Въведение

Клетки NCI-H1781, известна също под синонимите H1781, H-1781 и NCIH1781 (Cellosaurus, номер в регистъра CVCL_1494), представлява клетъчна линия от човешки недребноклетъчен белодробен карцином (NSCLC), създадена в рамките на систематичната програма на NCI за клетъчни линии на белодробен карцином и каталогизирана за първи път в базата данни за клетъчни линии на Отдела по медицинска онкология на NCI и Военноморските сили. [1] Тази клетъчна линия се превърна в основен модел в изследванията на недребноклетъчния белодробен карцином (NSCLC), тъй като притежава активираща инсерционна мутация в екзон 20 на HER2 (G776insV_G/C, т.е. делеция на глицин-776→валин/цистеин, изписвана също като A775insV,G776C) – клас от „драйверни“ мутации, срещани при приблизително 2–3% от случаите на белодробен аденокарцином. Този уникален генетичен профил превърна NCI-H1781 в незаменим инструмент за оценка на киназни инхибитори, насочени към HER2, за изучаване на механизмите на резистентност и за характеризиране на онкогенните сигнални пътища надолу по веригата. Мащабни геномни инициативи, включително „Енциклопедията на раковите клетъчни линии“ (CCLE) и проектът „Карта на раковите зависимости“, са допълнили информацията за тази линия с мултиомични набори от данни, разширявайки нейната полезност за фармакогеномни проучвания на всички видове рак. [2]

Основни изводи

• NCI-H1781 притежава активираща мутация чрез вмъкване в екзон 20 на HER2 (G776insV_G/C, изписвана също като A775insV,G776C), която постоянно активира сигналните пътища на HER2 и EGFR.
• Клетъчната линия е основният in vitro модел за тестване на необратими и обратими инхибитори на HER2 киназата при немалкоклетъчен белодробен карцином (NSCLC).
• Наред с мутацията в гена HER2, която е определяща за заболяването, се наблюдават хомозиготни мутации в гена TP53 (p.Val157Phe) и хетерозиготни мутации с промяна на рамката на четене в гена PTEN.
• Цялостната мултиомична анотация (секвениране на целия екзом, RNA-секвениране, протеомика, SNP-масиви, скрининг на лекарства) е обществено достъпна чрез големи консорциумни проекти.
• Клетъчната линия притежава вродена резистентност към селективните към EGFR инхибитори на тирозин киназата, като гефитиниб и ерлотиниб, което я превръща в ценен модел за изследване на резистентността.

Какво представлява NCI-H1781?

Клетъчната линия NCI-H1781 е получена от плеврален излив на 66-годишна пациентка, при която е диагностициран минимално инвазивен белодробен аденокарцином. Клетъчната линия е създадена в рамките на вътрешната програма на NCI за клетъчни линии на белодробен рак – систематична инициатива, започнала през 1976 г. с цел създаване на изчерпателно документирани модели на рак при човека. [3] Характерната генетична особеност е хетерозиготна инсерция в рамката на екзон 20 на гена HER2, която въвежда допълнителни аминокиселини на позиция 776 в киназния домейн, създавайки конститутивно активен рецептор. Линията носи също така хомозиготна мисенс мутация в гена TP53 (p.Val157Phe), първоначално идентифицирана от Mitsudomi и колеги, [4] и хетерозиготна мутация с промяна на рамката на PTEN (p.Gln245fs*6), документирана в рамките на широкомащабни изследвания за секвениране на екзома. [2] [8] Анализът на микросателитната нестабилност класифицира линията като MSI-low, а оценката на генетичния произход я отнася предимно към генетичния фон на Северна и Южна Европа. [5] От решаващо значение е, че самият EGFR в тази клетъчна линия е от див тип, така че чувствителността към лекарствата се определя изцяло от мутиралия HER2-рецептор, което осигурява ясен модел за анализ на онкогенното сигнализиране, специфично за HER2.

