppnås. I synnerhet är L-glutamin, en essentiell aminosyra, särskilt viktig.

L-glutamin fungerar som en sekundär energikälla för ämnesomsättningen och tillför kväve till produktionen av NAD, NADPH och nukleotider. Eftersom L-glutamin är en instabil aminosyra som med tiden omvandlas till en form som cellerna inte kan utnyttja måste den tillföras odlingsmediet.

Dessutom kan icke-essentiella aminosyror tillföras odlingsmediet för att fylla på de som har förbrukats under tillväxtprocessen. Cellernas tillväxt stimuleras och deras livskraft ökar när odlingsmediet berikas med icke-essentiella aminosyror.

Kolhydrater

Kolhydrater i form av sockerarter är den huvudsakliga energikällan. Många odlingsmedier innehåller även maltos och fruktos utöver de vanligare sockerarterna glukos och galaktos.

Proteiner och peptider

Albumin, transferrin och fibronektin är de vanligaste proteinerna och peptiderna. De är särskilt viktiga i odlingsmedier som inte innehåller serum. Albumin, transferrin, aprotinin, fetuin och fibronektin är några av de proteiner som kan förekomma i serum, vilket är en rik proteinkälla.

Albumin är det dominerande proteinet i blodet och har till uppgift att binda och transportera olika ämnen, däribland vatten, salter, fria fettsyror, hormoner och vitaminer, mellan olika organ och celler. Albumins förmåga att binda till kemikalier gör det till ett effektivt medel för att avlägsna skadliga föreningar från det odlingsmedium där cellerna odlas.

Aprotinin är ett skyddsmedel i cellodlingssystem, eftersom det är stabilt vid neutralt och surt pH samt tål höga temperaturer och den nedbrytning som kan orsakas av proteolytiska enzymer. Det kan hämma ett antal serinproteaser, däribland trypsin.

Fetuin är ett glykoprotein som kan påvisas i högre halter i serum från foster och nyfödda djur jämfört med serum från vuxna. Dessutom fungerar det som en serinproteasinhibitor. Proteinet fibronektin är en väsentlig komponent i processen för celladhesion. Transferrin är ett protein som transporterar järn och ansvarar för att leverera järn till cellmembranen.

Fettsyror och lipider

De spelar en avgörande roll i serumfritt medium när serum saknas.

Vitaminer

Många vitaminer är nödvändiga för cellernas utveckling och förökning. Cellerna kan inte själva producera tillräckliga mängder av vitaminer, vilket gör att de är nödvändiga som kosttillskott vid vävnadsodling.

I cellodling är serum den primära källan till vitaminer; dock berikas odlingsmedierna även med olika vitaminer för att anpassa dem till en specifik celltyp. Vanligtvis används B-vitaminer för att stimulera tillväxten.

Spårämnen

Kemiska grundämnen som koppar, zink, selen och mellanprodukter av trikarbonsyror kallas spårämnen. Spårämnen tillsätts ofta i medier som inte innehåller serum för att ersätta de ämnen som vanligtvis finns i serum. Dessa ämnen är viktiga kemiska komponenter som krävs för en sund cellutveckling. Många biokemiska reaktioner är beroende av vissa mikronäringsämnen, till exempel enzymaktivitet.

Medietillskott

Det fullständiga odlingsmediet som rekommenderas för vissa cellinjer behöver extra komponenter som saknas i basmediet och serumet. Dessa kosttillskott stödjer celltillväxt och korrekt ämnesomsättning.

Även om hormoner, tillväxtfaktorer och signalmolekyler är nödvändiga för en korrekt proliferation av vissa cellinjer, bör följande försiktighetsåtgärder alltid vidtas: Eftersom tillsats av kosttillskott kan förändra osmolaliteten i det fullständiga odlingsmediet, vilket kan hämma cellutvecklingen, är det alltid tillrådligt att kontrollera osmolaliteten efter att kosttillskott har tillsatts. För de flesta cellinjer ligger den optimala osmolaliteten mellan 260 och 320 mOSM/kg.

Antibiotika

Antibiotika används ofta för att hämma tillväxten av bakterier och svampar [16], även om de inte är nödvändiga för celltillväxten. Eftersom antibiotika kan dölja kontaminering av mykoplasma och resistenta bakterier rekommenderas inte rutinmässig användning av dem vid cellodling [17, 18].

Dessutom kan antibiotika störa ämnesomsättningen hos överkänsliga celler. De penicillin-streptomycin-kombinationer som tillverkas av MilliporeSigma och Life Technologies används ofta. Plasmocin har använts vid odling av gliomcellinjerna TS603, TS516 och BT260 [19], och det har visat sig vara effektivt för att eliminera mykoplasmakontaminering (20).

Serum

Albuminer, tillväxtfaktorer och tillväxthämmare finns alla i serum. Serum är en av de viktigaste komponenterna i cellodlingsmedium eftersom det tillför aminosyror, proteiner, vitaminer (särskilt fettlösliga vitaminer som A, D, E och K), kolhydrater, lipider, hormoner, tillväxtfaktorer, mineraler och spårämnen.

Serum från foster och kalvar används ofta för att främja utvecklingen av odlade celler. Fosterserum är en rik källa till tillväxtfaktorer och lämpar sig för cellkloning och utveckling av känsliga celler. På grund av dess minskade tillväxtfrämjande egenskaper används kalvserum i kontaktinhibitionsförsök. Normala odlingsmedier innehåller ofta 2–10 % serum. Tillsatsen av serum till odlingsmediet tjänar följande syften [21]:

• Serumet tillför cellerna nödvändiga näringsämnen (både i lösning och bundna till proteiner).

