Cellekulturmedier: Et overblik

Inden for biovidenskab er cellekultur en af de vigtigste metoder. Udtrykket "cellekultur" dækker over udtagning af celler, væv eller organer fra et dyr eller en plante og den efterfølgende implantering af disse celler, væv eller organer i et kunstigt miljø, der er gunstigt for deres overlevelse og/eller vækst. De grundlæggende miljømæssige forudsætninger for optimal celleudvikling er kontrolleret temperatur, et substrat, som cellerne kan hæfte sig til, et passende vækstmedium samt en inkubator, der opretholder den optimale pH-værdi og osmolalitet. Cellerne skal have disse betingelser for at kunne vokse til deres fulde potentiale.

Valget af et passende vækstmedium til in vitro-dyrkning er den fase i cellekulturen, der er både den mest kritiske og den mest afgørende. Et vækstmedium, også kendt som dyrkningsmedium, er en væske eller gel, der er sammensat med henblik på at fremme organismers udvikling på mikroskopisk, cellulært eller planteagtigt niveau. Det medium, der anvendes til dyrkning af celler, indeholder ofte en tilstrækkelig forsyning af energi og stoffer, der regulerer cellecyklussen. De vigtigste komponenter i et dyrkningsmedium omfatter aminosyrer, vitaminer, uorganiske salte, glukose og serum. Serumet tilsættes til mediet, fordi det fungerer som en kilde til vækstfaktorer, hormoner og vedhæftningsfaktorer. Ud over at levere næringsstoffer bidrager mediet også til opretholdelsen af pH- og osmolalitetsniveauerne.

Typer af medier, der anvendes i cellekulturer

Både humane og dyreceller kan dyrkes i enten et kunstigt eller syntetisk medium eller i et helt naturligt medium, der er tilsat naturlige elementer. I det følgende giver vi dig et overblik over de forskellige medietyper, der findes i dag.

Naturlige medier

Naturlige medier indeholder udelukkende biologiske væsker, der findes i deres naturlige tilstand. Naturlige medier er meget nyttige og lette at anvende til dyrkning af en bred vifte af dyrecelletyper. Manglende viden om de præcise komponenter, der udgør naturlige medier, er den primære faktor, der bidrager til den lave repeterbarhed af resultater opnået ved brug af naturlige medier.

Kunstige medier

Fremstillingen af kunstige eller syntetiske medier indebærer tilsætning af næringsstoffer (både organiske og uorganiske), serumproteiner, kulhydrater, cofaktorer, vitaminer og salte samt O₂- og CO₂-gasfaser [1].

Der er udviklet forskellige typer kunstige medier med henblik på at opfylde en eller flere af følgende funktioner: 1) Umiddelbar overlevelse (en afbalanceret saltopløsning med en præcis pH-værdi og et præcist osmotisk tryk). 2) Langvarig overlevelse (en afbalanceret saltopløsning tilsat forskellige formuleringer af organiske kemikalier og/eller serum). 3) Ubegrænset udvikling. 4) Specialiserede funktioner.

Der findes fire forskellige klassificeringer af kunstige medier:

Serumholdige medier

Den mest almindelige form for tilsætning i medier, der anvendes til dyrkning af dyreceller, er føtal bovint serum. Det tilsættes dyrkningsmediet som et billigt tilsætningsstof for at opnå de bedst mulige vækstbetingelser. Ud over at fungere som transportør eller chelator for næringsstoffer, der er ustabile eller uopløselige i vand, hormoner og vækstfaktorer, proteasehæmmere og andre stoffer, binder og neutraliserer serummet også skadelige molekyler.

Serumfrit medium

Tilstedeværelsen af serum i medierne har en række ulemper og kan potentielt forårsage væsentlige fortolkningsfejl i immunologisk forskning [2, 3]. Der er udviklet en række forskellige serumfrie medier [4, 5]. Disse medier er generelt specifikt formuleret til at understøtte dyrkningen af en enkelt celletype, såsom Knockout Serum Replacement og Knockout DMEM fra Thermo Fisher Scientific samt mTESR-mediet fra Stem Cell Technologies [6] til stamceller [7].