Информация за клетъчните култури

Предимства на NCI-H1781

Основното предимство на NCI-H1781 е генетично дефинираната мутация с вмъкване в екзон 20 на HER2 на фона на EGFR от див тип. Тази комбинация позволява на изследователите да приписват реакциите към лекарството еднозначно на инхибирането на HER2, а не на кръстосаната активност на EGFR. Тъй като този клас мутации засяга приблизително 2–3% от всички пациенти с белодробен аденокарцином и в миналото за него не е имало одобрени терапии, NCI-H1781 запълва критична ниша, която линиите с EGFR-мутации не могат да покрият. По този начин линията заема уникална позиция като най-широко използваната клетъчна референтна точка за откриването на лекарства за HER2-управляван недребноклетъчен белодробен карцином (NSCLC).

Мултиомичната характеристика в рамките на големи консорциуми допълнително повишава научната стойност на тази линия. NCI-H1781 е профилирана чрез секвениране на целия екзом, SNP-масиви, RNA-секвениране, микромасиви, анализ на ДНК-метилирането, протеинови масиви с обратна фаза и панели за скрининг на лекарства. [2] [6] [7] [8] Тази подробност на анотациите позволява на изследователите да интегрират собствените си фармакологични открития със съществуващите мултиомични набори от данни, което значително ускорява формулирането на хипотези. Високата жизнеспособност след размразяване (97,5 %) и постоянната жизнеспособност при субкултивиране над 97 % гарантират, че експерименталните резултати са възпроизводими при всички пасажи.

NCI-H1781 се използва успешно и като вътрешен отрицателен контрол за средства, насочени към EGFR. Тъй като EGFR е от див тип и клетъчната линия е по своята същност нечувствителна към инхибиторите на EGFR тирозин киназа (TKI) от първо поколение, това позволява паралелно сравнение с линии с мутации в EGFR, което изяснява механистичната интерпретация. Включването ѝ в скрининги за делеция на гени, свързани с полярността, в целия геном [9] и проучвания за зависимостта от ефекторите на KRAS [10] показва колко разнообразни са изследователските контексти, в които този маркер предоставя полезни данни извън традиционната си роля, свързана с HER2.

Ограничения на NCI-H1781

NCI-H1781 носи съпътстващи мутации в гените TP53 и PTEN, които могат да затруднят интерпретацията на данните за реакцията към лекарството. Хомозиготната субституция p.Val157Phe в гена TP53 може да промени p53-зависимия апоптотичен сигнализационен път, като потенциално промени степента на клетъчната смърт, наблюдавана след лечението с лекарството. По подобен начин хаплоинсуфициенцията на PTEN може да активира PI3K–AKT сигнализацията независимо от HER2, създавайки фон от конститутивна сигнализация за оцеляване, която би могла да маскира или да преувеличи ефектите на инхибиторите. Следователно изследователите трябва да обмислят провеждането на паралелни експерименти в изогенни системи, когато приписват фенотипите конкретно на HER2.

Като клетъчна линия с един-единствен донор и дългогодишна история, NCI-H1781 не отразява пълната вътретуморна хетерогенност, присъща на туморите на пациентите. Клоналната еволюция по време на непрекъснатите пасажи може да доведе до допълнителни генетични промени, които не са налице в първоначалния тумор. Удостоверяването чрез профилиране на къси тандемни повторения и редовните тестове за микоплазма остават съществени мерки за контрол на качеството, а големите каталози на клетъчни линии подчертават важността на тези практики за поддържане на достоверността на данните. [11]

Клетъчната линия има и ограничен обхват на приложимост в контексти, извън рамките на белодробния аденокарцином с вмъквания в екзон 20 на HER2. Изследванията, изискващи EGFR-активиращи мутации, промени в KRAS-драйвера или други хистологични подтипове на недребноклетъчния белодробен карцином (NSCLC), изискват допълнителни клетъчни линии. Освен това, като двуизмерен монослоен модел, тя не възпроизвежда триизмерната туморна микросреда, васкуларизацията или имунните взаимодействия, присъщи in vivo, което подчертава необходимостта от последваща валидация чрез ксенографти или органоиди.

