Εισαγωγή

Κύτταρα HMC3, γνωστές επίσης ως Human Microglia Clone 3, CHME-3 ή CHME3, αποτελούν μία από τις πιο ευρέως χρησιμοποιούμενες ανθρώπινες κυτταρικές σειρές μικρογλοίας στην έρευνα των νευροεπιστημών. Η σειρά δημιουργήθηκε το 1995 από τους Janabi, Peudenier, Héron και συνεργάτες μέσω της αθανατοποίησης, εξαρτώμενης από το μεγάλο Τ-αντιγόνο του SV40, ανθρώπινων μακροφάγων που προέρχονταν από εμβρυϊκό εγκέφαλο. [1] Τα κύτταρα HMC3 διατηρούν τα βασικά χαρακτηριστικά των μικρογλοιακών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένης της συστατικής έκφρασης του μορίου-προσαρμογέα Iba-1, που δεσμεύει το ιονισμένο ασβέστιο, καθώς και της επαγόμενης από την ιντερφερόνη-γάμμα έκφρασης αντιγόνων MHC κατηγορίας II. [2] [3] Ως τα μόνιμα κύτταρα του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος του κεντρικού νευρικού συστήματος, τα μικρογλοιακά κύτταρα αποτελούν βασικούς μεσολαβητές των νευροφλεγμονωδών παθήσεων, της νόσου του Αλτσχάιμερ και άλλων νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα HMC3 χρησιμεύουν ως μια εύχρηστη ανθρώπινη πλατφόρμα in vitro για τη μελέτη της ενεργοποίησης της μικρογλοίας, των νευροπροστατευτικών παραγόντων, της ιογενούς νευρομόλυνσης και του μικροπεριβάλλοντος του όγκου στο γλοιοβλάστωμα.

Κύρια συμπεράσματα

• Τα κύτταρα HMC3 είναι αθανατοποιημένα μικρογλοιακά κύτταρα ανθρώπινου εμβρυϊκού εγκεφάλου, τα οποία προέρχονται από μεταφορά του μεγάλου Τ-αντιγόνου του ιού SV40.
• Η κυτταρική σειρά εκφράζει το Iba-1 συνεχώς και αυξάνει την έκφραση του MHC τάξης II μετά από διέγερση με ιντερφερόνη-γάμμα· οι αναφορές σχετικά με την έκφραση των CD14, CD11b και CD68 διαφέρουν μεταξύ των εργαστηρίων και θα πρέπει να επαληθεύονται για κάθε συγκεκριμένη παρτίδα.
• Τα κύτταρα HMC3 αποτελούν ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο in vitro μοντέλο για τη μελέτη νευροφλεγμονωδών παθήσεων, της νόσου του Αλτσχάιμερ και των νευροεκφυλιστικών παθήσεων.
• Η σειρά είναι ευαίσθητη σε μόλυνση από διάφορους νευροτροπικούς ιούς, όπως ο ιός Ζίκα, ο ιός της νόσου Μπόρνα 1, ο ιός τσικουνγκούνια και ο ρινοϊός.
• Τα κύτταρα HMC3 εκφράζουν συνεχώς το NOX4 και παράγουν αντιδραστικές μορφές οξυγόνου, γεγονός που τα καθιστά σημαντικά για την έρευνα σχετικά με το οξειδωτικό στρες.
• Η σειρά αυτή έχει εφαρμοστεί σε μελέτες του μικροπεριβάλλοντος του γλοιοβλαστώματος, στη φαρμακολογία φαρμάκων και στην έρευνα σχετικά με τα υποστρώματα βιοϋλικών.
• Η ιντερλευκίνη-1 βήτα — είτε μόνη της είτε σε συνδυασμό με την ιντερφερόνη-γάμμα — αποτελεί το πιο αποτελεσματικό φλεγμονώδες ερέθισμα σε αυτή τη σειρά· οι αντιδράσεις στο LPS είναι συγκριτικά μέτριες, ενώ ο TNF-άλφα και το μονοξείδιο του αζώτου απουσιάζουν σε μεγάλο βαθμό.

Τι είναι το HMC3;

Η HMC3 (αριθμός καταχώρισης Cellosaurus CVCL_II76) είναι μια μετασχηματισμένη ανθρώπινη κυτταρική σειρά μικρογλοιακών κυττάρων που προέρχεται από τον εμβρυϊκό εγκέφαλο ενός εμβρύου ηλικίας κύησης 8–10 εβδομάδων. Το φύλο του δότη δεν έχει προσδιοριστεί. Δεν διαπιστώθηκε καμία ασθένεια στον δότη. Η σειρά δημιουργήθηκε από τον Janabi και τους συνεργάτες του το 1995 μέσω της μεταμόλυνσης πρωτογενών καλλιεργειών εμβρυϊκών μακροφάγων του εγκεφάλου με ένα πλασμίδιο που κωδικοποιεί το μεγάλο αντιγόνο Τ του SV40, με αποτέλεσμα την παραγωγή τεσσάρων συνεχών κυτταρικών σειρών μικρογλοίας, εκ των οποίων ο κλώνος 3 έγινε ο πιο ευρέως χρησιμοποιούμενος. [1] Τα μετασχηματισμένα κύτταρα διατήρησαν μακροφαγικά χαρακτηριστικά, όπως την προσκόλληση και τη μη ειδική εστερασική δραστηριότητα, και ήταν ικανά να φαγοκυτταρώσουν σωματίδια ζυμοσάνης, αν και η φαγοκυτταρική δραστηριότητα παρέμεινε χαμηλή. Η ιντερλευκίνη-6 παράχθηκε αυθόρμητα από τα κύτταρα, ενώ η παραγωγή της αυξήθηκε περαιτέρω μετά από διέγερση με ιντερλευκίνη-1 άλφα. [1] Μια εκτενής συστηματική ανασκόπηση της βιβλιογραφίας του 2018, που πραγματοποιήθηκε από τον Dello Russo και τους συνεργάτες του, συγκέντρωσε τα διαθέσιμα δεδομένα χαρακτηρισμού για αυτόν τον κλώνο και διευκρίνισε ένα σημαντικό σημείο σύγχυσης: η ίδια κυτταρική σειρά κυκλοφορούσε με τις ονομασίες CHME3, C13-NJ και CHME-5. [3] Η ανασκόπηση κατέληξε στο συμπέρασμα ότι, ανεξάρτητα από τον όρο που χρησιμοποιείται, τα κύτταρα παρουσιάζουν παρόμοιο αντιγονικό και λειτουργικό προφίλ και θα πρέπει να θεωρούνται ως ένα ενιαίο πειραματικό μοντέλο — ενώ επισημαίνεται ότι διαπιστώθηκε ότι αρκετά υποδείγματα CHME-5 που κυκλοφορούσαν είχαν υποστεί διασταυρούμενη μόλυνση με κύτταρα γλοιώματος αρουραίου. Το απόθεμα HMC3 (ATCC CRL-3304) που έχει πιστοποιηθεί από το ATCC δεν παρουσιάζει αυτή την αμφιβολία.

