U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2

U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2 est une lignée cellulaire d’ostéosarcome humain modifiée génomiquement, dérivée de cellules U2OS, dans laquelle le locus endogène RANBP2 (également connu sous le nom de NUP358) a été modifié par CRISPR/Cas9 afin de coder pour un marqueur SNAPf en phase de lecture avec la protéine native. Nup358/RanBP2 est une grande nucléoporine localisée dans les filaments cytoplasmiques du complexe des pores nucléaires (NPC) et joue un rôle essentiel dans le transport nucléocytoplasmique, la SUMOylation et les processus mitotiques. Le marquage endogène garantit que SNAPf-Nup358 est exprimé sous le contrôle d’un promoteur physiologique, ce qui permet de maintenir les niveaux d’expression natifs et de minimiser les artefacts associés aux systèmes de surexpression.

La balise SNAPf est une variante à marquage rapide de la balise SNAP qui se lie de manière covalente à des substrats conjugués à la benzylguanine, permettant ainsi un marquage fluorescent sélectif et stable de Nup358 dans des cellules vivantes ou fixées. Dans les cellules U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2, la protéine de fusion se localise à l’enveloppe nucléaire selon une distribution ponctuelle caractéristique des filaments cytoplasmiques du NPC. Cette configuration permet l’imagerie par fluorescence à haute résolution, la microscopie à super-résolution, le marquage par impulsion-poursuite et le suivi de molécules individuelles pour étudier l’architecture et la dynamique du NPC. La morphologie aplatie et les gros noyaux des cellules U2OS facilitent en outre l’imagerie quantitative des structures de l’enveloppe nucléaire.

Ce modèle permet d’étudier les rôles spécifiques de Nup358 dans l’exportation nucléaire dépendante de CRM1/exportine, la régulation du cycle de la GTPase Ran et l’organisation spatiale des plateformes de transport cytoplasmiques. Compte tenu de l’implication de Nup358 dans l’assemblage du fuseau mitotique et la fonction du kinétochore, cette lignée cellulaire convient également à l’étude de la redistribution des nucléoporines en fonction du cycle cellulaire ainsi que du désassemblage et du réassemblage du NPC pendant la mitose. La lignée U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2 offre une plateforme physiologiquement pertinente pour analyser les aspects structurels et fonctionnels de la face cytoplasmique du complexe des pores nucléaires dans les cellules humaines.

37 °C, 5 % _de CO_₂, atmosphère humidifiée.

1. Confirm that the vial remains deeply frozen upon delivery, as cells are shipped on dry ice to maintain optimal temperatures during transit.

2. Upon receipt, either store the cryovial immediately at temperatures below -150°C to ensure the preservation of cellular integrity, or proceed to step 3 if immediate culturing is required.

3. For immediate culturing, swiftly thaw the vial by immersing it in a 37°C water bath with clean water and an antimicrobial agent, agitating gently for 40-60 seconds until a small ice clump remains.

4. Perform all subsequent steps under sterile conditions in a flow hood, disinfecting the cryovial with 70% ethanol before opening.

5. Carefully open the disinfected vial and transfer the cell suspension into a 15 ml centrifuge tube containing 8 ml of room-temperature culture medium, mixing gently.

6. Centrifuge the mixture at 300 x g for 3 minutes to separate the cells and carefully discard the supernatant containing residual freezing medium.

7. Gently resuspend the cell pellet in 10 ml of fresh culture medium. For adherent cells, divide the suspension between two T25 culture flasks; for suspension cultures, transfer all the medium into one T25 flask to promote effective cell interaction and growth.

8. Adhere to established subculture protocols for continued growth and maintenance of the cell line, ensuring reliable experimental outcomes.

La contamination par les mycoplasmes est exclue à l'aide de tests basés sur la PCR et de méthodes de détection des mycoplasmes par luminescence.

Afin de s’assurer qu’il n’y a aucune contamination bactérienne, fongique ou par des levures, les cultures cellulaires font l’objet d’inspections visuelles quotidiennes.

Pour une conservation à long terme, placez les flacons dans de l’azote liquide en phase vapeur à une température comprise entre environ −150 et −196 °C. L’entreposage à −80 °C n’est acceptable qu’à titre d’étape intermédiaire de courte durée avant le transfert dans l’azote liquide.

Les lignées cellulaires cryoconservées sont expédiées dans de la glace sèche, dans un emballage isotherme validé contenant suffisamment de réfrigérant pour maintenir une température d’environ −78 °C pendant tout le transport. À la réception, inspectez immédiatement le conteneur et transférez sans délai les flacons dans un lieu de stockage approprié.

Chez Cytion, nous garantissons la qualité et la viabilité de nos produits. Nous garantissons que nos cellules seront viables au début de la culture pendant 60 jours à compter de leur expédition depuis nos installations. Nous assurons que tous les matériaux sont conformes aux spécifications décrites dans le certificat d’analyse et/ou la fiche technique du produit.

Pour plus de détails, veuillez consulter notre déclaration de garantie.