U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1

U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1 é uma linha celular de osteossarcoma humano editada geneticamente, derivada de células U2OS, na qual o gene SEH1L (SEH1) endógeno foi modificado usando a tecnologia CRISPR/Cas9 para codificar uma etiqueta SNAPf em quadro. O SEH1 é um componente do complexo Y (também conhecido como complexo NUP107-160), um módulo estrutural central do complexo de poros nucleares (NPC) que contribui para a montagem e estabilidade da estrutura dos poros. Ao inserir a sequência de codificação SNAPf no locus endógeno, a proteína SEH1 marcada é expressa sob controlo regulatório nativo, preservando os níveis de expressão fisiológica e minimizando as perturbações na composição dos poros nucleares.

A etiqueta SNAPf é uma variante projetada e de reação rápida da etiqueta SNAP que se liga covalentemente a substratos conjugados com bencilguanina, permitindo a marcação fluorescente seletiva e estável em células vivas ou fixas. Nas células U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1, a proteína de fusão localiza-se no envelope nuclear num padrão pontilhado característico da distribuição do NPC. Como a marcação ocorre em níveis de proteína endógena, este sistema é adequado para microscopia de fluorescência quantitativa, imagens de super-resolução e análises de rastreamento de partículas únicas com o objetivo de dissecar a organização e a estequiometria do NPC. A morfologia plana e os núcleos grandes das células U2OS facilitam ainda mais a visualização em alta resolução das estruturas do envelope nuclear.

A SEH1 participa na biogênese do NPC e também tem sido implicada em processos associados ao cinetocoro durante a mitose. Assim, esta linha celular fornece uma plataforma robusta para investigar a montagem e desmontagem do NPC dependente do ciclo celular, a organização espacial do complexo Y dentro da estrutura do poro e os potenciais papéis duplos da SEH1 no envelope nuclear e nos cinetocoros mitóticos. O U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1 permite estudos mecanísticos da arquitetura e dinâmica dos poros nucleares em condições de expressão fisiologicamente relevantes.

37°C, 5%_CO2, atmosfera humidificada.

1. Confirm that the vial remains deeply frozen upon delivery, as cells are shipped on dry ice to maintain optimal temperatures during transit.

2. Upon receipt, either store the cryovial immediately at temperatures below -150°C to ensure the preservation of cellular integrity, or proceed to step 3 if immediate culturing is required.

3. For immediate culturing, swiftly thaw the vial by immersing it in a 37°C water bath with clean water and an antimicrobial agent, agitating gently for 40-60 seconds until a small ice clump remains.

4. Perform all subsequent steps under sterile conditions in a flow hood, disinfecting the cryovial with 70% ethanol before opening.

5. Carefully open the disinfected vial and transfer the cell suspension into a 15 ml centrifuge tube containing 8 ml of room-temperature culture medium, mixing gently.

6. Centrifuge the mixture at 300 x g for 3 minutes to separate the cells and carefully discard the supernatant containing residual freezing medium.

7. Gently resuspend the cell pellet in 10 ml of fresh culture medium. For adherent cells, divide the suspension between two T25 culture flasks; for suspension cultures, transfer all the medium into one T25 flask to promote effective cell interaction and growth.

8. Adhere to established subculture protocols for continued growth and maintenance of the cell line, ensuring reliable experimental outcomes.

A contaminação por micoplasma é excluída utilizando ensaios baseados em PCR e métodos de deteção de micoplasma baseados em luminescência.

Para garantir que não há contaminação bacteriana, fúngica ou de leveduras, as culturas de células são sujeitas a inspecções visuais diárias.

Para conservação a longo prazo, colocar os frascos em azoto líquido em fase de vapor a uma temperatura entre -150 e -196 °C. O armazenamento a -80 °C é aceitável apenas como um curto passo intermédio antes da transferência para azoto líquido.

As linhas celulares criopreservadas são expedidas em gelo seco em embalagens validadas e isoladas com refrigerante suficiente para manter aproximadamente -78 °C durante o transporte. Aquando da receção, inspecionar imediatamente o recipiente e transferir sem demora os frascos para um local de armazenamento adequado.

Na Cytion, nós garantimos a qualidade e a viabilidade de nossos produtos. Garantimos que nossas células serão viáveis no início da cultura por 60 dias após o envio de nossas instalações. Asseguramos que todos os materiais estão em conformidade com as especificações descritas no Certificado de Análise e/ou Folha de Produto

Para mais informações, consulte a nossa <a href=""/Who-we-are/Warranty/"" hreflang=""x-default"">Declaração de Garantia