С STR-аутентификация, без микоплазма, готов за изпращане. Вижте пълните технически характеристики и поръчайте тук

Приложения

Оценка на инхибитори на киназа, насочени към HER2

NCI-H1781 е еталонната клетъчна линия за оценка на инхибитори на кинази, насочени към HER2, при недребноклетъчен белодробен карцином (NSCLC). В пионерското проучване на Shimamura, Джи и Минами показа, че необратимият двойствен инхибитор на EGFR/HER2 HKI-272 (нератиниб) мощно инхибира пролиферацията на клетките NCI-H1781, носещи мутацията G776insV_G/C, като предизвиква спиране на клетъчния цикъл в фаза G1 и апоптотична смърт. [12] От решаващо значение е, че това проучване показа също, че HKI-272 прекъсва автофосфорилирането както на HER2, така и на EGFR, като по този начин установява механистична основа за насочване към този клас мутации с необратими инхибитори. [12]

Въз основа на тези резултати последващите проучвания потвърдиха активността на допълнителни необратими пан-HER инхибитори. MP-412 (AV-412), двойствен инхибитор на EGFR/ErbB2, потиска фосфорилирането на ERBB2 и последващата сигнализация в модели с ксенографти NCI-H1781, демонстрирайки антитуморна активност in vivo, съответстваща на резултатите in vitro. [13] Пан-HER инхибиторът тарлокситиниб-E, хипоксия-активирано пролекарство, също беше оценен срещу NCI-H1781, както и срещу Ba/F3 клетки, изразяващи отделни HER2 мутации, а механизмите на резистентност към този агент бяха проучени чрез скрининг за мутагенеза с N-етил-N-нитрозоурея. [14]

Проучвания, оценяващи обратимия HER2 инхибитор севабертиниб, отчетоха силна антипролиферативна активност в клетки NCI-H1781, носещи A775insV,G776C в екзон 20 (_IC50 = 19,7 nmol/L), което поставя севабертиниб сред най-мощните обратими инхибитори, тествани в този модел. Профилът на активност на севабертиниб в NCI-H1781 беше характеризиран успоредно с потискането на надолу по веригата сигнални пътища, което подчертава полезността на тази клетъчна линия за директни сравнения между класовете обратими и необратими HER2 инхибитори. Антитуморният ефект на нератиниб срещу белодробни ракови клетки, носещи промени в онкогена HER2, беше охарактеризиран по подобен начин с използване на NCI-H1781 успоредно с контролни групи с див тип и амплифициран HER2, което допълнително подчертава централната роля на модела в тази област.

Механизми на резистентност към EGFR TKI

Ключово приложение на NCI-H1781 е моделирането на вътрешна резистентност към EGFR TKI от първо поколение. Wang и колегите му показаха, че вмъкването на YVMA в HER2 трансфосфорилира както EGFR с деактивирана киназна активност, така и EGFR от див тип, дори в присъствието на EGFR TKI, което обяснява защо гефитиниб и ерлотиниб не успяват да потиснат сигнализацията в тази клетъчна линия. [15] Потискането на мутантния HER2 в клетките H1781 възстанови чувствителността към EGFR TKI и увеличи апоптозата, което показва, че HER2 действа като основен фактор за резистентността към TKI в този контекст. [15]

Gadgeel и колегите му потвърдиха този фенотип на резистентност, като сравниха NCI-H1781 (EGFR от див тип) с линии на немалък клетъчен белодробен карцином (NSCLC) с мутирал EGFR в експерименти с двойна блокада на EGFR и COX-2. [16] Данните за NCI-H1781 показаха, че едновременното лечение с ерлотиниб и целекоксиб не води до допълнителна полза при клетки с див тип EGFR, което подчертава, че статусът на EGFR мутацията определя отговора към комбинирани стратегии, насочени към EGFR. [16] Тези резултати позиционираха NCI-H1781 като ценен отрицателен контрол за проучвания на комбинации, фокусирани върху EGFR.

Изследвания, използващи производни на (-)-епигалокатехин-3-галат в комбинация с цисплатин или паклитаксел, също използваха NCI-H1781 като сравнителен модел за NSCLC с див тип EGFR, като проучваха промените във фосфорилирането в сигналния път на EGFR. Тези проучвания установиха, че цитотоксичните комбинации могат да потискат сигнализацията на EGFR надолу по веригата дори при липса на активиращи EGFR мутации. Тази съвкупност от изследвания колективно демонстрира ценността на тази линия като експериментален контрол, който изолира HER2-специфичните от EGFR-специфичните фармакологични ефекти.