Πληροφορίες για την καλλιέργεια κυττάρων HMC3

Τα κύτταρα HMC3 είναι ανθεκτικά όσον αφορά την επιλογή του βασικού μέσου καλλιέργειας: έχουν καλλιεργηθεί με επιτυχία σε EMEM, MEM και DMEM:Ham's F12, το καθένα από τα οποία συμπληρώθηκε με 10% ορό. [3] Ωστόσο, αυτή η επιλογή δεν είναι φαινοτυπικά ουδέτερη. Ο Dello Russo και οι συνεργάτες του ανέφεραν ότι η βασική παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου ήταν σημαντικά χαμηλότερη στα κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε MEM ή DMEM:F12 σε σύγκριση με το EMEM, γεγονός που υποδηλώνει έναν λιγότερο ενεργοποιημένο φαινότυπο ηρεμίας. [3] Οι ερευνητές που συγκρίνουν δεδομένα μεταξύ διαφορετικών εργαστηρίων θα πρέπει, συνεπώς, να καταγράφουν το μέσο που χρησιμοποιήθηκε μαζί με τον αριθμό των περασμάτων.

Πλεονεκτήματα των κυττάρων HMC3

Τα κύτταρα HMC3 προσφέρουν ένα μοναδικά προσιτό μοντέλο ανθρώπινων μικρογλοιακών κυττάρων, σε μια εποχή που τα πρωτογενή ανθρώπινα μικρογλοιακά κύτταρα είναι δύσκολο να ληφθούν σε επαρκείς ποσότητες για έρευνα μεγάλης κλίμακας. Η κυτταρική σειρά αναπτύσσεται προσκολλητικά και η συντήρησή της είναι απλή. Είναι ιδιαίτερα σημαντικό ότι τα κύτταρα εκφράζουν σταθερά την Iba-1, αυξάνουν την έκφραση του MHC τάξης II σε απόκριση στην ιντερφερόνη-γάμμα και — στο πιστοποιημένο από την ATCC απόθεμα — μεταγράφουν τα πιο πρόσφατα προσδιορισμένα γονίδια-χαρακτηριστικά της μικρογλοίας CX3CR1, CSF1R, P2RY12 και TMEM119, παρέχοντας ένα βιολογικά επικυρωμένο υποκατάστατο των πρωτογενών ανθρώπινων μικρογλοιακών κυττάρων. [2] [3] Αυτές οι ιδιότητες καθιστούν τα κύτταρα HMC3 μια ευρέως χρησιμοποιούμενη πλατφόρμα για μηχανιστικές μελέτες νευροφλεγμονωδών ασθενειών που απαιτούν αναπαραγώγιμο, κλιμακώσιμο και πλήρως ανθρώπινο κυτταρικό υλικό.

Ένα επιπλέον πλεονέκτημα των κυττάρων HMC3 είναι η ανταπόκρισή τους σε μια καθορισμένη ομάδα φλεγμονωδών ερεθισμάτων. Ο πιο αποτελεσματικός επαγωγέας της ιντερλευκίνης-6 είναι η ιντερλευκίνη-1 βήτα, η οποία αυξάνει τη βασική έκκριση έως και πενήντα φορές και δρα συνεργικά με την ιντερφερόνη-γάμμα· το LPS και τα πεπτίδια αμυλοειδούς βήτα προκαλούν πιο μέτριες, εξαρτώμενες από τη συγκέντρωση αυξήσεις. [3] Αυτό το βαθμονομημένο, αναπαραγώγιμο προφίλ απόκρισης επιτρέπει τη διεξαγωγή πειραμάτων που εξαρτώνται από τη συγκέντρωση και την χρονική εξέλιξη, τα οποία είναι δύσκολο να πραγματοποιηθούν σε παρασκευάσματα πρωτογενών κυττάρων. Η ανταπόκρισή τους τόσο σε προφλεγμονώδη όσο και σε αντιφλεγμονώδη ερεθίσματα — συμπεριλαμβανομένων φαρμακολογικών παραγόντων όπως η ραπαμυκίνη και η δεξμεδετομιδίνη — διευρύνει περαιτέρω τη χρησιμότητά τους στη φαρμακολογία των φαρμάκων και στον έλεγχο νευροπροστατευτικών παραγόντων. [4] [5] Τα κύτταρα είναι επίσης ευαίσθητα σε διάφορους νευροτροπικούς ιούς, γεγονός που διευρύνει τη χρήση τους στην έρευνα στον τομέα της νευρομολυκολογίας.

