U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1

A U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1 é uma linhagem celular de osteossarcoma humano editada geneticamente, derivada de células U2OS, na qual o gene endógeno SEH1L (SEH1) foi modificado por meio da tecnologia CRISPR/Cas9 para codificar uma marca SNAPf em-quadro. O SEH1 é um componente do complexo Y (também conhecido como complexo NUP107-160), um módulo estrutural central do complexo de poros nucleares (NPC) que contribui para a montagem e a estabilidade da estrutura dos poros. Ao inserir a sequência codificadora do SNAPf no locus endógeno, a proteína SEH1 marcada é expressa sob controle regulatório nativo, preservando os níveis fisiológicos de expressão e minimizando perturbações na composição dos poros nucleares.

A etiqueta SNAPf é uma variante modificada e de reação rápida da etiqueta SNAP, que se liga covalentemente a substratos conjugados com benzilguanina, permitindo a marcação fluorescente seletiva e estável em células vivas ou fixadas. Nas células U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1, a proteína de fusão se localiza no envelope nuclear em um padrão pontilhado característico da distribuição do NPC. Como a marcação ocorre nos níveis de proteína endógena, esse sistema é adequado para microscopia de fluorescência quantitativa, imagens de super-resolução e análises de rastreamento de partículas individuais com o objetivo de dissecar a organização e a estequiometria dos NPCs. A morfologia achatada e os núcleos grandes das células U2OS facilitam ainda mais a visualização em alta resolução das estruturas do envelope nuclear.

A SEH1 participa da biogênese do NPC e também tem sido associada a processos relacionados ao cinetocoro durante a mitose. Assim, essa linhagem celular oferece uma plataforma robusta para investigar a montagem e desmontagem do NPC dependentes do ciclo celular, a organização espacial do complexo Y dentro da estrutura do poro e os possíveis papéis duplos da SEH1 no envelope nuclear e nos cinetócitos mitóticos. A U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1 permite estudos mecanísticos da arquitetura e da dinâmica dos poros nucleares sob condições de expressão fisiologicamente relevantes.

37 °C, 5% de CO₂, atmosfera umidificada.

1. Confirm that the vial remains deeply frozen upon delivery, as cells are shipped on dry ice to maintain optimal temperatures during transit.

2. Upon receipt, either store the cryovial immediately at temperatures below -150°C to ensure the preservation of cellular integrity, or proceed to step 3 if immediate culturing is required.

3. For immediate culturing, swiftly thaw the vial by immersing it in a 37°C water bath with clean water and an antimicrobial agent, agitating gently for 40-60 seconds until a small ice clump remains.

4. Perform all subsequent steps under sterile conditions in a flow hood, disinfecting the cryovial with 70% ethanol before opening.

5. Carefully open the disinfected vial and transfer the cell suspension into a 15 ml centrifuge tube containing 8 ml of room-temperature culture medium, mixing gently.

6. Centrifuge the mixture at 300 x g for 3 minutes to separate the cells and carefully discard the supernatant containing residual freezing medium.

7. Gently resuspend the cell pellet in 10 ml of fresh culture medium. For adherent cells, divide the suspension between two T25 culture flasks; for suspension cultures, transfer all the medium into one T25 flask to promote effective cell interaction and growth.

8. Adhere to established subculture protocols for continued growth and maintenance of the cell line, ensuring reliable experimental outcomes.

A contaminação por micoplasma é descartada por meio de ensaios baseados em PCR e de métodos de detecção de micoplasma baseados em luminescência.

Para garantir que não haja contaminação por bactérias, fungos ou leveduras, as culturas celulares são submetidas a inspeções visuais diárias.

Para preservação a longo prazo, coloque os frascos em nitrogênio líquido em fase de vapor a uma temperatura entre aproximadamente −150 e −196 °C. O armazenamento a −80 °C é aceitável apenas como uma etapa intermediária de curta duração antes da transferência para o nitrogênio líquido.

As linhagens celulares criopreservadas são enviadas em gelo seco, em embalagens isoladas e validadas, com refrigerante suficiente para manter a temperatura em aproximadamente −78 °C durante todo o transporte. Ao receber a remessa, inspecione o recipiente imediatamente e transfira os frascos sem demora para o local de armazenamento adequado.

Na Cytion, garantimos a qualidade e a viabilidade de nossos produtos. Garantimos que nossas células permanecerão viáveis no início da cultura por 60 dias após o envio de nossas instalações. Asseguramos que todos os materiais estão em conformidade com as especificações descritas no Certificado de Análise e/ou na Ficha Técnica do Produto.

Para obter todos os detalhes, consulte nossa Declaração de Garantia.