Derudover indeholder disse medier definerede mængder af rensede vækstfaktorer, lipoproteiner og andre proteiner, som ellers typisk tilføres via serummet [8]. Disse medier betegnes ofte som »definerede dyrkningsmedier«, da de komponenter, der udgør disse medier, er velkendte.

Kemisk definerede medier

Disse medier indeholder ultrarene uorganiske og organiske komponenter, der ikke er forurenet på nogen måde. De kan også indeholde tilsætninger af rene proteiner, såsom vækstfaktorer.

 Genetisk modifikation af bakterier eller gær sammen med tilsætning af bestemte fedtsyrer, vitaminer, kolesterol og aminosyrer resulterer i produktionen af deres bestanddele [9].

Proteinfri medier

Proteinfri medier er medier, der slet ikke indeholder noget protein, men i stedet udelukkende består af ikke-proteinholdige elementer. Sammenlignet med medier med tilsat serum fremmer brugen af medier uden tilsat protein en større celleproliferation og proteinekspression og gør det lettere at oprense ethvert produkt, der genereres i en efterfølgende proces [10-12]. Protein indgår ikke i formuleringer som MEM og RPMI-1640. Der kan dog tilsættes et proteintilskud, hvis det er nødvendigt.

Dyrkningsmedier og deres grundlæggende komponenter

Kommercielle dyrkningsmedier kan købes som pulver eller væske og indeholder ofte en række næringsstoffer såsom aminosyrer, glukose, salte, vitaminer og andre kosttilskud. 

Behovet for disse komponenter varierer fra cellelinje til cellelinje, og disse variationer er årsagen til det store antal forskellige medieformuleringer. Hver komponent har en bestemt funktion, som vil blive beskrevet i de følgende afsnit:

Buffersystemer

For at opretholde optimale vækstbetingelser skal pH-værdien reguleres, hvilket ofte sker ved hjælp af et af to buffersystemer:

Naturligt buffersystem

Forholdet mellem CO₂ og H₂CO₃ i atmosfæren svarer til det i mediet, hvilket skaber en naturlig buffermekanisme. For at bevare denne naturlige buffermekanisme skal kulturerne opbevares i et luftmiljø med 5–10 % CO₂, hvilket ofte opnås ved hjælp af en CO₂-inkubator. En af de største fordele ved at anvende en naturlig buffer er, hvor billig og sikker den er.

HEPES

Kemisk buffering ved hjælp af zwitterionen HEPES har en større bufferevne i pH-området 7,2–7,4 og kræver ikke et reguleret gasmiljø. For visse celletyper kan en større dosis HEPES være skadelig. Medier, der indeholder HEPES, er ligeledes langt mere modtagelige for de fototoksiske virkninger af fluorescerende lys [13].

Fenolrød

pH-indikatoren fenolrød indgår ofte i kommercielt tilgængelige dyrkningsmedier, hvilket muliggør kontinuerlig overvågning af pH-værdien. Når cellerne formerer sig, forårsager de metabolitter, som disse celler producerer, en ændring i pH-værdien og dermed en farveændring i mediet. Fenolrød har en dobbelt virkning på mediets farve, idet det bliver gult ved surt pH og lilla ved alkalisk pH. pH 7,4, den optimale værdi for cellekultur, får mediet til at fremstå fluorescerende rødt.

Men fenolrød har nogle ulemper: For det første kan fenolrød efterligne virkningen af en række steroidhormoner, primært østrogen [14]. Derfor anbefales det at anvende et medium uden fenolrød, når man undersøger østrogenfølsomme celler som f.eks. brystvæv. Natrium-kalium-balancen forstyrres af tilstedeværelsen af fenolrød i flere serumfrie formuleringer. Tilsætning af serum eller bovint hypofysehormon til medierne kan modvirke denne effekt [15]. For det tredje forhindres detektion i flowcytometriske eksperimenter af tilstedeværelsen af fenolrød.