Περιορισμοί των κυττάρων HMC3

Ως μετασχηματισμένη κυτταρική σειρά, τα κύτταρα HMC3 φέρουν το μεγάλο αντιγόνο Τ του SV40, το οποίο τους προσδίδει αθανασία, αλλά επίσης μεταβάλλει ορισμένες πτυχές της κυτταρικής βιολογίας σε σχέση με τα πρωτογενή μικρογλοιακά κύτταρα. Οι Li και συνεργάτες ανέφεραν απροσδόκητα μοτίβα έκφρασης των ισομορφών NOX — άφθονο mRNA του NOX4 αλλά σχεδόν καθόλου mRNA του NOX2 — τα οποία έρχονται σε αντίθεση με τα πρωτογενή μικρογλοιακά κύτταρα και περιορίζουν τη χρησιμότητα αυτής της σειράς ως μοντέλου για την αναπνευστική έκρηξη που μεσολαβείται από το NOX2. [2] [3] Ως εκ τούτου, οι ερευνητές θα πρέπει να επαληθεύσουν ότι η συγκεκριμένη οδός που μελετάται αναπαράγεται πιστά σε αυτή τη σειρά πριν εξαγάγουν γενικά συμπεράσματα σχετικά με τους μηχανισμούς.

Τρεις ακόμη περιορισμοί αξίζουν προσοχής. Πρώτον, το φάσμα των φλεγμονωδών μεσολαβητών είναι ελλιπές: Τα κύτταρα HMC3 εκκρίνουν μόνο ελάχιστες ποσότητες της αντιφλεγμονώδους κυτοκίνης IL-10 (της τάξης των λίγων pg/ml), παράγουν ελάχιστο ή καθόλου TNF-άλφα, είτε αυθόρμητα είτε μετά από προφλεγμονώδη ενεργοποίηση, και παρουσιάζουν διαρκώς αυξημένα επίπεδα IL-6 που οφείλονται σε αντιδραστικά είδη οξυγόνου που εξαρτώνται από το NOX4. [2] [3] Δεύτερον, και σε έντονη αντίθεση με τα μικρογλοιακά κύτταρα των τρωκτικών, τα κύτταρα HMC3 σε κατάσταση ηρεμίας δεν εκφράζουν iNOS, ενώ δεν έχει παρατηρηθεί ούτε επαγωγή της iNOS ούτε μετρήσιμη συσσώρευση νιτρωδών μετά από διέγερση με LPS, LPS σε συνδυασμό με ιντερφερόνη-γάμμα, IL-1 βήτα ή TNF-άλφα. [3] Συνεπώς, οι μελέτες που επικεντρώνονται στον άξονα του μονοξειδίου του αζώτου δεν εξυπηρετούνται επαρκώς από αυτό το μοντέλο.

Τρίτον, η κυτταρική σειρά δημιουργήθηκε από εμβρυϊκό εγκεφαλικό ιστό, πράγμα που σημαίνει ότι το μεταγραφικό και λειτουργικό της προφίλ ενδέχεται να διαφέρει από τις καταστάσεις των μικρογλοιακών κυττάρων που εμφανίζονται σε ενήλικες και σχετίζονται με νευροεκφυλιστικές ασθένειες της τρίτης ηλικίας. Οι ερευνητές που μοντελοποιούν τη νόσο του Αλτσχάιμερ ή τη νόσο του Πάρκινσον σε ενήλικες θα πρέπει, όπου είναι εφικτό, να ερμηνεύουν τα δεδομένα που προέρχονται από το HMC3 σε συνδυασμό με συμπληρωματικά συστήματα μικρογλοίας ενηλίκων, είτε πρωτογενή είτε προερχόμενα από iPSC. Τέλος, οι αναφορές σχετικά με το προφίλ των επιφανειακών δεικτών δεν είναι πλήρως σύμφωνες: ενώ οι Li και συνεργάτες περιέγραψαν συστατικά Iba-1 και CD14 μαζί με CD11b, CD68 και MHC κλάσης II που επάγονται από ιντερφερόνη-γάμμα, [2] τόσο ο αρχικός χαρακτηρισμός από τον Janabi και τους συνεργάτες του [1] και τα δεδομένα κυτταρομετρίας ροής που δημοσίευσαν οι Dello Russo και συνεργάτες για το ATCC CRL-3304 έδειξαν ότι τα κύτταρα σε κατάσταση ηρεμίας ήταν αρνητικά για CD14 και CD11b, χωρίς να επάγεται κανένας από τους δύο δείκτες από την ιντερφερόνη-γάμμα. [3] Ο κλώνος αντισωμάτων, το μέσο καλλιέργειας και ο αριθμός πασάζ επηρεάζουν όλα αυτά τα αποτελέσματα, ενώ η γενετική μετατόπιση κατά τη σειριακή μεταφορά έχει τεκμηριωθεί γενικά για τις συνεχείς σειρές· η έκφραση των δεικτών πρέπει να επιβεβαιώνεται εσωτερικά και όχι να θεωρείται δεδομένη.