Изследвания върху конюгати на антитела с лекарства и комбинирана терапия

NCI-H1781 е използвана за изследване на активността на насочени към HER2 конюгати на антитела и лекарства (ADC) при NSCLC. Cretella и колегите му доказаха, че трастузумаб емтансин (T-DM1), ADC, състоящ се от трастузумаб, конюгиран с инхибитора на микротубулите DM1, проявява антипролиферативни и проапоптотични ефекти в линии на NSCLC със свръхекспресия на HER2 и преодолява резистентността към гефитиниб in vitro. [17] Тази работа беше сред първите, които систематично проучиха активността на T-DM1 при рак на белия дроб, а не при рак на гърдата, като NCI-H1781 предостави контекста на аденокарцином на белия дроб с мутация в HER2. [17]

Wang и колегите му демонстрираха, че класическите средства, насочени срещу HER2, включително лапатиниб, трастузумаб и необратимият пан-HER инхибитор CI-1033, всички инхибират растежа на клетките NCI-H1781, потвърждавайки множеството механистични подходи за потискане на HER2. [15] Тези сравнителни данни бяха от решаващо значение за определянето на спектъра от средства, активни срещу вмъквания в екзон 20 на HER2. Подходите на мрежовата фармакология също са използвали NCI-H1781 като in vitro модел на недребноклетъчен белодробен карцином (NSCLC) за оценка на жизнеспособността, апоптозата и клоногенността след комбинирано лечение с нови съединения от растителен произход, което илюстрира гъвкавостта на модела за скрининг на разнообразни терапевтични методи.

Геномно и протеомно профилиране на различни видове рак

NCI-H1781 е една от най-подробно описаните линии в рамките на мащабните ресурси от ракови клетъчни линии. Енциклопедията на раковите клетъчни линии (Cancer Cell Line Encyclopedia) събра данни за генната експресия, броя на хромозомните копия и масивно паралелно секвениране от стотици клетъчни линии, за да позволи прогнозно моделиране на чувствителността към лекарства, като NCI-H1781 допринася като документиран модел на NSCLC. [2] Разширението на CCLE от ново поколение добави слоеве за сплайсинг на РНК, метилиране на ДНК, модификация на хистон H3 и експресия на микроРНК, което допълнително задълбочи молекулярния профил на NCI-H1781. [8]

Протеомните изследвания допълниха геномните набори от данни за NCI-H1781. Характеристиката чрез протеинов масив с обратна фаза измери нивата на експресия на приблизително 230 ключови протеина, свързани с рака, в над 650 клетъчни линии, като показа, че профилите на фосфопротеините добавят предсказуема сила за чувствителността към лекарства, надхвърляща тази, която се получава само от данните за мРНК. [7] Пан-раковата протеомна карта на 949 човешки ракови клетъчни линии, генерирана чрез масова спектрометрия, допълнително количествено определи над 8 000 протеина, като NCI-H1781 беше включен сред представителите на недребноклетъчния белодробен карцином (NSCLC). [18]

Транскриптомичните ресурси добавиха допълнителна резолюция. Изчерпателно проучване чрез секвениране на РНК на 675 човешки ракови клетъчни линии каталогизира генната експресия, мутациите и генните фузии, като предостави транскрипционна референция за NCI-H1781, която подкрепя анализите, базирани на сигнални пътища. [6] Ресурсът TCLP допълни тези данни чрез определяне на HLA-типа, идентифициране на експресирани вируси и прогнозиране на неоепитопи в над 1 000 клетъчни линии, включително NCI-H1781, като отвори пътища за изследвания, свързани с имунотерапията. [19] Проучванията за протеомно профилиране също идентифицираха различно активирани пътища между линиите на SCLC и NSCLC, като NCI-H1781 служи като референция за NSCLC. [20]

Скрининг на нови съединения и фармакогеномика

NCI-H1781 е включена в широкомащабни фармакогеномни скрининги, които свързват генетичните промени с чувствителността към лекарства. Общ преглед на фармакогеномните взаимодействия в над 1 000 ракови клетъчни линии установи корелация между соматични мутации, промени в броя на копията, метилиране на ДНК и генна експресия с чувствителността към 265 лекарства, като NCI-H1781 допринесе с данни за моделите на чувствителност, обусловени от HER2. [21] В рамките на парадигма за откриване на лекарства, ориентирана към химията, беше проучена библиотека от 200 000 съединения в над 100 клетъчни модела на рак на белия дроб, като NCI-H1781 беше използван като част от представителен панел от характерни соматични лезии при рак на белия дроб. [22]

