U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1

U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1 est une lignée cellulaire d’ostéosarcome humain modifiée génomiquement, dérivée de cellules U2OS, dans laquelle le gène endogène SEH1L (SEH1) a été modifié à l’aide de la technologie CRISPR/Cas9 afin de coder pour un marqueur SNAPf sans décalage de cadre de lecture. SEH1 est un composant du complexe Y (également appelé complexe NUP107-160), un module structurel central du complexe des pores nucléaires (NPC) qui contribue à l’assemblage et à la stabilité de la charpente des pores. En insérant la séquence codante du SNAPf au locus endogène, la protéine SEH1 marquée est exprimée sous le contrôle régulateur natif, ce qui préserve les niveaux d’expression physiologiques et minimise les perturbations de la composition des pores nucléaires.

La balise SNAPf est une variante modifiée et à réaction rapide de la balise SNAP qui se lie de manière covalente à des substrats conjugués à la benzylguanine, permettant un marquage fluorescent sélectif et stable dans des cellules vivantes ou fixées. Dans les cellules U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1, la protéine de fusion se localise sur l’enveloppe nucléaire selon un motif ponctuel caractéristique de la distribution des NPC. Comme le marquage se fait aux niveaux des protéines endogènes, ce système est particulièrement adapté à la microscopie à fluorescence quantitative, à l’imagerie à super-résolution et aux analyses de suivi de particules individuelles visant à disséquer l’organisation et la stœchiométrie des NPC. La morphologie aplatie et les gros noyaux des cellules U2OS facilitent encore davantage la visualisation à haute résolution des structures de l’enveloppe nucléaire.

SEH1 participe à la biogenèse des NPC et a également été impliqué dans des processus associés au kinétochore au cours de la mitose. Par conséquent, cette lignée cellulaire offre une plateforme robuste pour étudier l’assemblage et le désassemblage des NPC en fonction du cycle cellulaire, l’organisation spatiale du complexe Y au sein de la charpente des pores, ainsi que les doubles rôles potentiels de SEH1 au niveau de l’enveloppe nucléaire et des kinétochores mitotiques. La lignée U2OS-CRISPR-SNAPf-SEH1 permet de mener des études mécanistiques sur l’architecture et la dynamique des pores nucléaires dans des conditions d’expression physiologiquement pertinentes.

37 °C, 5 % _de CO_₂, atmosphère humidifiée.

1. Confirm that the vial remains deeply frozen upon delivery, as cells are shipped on dry ice to maintain optimal temperatures during transit.

2. Upon receipt, either store the cryovial immediately at temperatures below -150°C to ensure the preservation of cellular integrity, or proceed to step 3 if immediate culturing is required.

3. For immediate culturing, swiftly thaw the vial by immersing it in a 37°C water bath with clean water and an antimicrobial agent, agitating gently for 40-60 seconds until a small ice clump remains.

4. Perform all subsequent steps under sterile conditions in a flow hood, disinfecting the cryovial with 70% ethanol before opening.

5. Carefully open the disinfected vial and transfer the cell suspension into a 15 ml centrifuge tube containing 8 ml of room-temperature culture medium, mixing gently.

6. Centrifuge the mixture at 300 x g for 3 minutes to separate the cells and carefully discard the supernatant containing residual freezing medium.

7. Gently resuspend the cell pellet in 10 ml of fresh culture medium. For adherent cells, divide the suspension between two T25 culture flasks; for suspension cultures, transfer all the medium into one T25 flask to promote effective cell interaction and growth.

8. Adhere to established subculture protocols for continued growth and maintenance of the cell line, ensuring reliable experimental outcomes.

La contamination par les mycoplasmes est exclue à l'aide de tests basés sur la PCR et de méthodes de détection des mycoplasmes par luminescence.

Afin de s’assurer qu’il n’y a aucune contamination bactérienne, fongique ou par des levures, les cultures cellulaires font l’objet d’inspections visuelles quotidiennes.

Pour une conservation à long terme, placez les flacons dans de l’azote liquide en phase vapeur à une température comprise entre environ −150 et −196 °C. L’entreposage à −80 °C n’est acceptable qu’à titre d’étape intermédiaire de courte durée avant le transfert dans l’azote liquide.

Les lignées cellulaires cryoconservées sont expédiées dans de la glace sèche, dans un emballage isotherme validé contenant suffisamment de réfrigérant pour maintenir une température d’environ −78 °C pendant tout le transport. À la réception, inspectez immédiatement le conteneur et transférez sans délai les flacons dans un lieu de stockage approprié.

Chez Cytion, nous garantissons la qualité et la viabilité de nos produits. Nous garantissons que nos cellules seront viables au début de la culture pendant 60 jours à compter de leur expédition depuis nos installations. Nous assurons que tous les matériaux sont conformes aux spécifications décrites dans le certificat d’analyse et/ou la fiche technique du produit.

Pour plus de détails, veuillez consulter notre déclaration de garantie.