Uorganiske salte

Medier, der indeholder uorganiske salte, såsom natrium-, kalium- og calciumioner, bidrager til at opretholde den osmotiske ligevægt og regulere membranpotentialet.

Aminosyrer

Da aminosyrer er de grundlæggende bestanddele af proteiner, er de en essentiel komponent i ethvert cellevækstmedium, der nogensinde er udviklet. Da celler ikke selv er i stand til at producere visse aminosyrer, er det vigtigt, at dyrkningsmediet indeholder essentielle aminosyrer. De er nødvendige for cellernes proliferation, og den koncentration, de forekommer i, bestemmer den maksimale celletæthed, der kan opnås. Især L-glutamin, en essentiel aminosyre, er af afgørende betydning.

L-glutamin fungerer som en sekundær energikilde for stofskiftet og bidrager med nitrogen til produktionen af NAD, NADPH og nukleotider. Da L-glutamin er en ustabil aminosyre, der med tiden omdannes til en form, som cellerne ikke kan udnytte, skal den tilsættes til mediet.

Derudover kan ikke-essentielle aminosyrer tilsættes væsken for at genopfylde de aminosyrer, der er blevet forbrugt under vækstprocessen. Cellernes vækst fremmes, og deres levedygtighed øges, når vækstmediet tilsættes ikke-essentielle aminosyrer.

Kulhydrater

Kulhydrater i form af sukkerarter er den vigtigste energikilde. Mange af medierne indeholder også maltose og fruktose ud over de mere almindelige sukkerarter, glukose og galaktose.

Proteiner og peptider

Albumin, transferrin og fibronektin er de mest anvendte proteiner og peptider. De er især vigtige i medier, der ikke indeholder serum. Albumin, transferrin, aprotinin, fetuin og fibronektin er nogle af de proteiner, der kan findes i serum, som er en rig proteinkilde.

Albumin er det primære protein i blodet, og dets funktion er at binde og transportere forskellige stoffer, herunder vand, salte, frie fedtsyrer, hormoner og vitaminer, mellem forskellige organer og celler. Albumins evne til at binde sig til kemiske stoffer gør det til et effektivt middel til at fjerne skadelige forbindelser fra det medium, hvor cellerne dyrkes.

Aprotinin er et beskyttende middel i cellekultursystemer, da det er stabilt ved både neutral og sur pH samt modstandsdygtigt over for høje temperaturer og den nedbrydning, der kan forårsages af proteolytiske enzymer. Det er i stand til at hæmme en række serinproteaser, herunder blandt andet trypsin.

Fetuin er et glykoprotein, der kan påvises i større mængder i serum fra fostre og nyfødte dyr sammenlignet med serum fra voksne. Derudover fungerer det som en serinproteasehæmmer. Proteinet fibronektin er en essentiel komponent i celleadhæsionsprocessen. Transferrin er et protein, der transporterer jern og er ansvarligt for at levere jern til cellemembranerne.

Fedtsyrer og lipider

De spiller en afgørende rolle i serumfrit medium, når der ikke er serum til stede.

Vitaminer

Talrige vitaminer er nødvendige for cellernes udvikling og proliferation. Cellerne kan ikke selv producere vitaminer i tilstrækkelige mængder, og de er derfor uundværlige i vævskultur som kosttilskud.

I cellekulturer er serum den primære kilde til vitaminer; medierne tilsættes dog også forskellige vitaminer for at gøre dem egnede til en bestemt celletype. Typisk anvendes B-vitaminerne til at stimulere væksten.

Sporstoffer

Kemiske grundstoffer såsom kobber, zink, selen og tricarboxylsyre-mellemprodukter betegnes som sporstoffer. Sporstoffer tilsættes ofte til medier, der ikke indeholder serum, for at erstatte dem, der typisk findes i serum. Disse grundstoffer er vigtige kemiske komponenter, der er nødvendige for en sund celleudvikling. Mange biokemiske reaktioner afhænger af bestemte mikronæringsstoffer, f.eks. enzymaktivitet.