Профилирането на зависимостта от KRAS-ефектори чрез комбинаторни siRNA скрининги в 92 клетъчни линии включи NCI-H1781, за да се характеризира как различните онкогенотипи ангажират различни ефекторни възли, допринасяйки за по-широко разбиране на хетерогенността на сигнализацията при рака на белия дроб. [10] Анализите на експресията на гени, свързани с RB, в над 100 линии на недребноклетъчен белодробен карцином (NSCLC) потвърдиха непокътнатата експресия на RB в NCI-H1781, като предоставиха контекст за изследвания на регулацията на клетъчния цикъл. [23] Освен това скринингът за микроделеции в целия геном идентифицира нарушения в гените на полярния комплекс в 684 ракови клетъчни линии, като данните за NCI-H1781 допринесоха за характеризирането на потенциални нови механизми на туморни супресори. [9]

Оценката на генетичния произход в близо 1 400 ракови клетъчни линии класифицира NCI-H1781 в рамките на преобладаващо европейски генетичен фон – класификация, която е от значение за интерпретирането на популационно-специфични фармакогеномни резултати и за осигуряване на разнообразие в панелите за скрининг на лекарства. [5] Като цяло тези фармакогеномни приложения показват, че NCI-H1781 предоставя ценни HER2-специфични данни в рамките на програми за откриване на лекарства, включващи множество клетъчни линии, което позволява на изследователите да идентифицират генетични предиктори за чувствителност или резистентност в голям мащаб.

Заключение

NCI-H1781 (CVCL_1494) се явява водещият клетъчен модел за недребноклетъчен белодробен карцином (NSCLC), причинен от вмъкване в екзон 20 на HER2, като предлага генетично добре дефинирана платформа за оценка на целеви киназни инхибитори, характеризиране на механизмите на резистентност и допринасяне към мултиомични консорциуми за всички видове рак. От знаковата демонстрация на активността на HKI-272 през 2006 г. [12] до съвременните проучвания на обратими инхибитори на HER2 и конюгати на антитела и лекарства, тази клетъчна линия многократно е доказала своята транслационна значимост. Нейната обширна анотация в геномни, транскриптомни и протеомни измерения разширява полезността ѝ далеч отвъд фармакологията с една мишена, превръщайки я в универсален инструмент в съвременния набор от средства за биологията на рака. Изследователите, които търсят валидирана, подложена на строг контрол на качеството запасна линия NCI-H1781 с потвърдена жизнеспособност след размразяване над 97%, могат да поръчат клетъчната линия или да се информират за спецификациите директно на cytion.com.