Δείτε τις πλήρεις προδιαγραφές και κάντε την παραγγελία σας

Εφαρμογές των κυττάρων HMC3

Νευροφλεγμονή και ενεργοποίηση των μικρογλοιακών κυττάρων

Η μελέτη των νευροφλεγμονωδών παθήσεων αποτελεί την πιο εκτενώς αναπτυγμένη εφαρμογή των κυττάρων HMC3. Οι Li και συνεργάτες απέδειξαν ότι τα κύτταρα HMC3 εκφράζουν συστατικά το NOX4, το οποίο οδηγεί σε συνεχή παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου και διαρκή έκφραση της IL-6 — ένα εύρημα που κατέστησε αυτά τα κύτταρα μοντέλο για τη χρόνια, χαμηλού βαθμού νευροφλεγμονή. [2] Αυτός ο διαρκής φλεγμονώδης τόνος αντικατοπτρίζει πτυχές της προετοιμασίας των μικρογλοιακών κυττάρων που παρατηρούνται σε νευροεκφυλιστικές καταστάσεις, παρέχοντας μια σχετική βάση αναφοράς για μελέτες παρέμβασης.

Μια σημαντική μελέτη των Baek και συνεργατών εξέτασε την αναστολή της βρωμοδόμης BET στα κύτταρα HMC3 χρησιμοποιώντας αλληλούχιση RNA. [6] Οι συγγραφείς έδειξαν ότι ο αναστολέας BET JQ1 μείωσε τη φλεγμονώδη και μεταναστευτική απόκριση των κυττάρων HMC3 που ενεργοποιήθηκαν από LPS και προσδιόρισαν τον μηχανισμό: Το LPS επάγει τον παράγοντα μεταγραφής IRF1, ο οποίος ρυθμίζει άμεσα τα γονίδια χημειοκινών, κυτοκινών, γονίδια που διεγείρονται από ιντερφερόνη και γονίδια που σχετίζονται με τη μετανάστευση, ενώ το JQ1 μειώνει σημαντικά το IRF1 μαζί με τα γονίδια-στόχους του. Η καταστολή του IRF1 αναπαρήγαγε το αποτέλεσμα και ανέστειλε τη μετανάστευση των μικρογλοιακών κυττάρων. [6] Η εργασία αυτή καθιέρωσε τον άξονα BET–IRF1 ως φαρμακολογικό στόχο στην ανθρώπινη νευροφλεγμονή της μικρογλοίας και απέδειξε την καταλληλότητα των κυττάρων HMC3 για μελέτες φαρμακολογικής παρέμβασης σε μηχανιστικό επίπεδο.

Σε αυτή τη σειρά ερευνών εξετάστηκαν επίσης μοριακά μοτίβα που σχετίζονται με τη βλάβη των μιτοχονδρίων. Οι Nasi και συνεργάτες διαπίστωσαν ότι η διέγερση με μιτοχονδριακό DNA και καρδιολιπίνη αύξησε το κυτταρικό οξειδωτικό στρες στα κύτταρα HMC3, ενώ δεν κατάφερε να προκαλέσει μια κλασική προφλεγμονώδη απόκριση: η έκφραση του HLA-DR δεν αυξήθηκε και δεν αυξήθηκε ούτε η έκκριση του TNF-άλφα ούτε της IL-6. [7] Οι συγγραφείς ερμήνευσαν αυτό το φαινόμενο ως έναν πιθανό ενδογενή ρυθμιστικό μηχανισμό που περιορίζει την ενεργοποίηση των μικρογλοιακών κυττάρων. Ξεχωριστά, ο Cappoli και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι ο αναστολέας mTOR ραπαμυκίνη ενίσχυσε παραδόξως την έκφραση και την απελευθέρωση της IL-6 σε κύτταρα HMC3 που ενεργοποιήθηκαν με ένα μείγμα ιντερφερόνης-γάμμα/IL-1 βήτα, ενώ ταυτόχρονα μείωσε την παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου — αμφισβητώντας τις υποθέσεις σχετικά με τις αντιφλεγμονώδεις δράσεις της ραπαμυκίνης στα ανοσοκύτταρα που κατοικούν στον ανθρώπινο εγκέφαλο. [4] Αυτές οι μελέτες καταδεικνύουν συνολικά ότι τα κύτταρα HMC3 αποτελούν ένα ευαίσθητο, σχετικό με τον άνθρωπο σύστημα για την ανάλυση των μοριακών οδών που υποκρύπτονται στις νευροφλεγμονώδεις ασθένειες.

Μοντελοποίηση της νόσου του Αλτσχάιμερ και των νευροεκφυλιστικών παθήσεων

Τα κύτταρα HMC3 έχουν καταστεί ένα σημαντικό εργαλείο για τη μοντελοποίηση της συμβολής των μικρογλοιακών κυττάρων στη νόσο του Αλτσχάιμερ. Μια πρώιμη μελέτη χαρακτηρισμού από τους Lindberg και συνεργάτες, που πραγματοποιήθηκε σε αυτόν τον κλώνο με την ονομασία CHME3, απέδειξε ότι το πρόσφατα διαλυμένο αμυλοειδές βήτα (1–40) προκαλούσε δοσοεξαρτώμενη αύξηση στην απελευθέρωση της IL-6 παράλληλα με δοσοεξαρτώμενη απώλεια βιωσιμότητας. [8] Η ορμόνη διέγερσης των άλφα-μελανοκυττάρων δεν τροποποίησε την επαγόμενη από το αμυλοειδές βήτα απόκριση της IL-6, αλλά αύξησε τη βασική απελευθέρωση της IL-6 ανάλογα με τη δόση, ένα φαινόμενο που αποδίδεται στους υποτύπους των υποδοχέων μελανοκορτίνης MCR3 ή MCR5. [8] Η εργασία αυτή επικύρωσε τα κύτταρα HMC3 ως μια εύχρηστη πλατφόρμα για τη μελέτη της σχέσης μεταξύ των πεπτιδίων αμυλοειδούς βήτα και των φλεγμονωδών αποκρίσεων των μικρογλοιακών κυττάρων, οι οποίες είναι κεντρικής σημασίας για την παθογένεση της νόσου του Αλτσχάιμερ.