Medietilskud

Det komplette vækstmedium, der anbefales til bestemte cellelinjer, kræver ekstra komponenter, som ikke findes i basismediet og serummet. Disse kosttilskud understøtter cellevækst og en passende metabolisk funktion.

Selvom hormoner, vækstfaktorer og signalmolekyler er afgørende for en korrekt proliferation af bestemte cellelinjer, bør følgende forholdsregler altid overholdes: Da tilsætning af tilskud kan ændre osmolaliteten i det komplette vækstmedium, hvilket kan hæmme celleudviklingen, anbefales det altid at kontrollere osmolaliteten efter tilsætning af tilskud. For de fleste cellelinjer ligger den optimale osmolalitet mellem 260 og 320 mOSM/kg.

Antibiotika

Antibiotika anvendes ofte til at hæmme udviklingen af bakterielle og svampeforureninger [16], selvom de ikke er afgørende for cellevækst. Da antibiotika kan skjule kontaminering med mycoplasma og resistente bakterier, anbefales deres rutinemæssige brug ikke til cellekulturer [17, 18].

Desuden kan antibiotika forstyrre metabolismen i overfølsomme celler. De penicillin-streptomycin-kombinationer, der fremstilles af MilliporeSigma og Life Technologies, anvendes ofte. Plasmocin er blevet anvendt i dyrkningen af gliomcellelinjerne TS603, TS516 og BT260 [19], og det har vist sig at være effektivt til at fjerne mycoplasma-kontaminering (20).

Serum

Albuminer, vækstfaktorer og væksthæmmere findes alle i serum. Serum er en af de vigtigste komponenter i cellekulturmediet, da det leverer aminosyrer, proteiner, vitaminer (især fedtopløselige vitaminer som A, D, E og K), kulhydrater, lipider, hormoner, vækstfaktorer, mineraler og sporstoffer.

Serum fra føtal- og kalvekilder anvendes ofte til at fremme udviklingen af dyrkede celler. Føtalt serum er en rig kilde til vækstfaktorer og er velegnet til cellekloning og udvikling af følsomme celler. På grund af dets begrænsede vækstfremmende egenskaber anvendes kalveserum i kontaktinhibitionsforsøg. Normale vækstmedier indeholder ofte 2 % til 10 % serum. Tilsætning af serum til dyrkningsmediet tjener følgende formål [21]:

• Serumet leverer de essentielle næringsstoffer til cellerne (både i opløsning og bundet til proteiner).

• Serum indeholder flere vækstfaktorer og hormoner, der er involveret i vækstfremme og specialiseret celleaktivitet.

• Det indeholder mange bindende proteiner, såsom albumin og transferrin, som transporterer andre kemiske stoffer ind i cellen. For eksempel transporterer albumin fedtstoffer, vitaminer, hormoner osv. ind i cellerne.

• Det leverer også proteiner, såsom fibronektin, som øger cellernes vedhæftning til substratet. Derudover producerer det spredningselementer, der hjælper med celleudvidelse før celledeling.

• Det leverer proteasehæmmere, der forhindrer proteolyse i cellerne.

• Det indeholder også mineraler såsom Na+, K+, Zn2+ og Fe2+.

• Det øger mediets viskositet og beskytter dermed cellerne mod mekanisk beskadigelse under omrystning i suspensionskulturer.

• Det fungerer også som en buffer.