Ключови публикации

1. Phelps RM, Johnson BE, Ihde DC (1996) База данни за клетъчни линии на Отдела по медицинска онкология на NCI-Navy. Journal of cellular biochemistry. Допълнение. PMID: 8806092
2. Barretina J, Caponigro G, Stransky N (2012) Енциклопедията на раковите клетъчни линии позволява прогнозно моделиране на чувствителността към противоракови лекарства. Nature. PMID: 22460905
3. Mulshine JL, Ujhazy P, Antman M (2020) От клинични проби до предклинични модели на рак при хора – пътят на базата данни за клетъчни линии на NCI – 25 години по-късно. Списание по клетъчна биохимия. PMID: 31803961
4. Mitsudomi T, Steinberg SM, Nau MM (1992) Мутации в гена p53 в клетъчни линии на недребноклетъчен белодробен рак и тяхната корелация с наличието на ras мутации и клинични характеристики. Oncogene. PMID: 1311061
5. Dutil J, Chen Z, Monteiro AN (2019) Интерактивен ресурс за изследване на генетичното разнообразие и предполагаемия произход в раковите клетъчни линии. Cancer research. PMID: 30894373
6. Klijn C, Durinck S, Stawiski EW (2015) Цялостен транскрипционен профил на човешки ракови клетъчни линии. Nature biotechnology. PMID: 25485619
7. Ли Дж., Джао У., Акбани Р. (2017) Характеризиране на човешки ракови клетъчни линии чрез протеинови масиви с обратна фаза. Cancer Cell. PMID: 28196595
8. Ганди М., Хуан Ф.У., Хане-Валбуена Х. (2019) Характеризиране от ново поколение на Енциклопедията на раковите клетъчни линии. Nature. PMID: 31068700
9. Rothenberg SM, Mohapatra G, Rivera MN (2010) Скрининг на цялостния геном за микроделеции разкрива нарушаване на гените на полярностния комплекс при различни видове рак при човека. Cancer research. PMID: 20215515
10. Юан Т.Л., Амзалаг А., Багни Р. (2018) Диференциално ангажиране на ефектори от онкогенния KRAS. Cell Reports. PMID: 29444439
11. Ю М., Селварадж С.К., Лианг-Чу М.М. (2015) Ресурс за автентификация, анотиране и контрол на качеството на клетъчни линии. Nature. PMID: 25877200
12. Shimamura T, Ji H, Minami Y (2006) Недребноклетъчният белодробен рак и трансформираните Ba/F3 клетки, носещи мутацията ERBB2 G776insV_G/C, са чувствителни към HKI-272 – инхибитор с двойна специфичност към рецептора на епидермалния растежен фактор и ERBB2. Cancer research. PMID: 16818618
13. Сузуки Т., Фуджии А., Оя Дж. (2009) Антитуморна активност на двойния инхибитор на рецептора на епидермалния растежен фактор и ErbB2 киназата MP-412 (AV-412) в модели на ксенографти при мишки. Cancer Science. PMID: 19459856
14. Кога Т., Суда К., Нишино М. (2021) Активност и механизъм на придобитата резистентност към тарлокситиниб при белодробен рак с HER2-мутация: in vitro проучване. Translational lung cancer research. PMID: 34584864
15. Wang SE, Narasanna A, Perez-Torres M (2006) Мутацията в киназния домейн на HER2 води до конститутивно фосфорилиране и активиране на HER2 и EGFR, както и до резистентност към инхибиторите на EGFR тирозин киназата. Cancer Cell. PMID: 16843263
16. Gadgeel SM, Ali S, Philip PA (2007) Отговорът към двойната блокада на рецептора на епидермалния растежен фактор (EGFR) и циклооксигеназа-2 при недребноклетъчен белодробен карцином може да зависи от мутационния статус на EGFR в тумора. Cancer. PMID: 17948911
17. Cretella D, Saccani F, Quaini F (2014) Трастузумаб емтансин проявява активност върху клетъчни линии на недребноклетъчен белодробен карцином (NSCLC) с свръхекспресия на HER-2 и преодолява резистентността към гефитиниб. Molecular Cancer. PMID: 24898067
18. Гонсалвес Е., Поулос Р.С., Кай З. (2022) Пан-ракова протеомна карта на 949 човешки клетъчни линии. Cancer Cell. PMID: 35839778
19. Шолталберс Дж., Богел С., Букур Т. (2015) TCLP: онлайн каталог на ракови клетъчни линии, интегриращ HLA-тип, предсказани неоепитопи, вируси и генна експресия. „Геномна медицина“. PMID: 26589293
20. Байърс Л.А., Уанг Дж., Нилсон М.Б. (2012) Протеомното профилиране идентифицира нарушени пътища при дребноклетъчен белодробен рак и нови терапевтични мишени, включително PARP1. Cancer discovery. PMID: 22961666
21. Iorio F, Knijnenburg TA, Vis DJ (2016) Общ преглед на фармакогеномните взаимодействия при рака. Cell. PMID: 27397505
22. McMillan EA, Ryu MJ, Diep CH (2018) Подход „първо химията“ за определяне на персонализирано лечение при рак на белия дроб. Cell. PMID: 29681454
23. Modi S, Kubo A, Oie H (2000) Протеинова експресия на геновото семейство, свързано с RB, и големия Т-антиген на SV40 при мезотелиом и рак на белия дроб. Oncogene. PMID: 11030152
24. Робишо Ж.П., Еламин Й.Й., Тан З. (2018) Механизми и клинична активност на селективен за екзон 20 на EGFR и HER2 киназен инхибитор при недребноклетъчен рак на белия дроб. Nature medicine. PMID: 29686424