Οι González-Prieto και συνεργάτες διερεύνησαν τον CX3CR1 — τον μοναδικό υποδοχέα της νευρωνικής χημειοκίνης CX3CL1 — στη νόσο του Αλτσχάιμερ. [9] Η παραγωγή του CX3CR1 ήταν αυξημένη στον φλοιό ποντικών 5xFAD και σε δείγματα εγκεφάλου ανθρώπων με νόσο του Αλτσχάιμερ, ενώ η χορήγηση του αναστολέα επαναπρόσληψης νοραδρεναλίνης ρεβοξετίνη την αύξησε περαιτέρω in vivo. Αντίθετα, η άμεση εφαρμογή νοραδρεναλίνης σε κύτταρα HMC3 και σε πρωτογενή μικρογλοία αρουραίου ανέστειλε την παραγωγή του CX3CR1. [9] Οι συγγραφείς κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι οι αντιδράσεις των μικρογλοιακών κυττάρων στη νοραδρεναλίνη ενδέχεται να μεταβάλλονται απουσία νευρώνων που παράγουν CX3CL1 ή άλλων μη μικρογλοιακών παραγόντων — ένα διδακτικό παράδειγμα του τρόπου με τον οποίο τα κύτταρα HMC3 μπορούν να απομονώσουν μια κυτταρικά αυτόνομη απόκριση και, ως εκ τούτου, να αποκαλύψουν τη συμβολή του ευρύτερου ιστικού πλαισίου.

Η μελέτη για τη δεξμεδετομιδίνη από τους Li και συνεργάτες χρησιμοποίησε κύτταρα HMC3 διεγερμένα με LPS και ATP ως μοντέλο νευροφλεγμονής που προκαλείται από το φλεγμονώδες σύμπλεγμα NLRP3 και σχετίζεται με τη νόσο του Αλτσχάιμερ. [5] Η δεξμεδετομιδίνη ανέστειλε την απελευθέρωση των IL-1β και IL-18 μέσω μιας αλυσιδωτής αντίδρασης c-Fos/NLRP3/κασπάση-1, προσδιορίζοντας έναν μηχανιστικά καινοτόμο αντιφλεγμονώδη άξονα στα ανθρώπινα μικρογλοιακά κύτταρα. Τα κύτταρα HMC3 έχουν επίσης χρησιμεύσει ως μοντέλο για τη διερεύνηση της πόλωσης των μικρογλοιακών κυττάρων σε απόκριση σε φυτικά εκχυλίσματα που περιέχουν φυτοοιστρογόνα, διευρύνοντας περαιτέρω τη χρησιμότητά τους στην ανακάλυψη φαρμάκων για τις νευροεκφυλιστικές ασθένειες. [10] [11]

Ιολογία και λοιμώξεις του ΚΝΣ

Τα κύτταρα HMC3 έχουν αποδειχθεί εξαιρετικά ευέλικτα για τη μελέτη της ιικής νευρομόλυνσης, δεδομένης της ανθρώπινης προέλευσής τους και της θέσης τους ως μοντέλου για την πρώτη γραμμή άμυνας της μικρογλοίας στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Οι Martinez Viedma και Pickett συνέκριναν την απόκριση του ξενιστή των μικρογλοιακών κυττάρων HMC3 και των πλακουντιακών κυττάρων JEG-3 στη λοίμωξη από τον ιό Ζίκα, χρησιμοποιώντας ένα σύνολο 84 γονιδίων του έμφυτου και του επίκτητου ανοσοποιητικού συστήματος, των οποίων το προφίλ καταγράφηκε 24 και 72 ώρες μετά τη λοίμωξη. [12] Οι δύο τύποι κυττάρων παρουσίασαν διακριτά σύνολα γονιδίων με διαφοροποιημένη έκφραση, ενώ η ανάλυση των μεταβολικών οδών έδειξε ότι η σηματοδότηση TLR7/8 καταστέλλεται στα μικρογλοιακά κύτταρα, ενώ ενεργοποιείται στα πλακουντιακά κύτταρα — μια απόκλιση που στη συνέχεια διερευνήθηκε μέσω πειραμάτων με siRNA. Η μελέτη καθιέρωσε τα κύτταρα HMC3 ως κατάλληλη πλατφόρμα για τη μεταγραφωμική ανάλυση ξενιστή-παθογόνου στην ιολογία του ΚΝΣ.