Referencer

[1] Morgan J, Morton H, Parker R. Ernæring af dyreceller i vævskultur; indledende undersøgelser af et syntetisk medium. Proc Soc Exp Biol Med. 1950;73:1-8

[2] Kerbel R, Blakeslee D. Hurtig adsorption af en komponent fra føtal kalveserum af pattedyrceller i kultur. En potentiel kilde til artefakter i undersøgelser af antiserum mod cellespecifikke antigener. Immunology. 1976;31:881-91

[3] Sula K, Draber P, Nouza K. Tilsætning af serum til det medium, der anvendes til fremstilling af cellesuspensioner, som en mulig kilde til artefakter i cellemedierede reaktioner undersøgt ved hjælp af popliteal lymfeknudetesten. J Immunogenet. 1980;7:483-9

[4] Mariani E, Mariani A, Monaco M, Lalli E, Vitale M, Facchini A. Kommercielle serumfrie medier: hybridomvækst og produktion af monoklonale antistoffer. J Immunol Methods. 1991;145:175-83

[5] Barnes D, Sato G. Metoder til dyrkning af celler i serumfrit medium. Anal Biochem. 1980;102:255-70

[6] Yu H, Lu S, Gasior K, Singh D, Vazquez Sanchez S, Tapia O, et al. HSP70-chaperoner transporterer RNA-frit TDP-43 ind i anisotrope, intranukleære, flydende, sfæriske skaller. Science. 2021;371:

[7] Meharena H, Marco A, Dileep V, Lockshin E, Akatsu G, Mullahoo J, et al. Downs-syndrom-induceret senescens forstyrrer den nukleare arkitektur hos neurale progenitorceller. Cell Stem Cell. 2022;29:116-130.e7

[8] Iscove N, Melchers F. Fuldstændig erstatning af serum med albumin, transferrin og sojalipid i kulturer af lipopolysaccharid-reaktive B-lymfocytter. J Exp Med. 1978;147:923-33

[9] Stoll T, Muhlethaler K, von Stockar U, Marison I. Systematisk forbedring af et kemisk defineret proteinfrit medium til hybridomdyrkning og produktion af monoklonale antistoffer. J Biotechnol. 1996;45:111-23

[10] Darfler F. Et proteinfrit medium til dyrkning af hybridomer og andre celler i immunsystemet. In Vitro Cell Dev Biol. 1990;26:769-78

[11] Barnes D, Sato G. Serumfri cellekultur: en samlende tilgang. Cell. 1980;22:649-55

[12] Hamilton W, Ham R. Klonal vækst af kinesiske hamstercellelinjer i proteinfri medier. In Vitro. 1977;13:537-47

[13] Zigler J, Lepe Zuniga J, Vistica B, Gery I. Analyse af de cytotoksiske virkninger af lysudsatt HEPES-holdigt dyrkningsmedium. In Vitro Cell Dev Biol. 1985;21:282-7

[14] Berthois Y, Katzenellenbogen J, Katzenellenbogen B. Fenolrødt i vævskulturmedier er et svagt østrogen: implikationer for undersøgelsen af østrogenfølsomme celler i kultur. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:2496-500

[15] Karmiol S. Udvikling af serumfrie medier. I: Master JRW, red. Animal Cell culture, 3. udg. Oxford: Oxford University Press; 2000.

[16] Perlman D. Anvendelse af antibiotika i cellekulturmedier. Methods Enzymol. 1979;58:110-6

[17] McGarrity G. Spredning og bekæmpelse af mycoplasma-infektion i cellekulturer. In Vitro. 1976;12:643-8

[18] Masters J, Stacey G. Udskiftning af medium og passagering af cellelinjer. Nat Protoc. 2007;2:2276-84

[19] Chakraborty A, Laukka T, Myllykoski M, Ringel A, Booker M, Tolstorukov M, et al. Histon-demethylase KDM6A registrerer direkte ilt for at regulere kromatin og cellernes skæbne. Science. 2019;363:1217-1222

[20] Molla Kazemiha V, Azari S, Amanzadeh A, Bonakdar S, Shojaei Moghadam M, Habibi Anbouhi M, et al. Effektiviteten af Plasmocin™ på forskellige pattedyrcellelinjer inficeret med mollicutes sammenlignet med almindeligt anvendte antibiotika i cellekultur: en lokal erfaring. Cytotechnology. 2011;63:609-20

[21] Kragh Hansen U. Molekylære aspekter af ligandbinding til serumalbumin. Pharmacol Rev. 1981;33:17-53