• Serumet innehåller flera tillväxtfaktorer och hormoner som bidrar till tillväxtfrämjande och specialiserad cellaktivitet.

• Det innehåller många bindande proteiner, såsom albumin och transferrin, som transporterar andra ämnen in i cellen. Albumin transporterar till exempel fetter, vitaminer, hormoner m.m. in i cellerna.

• Det tillför även proteiner, såsom fibronektin, som ökar cellernas vidhäftning till substratet. Dessutom producerar det spridningsfaktorer som underlättar cellernas utbredning före celldelning.

• Det tillför proteasinhibitorer som förhindrar proteolys i cellerna.

• Det innehåller även mineraler såsom Na+, K+, Zn2+ och Fe2+.

• Det ökar mediets viskositet och skyddar därmed cellerna från mekanisk skada under omrörning i suspensionskulturen.

• Det fungerar även som en buffert.

Referenser

[1] Morgan J, Morton H, Parker R. Näring för djurceller i vävnadsodling; inledande studier av ett syntetiskt medium. Proc Soc Exp Biol Med. 1950;73:1-8

[2] Kerbel R, Blakeslee D. Snabb adsorption av en komponent i fosterkalvserum av däggdjursceller i odling. En potentiell källa till artefakter i studier av antiserum mot cellspecifika antigener. Immunology. 1976;31:881-91

[3] Sula K, Draber P, Nouza K. Tillsats av serum till det medium som används för beredning av cellsuspensioner som en möjlig källa till artefakter i cellmedierade reaktioner studerade med hjälp av poplitealt lymfkörteltest. J Immunogenet. 1980;7:483-9

[4] Mariani E, Mariani A, Monaco M, Lalli E, Vitale M, Facchini A. Kommersiella serumfria odlingsmedier: hybridomtillväxt och produktion av monoklonala antikroppar. J Immunol Methods. 1991;145:175-83

[5] Barnes D, Sato G. Metoder för odling av celler i serumfritt medium. Anal Biochem. 1980;102:255-70

[6] Yu H, Lu S, Gasior K, Singh D, Vazquez Sanchez S, Tapia O, m.fl. HSP70-chaperoner transporterar RNA-fritt TDP-43 in i anisotropa, intranukleära, flytande sfäriska skal. Science. 2021;371:

[7] Meharena H, Marco A, Dileep V, Lockshin E, Akatsu G, Mullahoo J, m.fl. Downsyndrom-inducerad senescens stör kärnarkitekturen hos neurala progenitorceller. Cell Stem Cell. 2022;29:116–130.e7

[8] Iscove N, Melchers F. Fullständig ersättning av serum med albumin, transferrin och sojalipid i odlingar av lipopolysackaridreaktiva B-lymfocyter. J Exp Med. 1978;147:923-33

[9] Stoll T, Muhlethaler K, von Stockar U, Marison I. Systematisk förbättring av ett kemiskt definierat proteinfritt medium för hybridomtillväxt och produktion av monoklonala antikroppar. J Biotechnol. 1996;45:111-23

[10] Darfler F. Ett proteinfritt medium för odling av hybridomer och andra celler i immunsystemet. In Vitro Cell Dev Biol. 1990;26:769-78

[11] Barnes D, Sato G. Serumfri cellodling: en enhetlig metod. Cell. 1980;22:649-55

[12] Hamilton W, Ham R. Klonal odling av cellinjer från kinesisk hamster i proteinfritt medium. In Vitro. 1977;13:537-47

[13] Zigler J, Lepe Zuniga J, Vistica B, Gery I. Analys av de cytotoxiska effekterna av ljusexponerat HEPES-innehållande odlingsmedium. In Vitro Cell Dev Biol. 1985;21:282-7

[14] Berthois Y, Katzenellenbogen J, Katzenellenbogen B. Fenolrött i vävnadsodlingsmedier är ett svagt östrogen: implikationer för studien av östrogenresponsiva celler i odling. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:2496-500

[15] Karmiol S. Utveckling av serumfria medier. I: Master JRW, red. Animal Cell culture, 3:e uppl. Oxford: Oxford University Press; 2000.

[16] Perlman D. Användning av antibiotika i cellodlingsmedier. Methods Enzymol. 1979;58:110-6

[17] McGarrity G. Spridning och bekämpning av mykoplasmainfektioner i cellkulturer. In Vitro. 1976;12:643-8

[18] Masters J, Stacey G. Byte av odlingsmedium och passering av cellinjer. Nat Protoc. 2007;2:2276–84

[19] Chakraborty A, Laukka T, Myllykoski M, Ringel A, Booker M, Tolstorukov M, m.fl. Histondemetylaset KDM6A känner direkt av syre för att reglera kromatin och cellernas öde. Science. 2019;363:1217-1222

[20] Molla Kazemiha V, Azari S, Amanzadeh A, Bonakdar S, Shojaei Moghadam M, Habibi Anbouhi M, m.fl. Effektiviteten hos Plasmocin™ på olika däggdjurscellinjer infekterade av mollicutes jämfört med vanligt förekommande antibiotika i cellodling: en lokal erfarenhet. Cytotechnology. 2011;63:609-20

[21] Kragh Hansen U. Molekylära aspekter av ligandbindning till serumalbumin. Pharmacol Rev. 1981;33:17-53