Ο Zhang και οι συνεργάτες του χρησιμοποίησαν κύτταρα HMC3 μολυσμένα με BoDV-1 για να αποδείξουν ότι το miR-146a διευκολύνει την ιική αναπαραγωγή καταστέλλοντας τον άξονα σηματοδότησης του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος IRAK1/TRAF6/NF-κB. [13] Το εύρημα αυτό παρείχε μηχανιστική κατανόηση του τρόπου με τον οποίο ένας εξαιρετικά νευροτροπικός ιός RNA αποφεύγει τις αντιιικές αποκρίσεις της μικρογλοίας. Σε ένα ξεχωριστό μοντέλο μόλυνσης, οι Angel-Ambrocio και συνεργάτες απέδειξαν για πρώτη φορά ότι ο ανθρώπινος ρινοϊός ολοκληρώνει ολόκληρο τον ιικό του κύκλο στα κύτταρα HMC3, καθιστώντας τη μικρογλοία ως πιθανή κυτταρική δεξαμενή για επιπλοκές του ΚΝΣ που σχετίζονται με τον ρινοϊό. [14] Η γραμμή αυτή υποστηρίζει επίσης την αναπαραγωγή του ιού τσικουνγκούνια χωρίς σημαντική απώλεια βιωσιμότητας έως και 72 ώρες μετά τη μόλυνση. [19]

Ο Sharma και οι συνεργάτες του αναγνώρισαν την προιμπιτίνη 1/2 ως υποθετικό υποδοχέα εισόδου για τον ιό του δάγκειου πυρετού ορότυπου 3 στα μικρογλοιακά κύτταρα CHME-3 — συνώνυμο των HMC3 — χρησιμοποιώντας δοκιμασίες πρόσδεσης πρωτεϊνών με επικάλυψη ιού, πρωτεομική ανάλυση LC-MS/MS, καταστολή με siRNA και συν-ανοσοκατακρήμνιση. [15] Αξίζει να σημειωθεί ότι η ίδια εξάρτηση παρατηρήθηκε στα νευρωνικά κύτταρα SH-SY5Y, αλλά όχι στα αστρογλοιακά κύτταρα U-87 MG, υποδηλώνοντας ότι η οδός εισόδου εξαρτάται από τον τύπο του κυττάρου. Συνολικά, αυτές οι ιολογικές μελέτες υπογραμμίζουν ότι τα κύτταρα HMC3 αποτελούν ένα ευρέως εφαρμόσιμο μοντέλο ανθρώπινων μικρογλοιακών κυττάρων για τη διερεύνηση της παθογένεσης και των στρατηγικών αποφυγής του ανοσοποιητικού συστήματος των νευροτροπικών ιών.

Μικροπεριβάλλον όγκου γλοιοβλαστώματος

Τα κύτταρα HMC3 έχουν χρησιμοποιηθεί ως μοντέλο μικρογλοίας που σχετίζεται με το γλοίωμα, για τη μελέτη του τρόπου με τον οποίο τα καρκινικά κύτταρα του γλοιοβλαστώματος αξιοποιούν τον φλεγμονώδη φαινότυπο της μικρογλοίας. Οι Li και συνεργάτες απέδειξαν ότι η συν-καλλιέργεια κυττάρων γλοιοβλαστώματος ανθεκτικών στη τεμοζολομίδη με κύτταρα HMC3 προώθησε την πόλωση των κυττάρων HMC3 προς τον τύπο M2 και αύξησε την έκκριση των προ-ογκογόνων κυτοκινών TGF-β και IL-6. [16] Αυτή η πόλωση συνδέθηκε με τον κύκλωμα lncRNA SNHG15/miR-627-5p/CDK6, ενώ ο αναστολέας CDK4/6 παλμποσικλίμπ μείωσε τους δείκτες M2, ξεπερνώντας παράλληλα την αντοχή στη τεμοζολομίδη σε μοντέλα ξενομοσχεύματος που προέρχονταν από ασθενείς.

Αυτά τα ευρήματα καθιστούν τα κύτταρα HMC3 ένα σημαντικό ανθρώπινο μοντέλο για τη μελέτη της συμβολής των μικρογλοιακών κυττάρων στο ανοσοκατασταλτικό μικροπεριβάλλον του γλοιοβλαστώματος. Η δυνατότητα μοντελοποίησης της αλληλεπίδρασης μικρογλοίας–γλοιοβλαστώματος in vitro με τη χρήση κυττάρων HMC3 παρέχει ένα εύχρηστο σύστημα για τον εντοπισμό θεραπευτικών στόχων που αντιμετωπίζουν ταυτόχρονα την αντοχή των καρκινικών κυττάρων και την ανοσοαποφυγή. [16]

Νευροπροστατευτικοί παράγοντες και φαρμακολογία φαρμάκων

Τα κύτταρα HMC3 έχουν χρησιμοποιηθεί εκτενώς για τον έλεγχο νευροπροστατευτικών παραγόντων και τον χαρακτηρισμό των μηχανισμών δράσης τους στην ανθρώπινη μικρογλοία. Οι Martínez Leo και Segura Campos αξιολόγησαν πεπτιδικά κλάσματα από σπόρους Salvia hispanica ως προς τη νευροπροστατευτική τους δράση σε κύτταρα HMC3, διαπιστώνοντας ότι το κλάσμα 1–3 kDa μείωσε την παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου κατά 51,3% και μείωσε την απελευθέρωση οξειδίου του αζώτου, TNF-άλφα και της IL-6, με συνολική προστατευτική δράση 79,0%. [17] Αυτού του είδους οι μελέτες καταδεικνύουν πώς τα κύτταρα HMC3 επιτρέπουν την ταχεία, σχετική με τον άνθρωπο, διαλογή βιοδραστικών ενώσεων που προέρχονται από τρόφιμα.

