U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1

U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1 to zmodyfikowana genetycznie linia komórek ludzkiego osteosarcoma pochodząca z komórek U2OS, w której endogenny gen SEH1L (SEH1) został zmodyfikowany przy użyciu technologii CRISPR/Cas9 w celu zakodowania znacznika SNAPf w ramce. SEH1 jest składnikiem kompleksu Y (znanego również jako kompleks NUP107-160), podstawowego modułu strukturalnego kompleksu porów jądrowych (NPC), który przyczynia się do montażu i stabilności szkieletu porów. Poprzez wstawienie sekwencji kodującej SNAPf w endogenicznym locus, oznaczone białko SEH1 jest wyrażane pod natywną kontrolą regulacyjną, zachowując fizjologiczne poziomy ekspresji i minimalizując zaburzenia w składzie porów jądrowych.

Tag SNAPf jest zmodyfikowaną, szybko reagującą odmianą tagu SNAP, która kowalencyjnie wiąże substraty sprzężone z benzyloguaniną, umożliwiając selektywne i stabilne znakowanie fluorescencyjne w żywych lub utrwalonych komórkach. W komórkach U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1 białko fuzyjne lokalizuje się w otoczce jądrowej w postaci charakterystycznego dla rozmieszczenia NPC wzoru punktowego. Ponieważ znakowanie odbywa się na poziomie białek endogennych, system ten dobrze nadaje się do ilościowej mikroskopii fluorescencyjnej, obrazowania w superrozdzielczości oraz analiz śledzenia pojedynczych cząstek, mających na celu rozłożenie organizacji i stechiometrii NPC. Płaska morfologia i duże jądra komórek U2OS dodatkowo ułatwiają wizualizację struktur otoczki jądrowej w wysokiej rozdzielczości.

SEH1 uczestniczy w biogenezie NPC, a także bierze udział w procesach związanych z kinetochorem podczas mitozy. W związku z tym ta linia komórkowa stanowi solidną platformę do badania zależnego od cyklu komórkowego montażu i demontażu NPC, organizacji przestrzennej kompleksu Y w szkielecie porów oraz potencjalnej podwójnej roli SEH1 w otoczce jądra komórkowego i kinetochorach mitotycznych. U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1 umożliwia badania mechanistyczne architektury i dynamiki porów jądrowych w warunkach ekspresji istotnych z fizjologicznego punktu widzenia.

37°C, 5%_CO2, nawilżona atmosfera.

1. Confirm that the vial remains deeply frozen upon delivery, as cells are shipped on dry ice to maintain optimal temperatures during transit.

2. Upon receipt, either store the cryovial immediately at temperatures below -150°C to ensure the preservation of cellular integrity, or proceed to step 3 if immediate culturing is required.

3. For immediate culturing, swiftly thaw the vial by immersing it in a 37°C water bath with clean water and an antimicrobial agent, agitating gently for 40-60 seconds until a small ice clump remains.

4. Perform all subsequent steps under sterile conditions in a flow hood, disinfecting the cryovial with 70% ethanol before opening.

5. Carefully open the disinfected vial and transfer the cell suspension into a 15 ml centrifuge tube containing 8 ml of room-temperature culture medium, mixing gently.

6. Centrifuge the mixture at 300 x g for 3 minutes to separate the cells and carefully discard the supernatant containing residual freezing medium.

7. Gently resuspend the cell pellet in 10 ml of fresh culture medium. For adherent cells, divide the suspension between two T25 culture flasks; for suspension cultures, transfer all the medium into one T25 flask to promote effective cell interaction and growth.

8. Adhere to established subculture protocols for continued growth and maintenance of the cell line, ensuring reliable experimental outcomes.

Zanieczyszczenie mykoplazmą jest wykluczane przy użyciu zarówno testów opartych na PCR, jak i metod wykrywania mykoplazmy opartych na luminescencji.

Aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia bakteriami, grzybami lub drożdżami, hodowle komórkowe są poddawane codziennym kontrolom wizualnym.

W celu długotrwałego przechowywania należy umieścić fiolki w ciekłym azocie w fazie lotnej w temperaturze od -150 do -196 °C. Przechowywanie w temperaturze -80 °C jest dopuszczalne tylko jako krótki etap przejściowy przed przeniesieniem do ciekłego azotu.

Linie komórkowe poddane kriokonserwacji są wysyłane w suchym lodzie w zatwierdzonych, izolowanych opakowaniach z wystarczającą ilością czynnika chłodniczego, aby utrzymać temperaturę około -78°C przez cały czas transportu. Po otrzymaniu przesyłki należy natychmiast sprawdzić pojemnik i bezzwłocznie przenieść fiolki do odpowiedniego miejsca przechowywania.

W Cytion gwarantujemy jakość i żywotność naszych produktów. Gwarantujemy, że nasze komórki będą żywotne na początku hodowli przez 60 dni po wysyłce z naszych zakładów. Zapewniamy, że wszystkie materiały są zgodne ze specyfikacjami opisanymi w certyfikacie analizy i/lub karcie produktu

Szczegółowe informacje można znaleźć w naszej <a href=""/Who-we-are/Warranty/"" hreflang=""x-default"">Oświadczeniu gwarancyjnym