Οι Ma'arif και συνεργάτες διεξήγαγαν δύο σχετικές μελέτες χρησιμοποιώντας κύτταρα HMC3 για την αξιολόγηση φυτοοιστρογόνων φυτικής προέλευσης από φύλλα Marsilea crenata. Το κλάσμα n-βουτανόλης μείωσε την έκφραση των MHC τάξης II σε κύτταρα ενεργοποιημένα με ιντερφερόνη-γάμμα, κάτι που συνάδει με την αναστολή της κλασικής ενεργοποίησης M1, αν και η αναφερόμενη σχέση δόσης-απόκρισης δεν ήταν μονοτονική. [10] Ένα εκχύλισμα αιθανόλης 96% αύξησε την έκφραση του δείκτη M2, της αργινάσης-1· η ίδια μελέτη ανέφερε μείωση της έκφρασης του ενεργοποιημένου υποδοχέα οιστρογόνου βήτα στα 125 και 250 ppm, ένα αποτέλεσμα που έρχεται σε αντίθεση με τον ίδιο τον τίτλο της εργασίας και θα πρέπει να θεωρηθεί ως ανεπίλυτο. [11] Και οι δύο μελέτες αξιοποίησαν το καλά χαρακτηρισμένο πρωτόκολλο πόλωσης με ιντερφερόνη-γάμμα σε κύτταρα HMC3 για να διερευνήσουν την πιθανή φυτοοιστρογονική νευροπροστασία στη μεταεμμηνοπαυσιακή νευροφλεγμονή.

Στον τομέα των βιοϋλικών και της μηχανικής ιστών, ο Venkateswarlu και οι συνεργάτες του χρησιμοποίησαν ζωντανά κύτταρα HMC3 που καλλιεργήθηκαν σε μήτρες υποστρωμάτων ηλεκτρονηματοποίησης για να αναπτύξουν μια ροή εργασίας ογκομετρικής απεικόνισης σε πραγματικό χρόνο για τις ταλαντώσεις του κυτοσολικού ασβεστίου χρησιμοποιώντας μικροσκοπία συγκεντρωτικού σάρωσης με λέιζερ. [18] Η εργασία αυτή επέκτεινε την εφαρμογή των κυττάρων HMC3 πέρα από την κλασική φαρμακολογία, στις δοκιμές βιοϋλικών επόμενης γενιάς, καταδεικνύοντας την ευελιξία της κυτταρικής σειράς σε διάφορα τεχνολογικά πλαίσια της έρευνας στις νευροεπιστήμες.

Συμπέρασμα

Τα κύτταρα HMC3 — ο ανθρώπινος κλώνος μικρογλοίας 3 — έχουν καθιερωθεί ως θεμελιώδες in vitro μοντέλο για νευροφλεγμονώδεις παθήσεις, τη νόσο του Αλτσχάιμερ, νευροεκφυλιστικές παθήσεις, την ιολογία του ΚΝΣ, την έρευνα στο μικροπεριβάλλον του γλοιοβλαστώματος και την ανακάλυψη νευροπροστατευτικών παραγόντων. Προερχόμενη από ανθρώπινο εμβρυϊκό εγκεφαλικό ιστό και αθανατισμένη μέσω μεταφοράς του SV40, η σειρά εκφράζει βασικούς δείκτες μικρογλοίας και ανταποκρίνεται σε ένα καθορισμένο φάσμα φλεγμονωδών, φαρμακολογικών και μολυσματικών ερεθισμάτων. Μελέτες όπως η εργασία του Baek και των συνεργατών του σχετικά με τους αναστολείς BET έχουν αποδείξει τη δυνατότητα της σειράς αυτής να εντοπίζει φαρμακολογικά στόχους στην ανθρώπινη μικρογλοιακή νευροφλεγμονή. Από θεμελιώδεις μηχανιστικές μελέτες των αντιδραστικών ειδών οξυγόνου και της σηματοδότησης του φλεγμονώματος NLRP3 έως εφαρμοσμένες διαλογές νευροπροστατευτικών παραγόντων φυτικής προέλευσης και δοκιμές βιοϋλικών με βάση ικριώματα, τα κύτταρα HMC3 προσφέρουν εξαιρετική ευελιξία — υπό την προϋπόθεση ότι λαμβάνονται υπόψη οι τεκμηριωμένοι περιορισμοί τους σχετικά με τη βιολογία του TNF-άλφα, του μονοξειδίου του αζώτου και του NOX2 κατά το σχεδιασμό των πειραμάτων. Οι ερευνητές που αναζητούν ένα επικυρωμένο, επεκτάσιμο και πλήρως ανθρώπινο μοντέλο μικρογλοίας θα βρουν στα κύτταρα HMC3 έναν πολύτιμο πόρο για την προώθηση της κατανόησης της ανοσίας και των παθήσεων του εγκεφάλου. Για να παραγγείλετε κύτταρα HMC3 ή να ζητήσετε περαιτέρω πληροφορίες σχετικά με τις προδιαγραφές του προϊόντος, επισκεφθείτε την ιστοσελίδα cytion.com.

Σημαντικές δημοσιεύσεις

1. Janabi N, Peudenier S, Héron B (1995) Δημιουργία ανθρώπινων μικρογλοιακών κυτταρικών σειρών μετά από μεταμόλυνση πρωτογενών καλλιεργειών εμβρυϊκών μικρογλοιακών κυττάρων με το μεγάλο Τ-αντιγόνο του SV40. Neuroscience letters. PMID: 7478261
2. Li B, Bedard K, Sorce S (2009) Η έκφραση του NOX4 στα ανθρώπινα μικρογλοιακά κύτταρα οδηγεί σε συνεχή παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου και σε συνεχή έκφραση της IL-6. Journal of innate immunity. PMID: 20375612
3. Dello Russo C, Cappoli N, Coletta I (2018) Η ανθρώπινη μικρογλοιακή κυτταρική σειρά HMC3: πού βρισκόμαστε; Μια συστηματική ανασκόπηση της βιβλιογραφίας. Journal of neuroinflammation. PMID: 30200996
4. Cappoli N, Mezzogori D, Tabolacci E (2019) Ο αναστολέας της κινάσης mTOR, η ραπαμυκίνη, ενισχύει την έκφραση και την απελευθέρωση της προφλεγμονώδους κυτοκίνης ιντερλευκίνης 6, ρυθμίζοντας την ενεργοποίηση των ανθρώπινων μικρογλοιακών κυττάρων. EXCLI journal. PMID: 31645839
5. Li H, Zhang X, Chen M (2018) Η δεξμεδετομιδίνη αναστέλλει τη φλεγμονή στα μικρογλοιακά κύτταρα υπό διέγερση από LPS και ATP μέσω των κασκάδων c-Fos/NLRP3/κασπάση-1. Περιοδικό EXCLI. PMID: 29743866
6. Baek M, Yoo E, Choi HI (2021) Ο αναστολέας BET μετριάζει τη φλεγμονώδη απόκριση και τη μετακίνηση των κυττάρων στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά μικρογλοίας HMC3. Scientific reports. PMID: 33893325
7. Nasi M, De Gaetano A, Bianchini E (2020) Τα μοριακά μοτίβα που σχετίζονται με τη μιτοχονδριακή βλάβη διεγείρουν την παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου στα ανθρώπινα μικρογλοιακά κύτταρα. Molecular and cellular neurosciences. PMID: 32828963
8. Lindberg C, Hjorth E, Post C (2005) Παραγωγή κυτοκινών από ανθρώπινη κυτταρική σειρά μικρογλοίας: επιδράσεις της β-αμυλοειδούς και της ορμόνης διέγερσης των άλφα-μελανοκυττάρων. Neurotoxicity Research. PMID: 16371321
9. González-Prieto M, Gutiérrez IL, García-Bueno B (2021) Η παραγωγή του CX3CR1 στα μικρογλοιακά κύτταρα αυξάνεται στη νόσο του Αλτσχάιμερ και ρυθμίζεται από τη νοραδρεναλίνη. Glia. PMID: 32662924
10. Ma'arif B, Mirza DM, Hasanah M (2020) Αντινευροφλεγμονώδης δράση του κλάσματος n-βουτανόλης του Marsilea crenata Presl. στη κυτταρική σειρά μικρογλοίας HMC3. Περιοδικό βασικής και κλινικής φυσιολογίας και φαρμακολογίας. PMID: 31967965
11. Ma'arif B, Agil M, Laswati H (2020) Η ενίσχυση της έκφρασης Arg1 και του ενεργοποιημένου ERβ στα μικρογλοιακά κύτταρα HMC3 μέσω της επαγωγής με εκχύλισμα 96% αιθανόλης από φύλλα Marsilea crenata Presl. Περιοδικό βασικής και κλινικής φυσιολογίας και φαρμακολογίας. PMID: 31981453
12. Martinez Viedma MDP, Pickett BE (2018) Χαρακτηρισμός των διαφορετικών επιδράσεων της λοίμωξης από τον ιό Ζίκα σε κύτταρα πλακούντα και μικρογλοίας. Viruses. PMID: 30453684
13. Zhang X, Guo Y, Xu X (2019) Το miR-146a προάγει την αναπαραγωγή του ιού της νόσου Borna 1 μέσω της οδού σηματοδότησης IRAK1/TRAF6/NF-κB. Virus Research. PMID: 31330207
14. Angel-Ambrocio AH, Bautista-Carbajal P, García-León ML (2020) Τα κύτταρα μικρογλοίας HMC3 είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα στη μόλυνση από ρινοϊό. Virus research. PMID: 32768491
15. Sharma A, Vasanthapuram R, M Venkataswamy M (2020) Η προιμπιτίνη 1/2 μεσολαβεί στην είσοδο του Dengue-3 σε ανθρώπινα κύτταρα νευροβλαστώματος (SH-SY5Y) και μικρογλοίας (CHME-3). Περιοδικό βιοϊατρικών επιστημών. PMID: 32306962
16. Li Z, Zhang J, Zheng H (2019) Η ρύθμιση του κυκλώματος lncRNA SNHG15/CDK6/miR-627 μέσω του palbociclib, ξεπερνά την αντοχή στην τεμοζολομίδη και μειώνει την M2-πόλωση των μικρογλοιακών κυττάρων που σχετίζονται με το γλοίωμα στο πολυμορφικό γλοιοβλάστωμα. Περιοδικό πειραματικής και κλινικής έρευνας για τον καρκίνο: CR. PMID: 31462285
17. Martínez Leo EE, Segura Campos MR (2020) Νευροπροστατευτική δράση των πεπτιδικών κλασμάτων της Salvia hispanica στη ρύθμιση της προφλεγμονώδους απόκρισης των μικρογλοιακών κυττάρων HMC3. Περιοδικό Βιοχημείας Τροφίμων. PMID: 32207175
18. Venkateswarlu K, Suman G, Dhyani V (2020) Τρισδιάστατη απεικόνιση και ποσοτικοποίηση των ταλαντώσεων του κυτοσολικού ασβεστίου σε πραγματικό χρόνο σε μικρογλοιακά κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε ηλεκτρονηματοποιημένες μήτρες με τη χρήση συμβολικής μικροσκοπίας σάρωσης με λέιζερ. Βιοτεχνολογία και βιομηχανική. PMID: 32557561
19. Qadri SW, Kumar N, Santhoshkumar R (2022) Μόλυνση της ανθρώπινης κυτταρικής σειράς μικρογλοιακών κυττάρων CHME-3 για τη μελέτη της νευροπαθογένεσης του ιού Chikungunya. Περιοδικό Νευροϊολογίας. PMID: 35352315