U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2

U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2 เป็นสายพันธุ์เซลล์มะเร็งกระดูกชนิด osteosarcoma ของมนุษย์ที่ถูกแก้ไขจีโนมซึ่งพัฒนาจากเซลล์ U2OS โดยมีการปรับเปลี่ยนตำแหน่ง RANBP2 (หรือที่รู้จักในชื่อ NUP358) ที่มีอยู่ในเซลล์ตามธรรมชาติด้วยเทคนิค CRISPR/Cas9 เพื่อให้สามารถสร้างแท็ก SNAPf ได้ในลำดับเดียวกับโปรตีนดั้งเดิม Nup358/RanBP2 เป็นโปรตีนนิวคลีโอพอรินขนาดใหญ่ที่ตั้งอยู่ในเส้นใยไซโทพลาซึมของนิวเคลียร์พอร์คอมเพล็กซ์ (NPC) และมีบทบาทสำคัญในการขนส่งระหว่างนิวเคลียสและไซโทพลาซึม, การเติม SUMOylation, และกระบวนการไมโทซิส การติดแท็กภายในช่วยให้มั่นใจว่า SNAPf-Nup358 ถูกแสดงออกภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ทางสรีรวิทยา ซึ่งรักษาระดับการแสดงออกตามธรรมชาติและลดสิ่งประดิษฐ์ที่เกี่ยวข้องกับการแสดงออกเกิน

แท็ก SNAPf เป็นรูปแบบการติดฉลากอย่างรวดเร็วของแท็ก SNAP ที่จับกับซับสเตรตที่เชื่อมโยงกับเบนซิลกัวไนน์อย่างถาวร ทำให้สามารถติดฉลากฟลูออเรสเซนต์ของ Nup358 ได้อย่างเลือกสรรและคงที่ในเซลล์ที่มีชีวิตหรือเซลล์ที่ถูกตรึง ในเซลล์ U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2 โปรตีนฟิวชั่นจะกระจายตัวอยู่ในเยื่อหุ้มนิวเคลียสในรูปแบบจุดประ ซึ่งเป็นลักษณะเฉพาะของเส้นใย NPC ในไซโทพลาซึม การจัดเรียงตัวนี้เอื้อต่อการถ่ายภาพฟลูออเรสเซนซ์ความละเอียดสูง การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบความละเอียดสูงพิเศษ การติดฉลากด้วยพัลส์-เชส และการติดตามโมเลกุลเดี่ยว เพื่อศึกษาโครงสร้างและพลวัตของ NPC รูปร่างแบนและนิวเคลียสขนาดใหญ่ของเซลล์ U2OS ช่วยอำนวยความสะดวกในการถ่ายภาพเชิงปริมาณของโครงสร้างเยื่อหุ้มนิวเคลียสมากยิ่งขึ้น

โมเดลนี้ช่วยให้สามารถศึกษาบทบาทเฉพาะของ Nup358 ในการส่งออกนิวเคลียร์ที่ขึ้นกับ CRM1/exportin, การควบคุมวัฏจักร Ran GTPase และการจัดระเบียบเชิงพื้นที่ของแพลตฟอร์มการขนส่งไซโทพลาซึมได้ เนื่องจาก Nup358 มีส่วนเกี่ยวข้องในการประกอบสปินเดิลไมโทติกและการทำงานของไคเนโทโคร์ จึงทำให้สายเซลล์นี้เหมาะสมสำหรับการศึกษาการกระจายตัวใหม่ของนิวคลีโอพอรินที่ขึ้นกับวัฏจักรเซลล์และการแยก/ประกอบใหม่ของ NPC ระหว่างไมโทซิส U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2 เป็นแพลตฟอร์มที่มีความเกี่ยวข้องทางสรีรวิทยาสำหรับการแยกแยะแง่มุมทางโครงสร้างและการทำงานของด้านไซโทพลาซึมของคอมเพล็กซ์รูพรุนนิวเคลียร์ในเซลล์มนุษย์

37°C, 5%_CO2, บรรยากาศชื้น

1. Confirm that the vial remains deeply frozen upon delivery, as cells are shipped on dry ice to maintain optimal temperatures during transit.

2. Upon receipt, either store the cryovial immediately at temperatures below -150°C to ensure the preservation of cellular integrity, or proceed to step 3 if immediate culturing is required.

3. For immediate culturing, swiftly thaw the vial by immersing it in a 37°C water bath with clean water and an antimicrobial agent, agitating gently for 40-60 seconds until a small ice clump remains.

4. Perform all subsequent steps under sterile conditions in a flow hood, disinfecting the cryovial with 70% ethanol before opening.

5. Carefully open the disinfected vial and transfer the cell suspension into a 15 ml centrifuge tube containing 8 ml of room-temperature culture medium, mixing gently.

6. Centrifuge the mixture at 300 x g for 3 minutes to separate the cells and carefully discard the supernatant containing residual freezing medium.

7. Gently resuspend the cell pellet in 10 ml of fresh culture medium. For adherent cells, divide the suspension between two T25 culture flasks; for suspension cultures, transfer all the medium into one T25 flask to promote effective cell interaction and growth.

8. Adhere to established subculture protocols for continued growth and maintenance of the cell line, ensuring reliable experimental outcomes.

การปนเปื้อนของไมโคพลาสมาถูกตัดออกโดยใช้ทั้งการทดสอบแบบ PCR และการตรวจหาไมโคพลาสมาโดยใช้วิธีการเรืองแสง

เพื่อให้แน่ใจว่าไม่มีการปนเปื้อนของแบคทีเรีย เชื้อรา หรือยีสต์ การเพาะเลี้ยงเซลล์จะถูกตรวจสอบด้วยสายตาทุกวัน

สำหรับการเก็บรักษาในระยะยาว ให้วางหลอดบรรจุในไนโตรเจนเหลวในสถานะไอที่อุณหภูมิประมาณ −150 ถึง −196 °C การเก็บรักษาที่อุณหภูมิ −80 °C สามารถใช้ได้เฉพาะในระยะสั้นก่อนการย้ายไปยังไนโตรเจนเหลวเท่านั้น

เซลล์ไลน์ที่แช่แข็งในไนโตรเจนเหลวจะถูกจัดส่งในบรรจุภัณฑ์ที่ผ่านการตรวจสอบแล้วและมีการเก็บรักษาความเย็นด้วยน้ำแข็งแห้ง พร้อมสารทำความเย็นที่เพียงพอเพื่อรักษาอุณหภูมิประมาณ −78 °C ตลอดการขนส่ง เมื่อได้รับสินค้า ให้ตรวจสอบภาชนะทันทีและถ่ายโอนหลอดทดลองไปยังที่เก็บที่เหมาะสมโดยไม่ล่าช้า

ที่Cytion เรามุ่งมั่นในคุณภาพและความมีชีวิตของผลิตภัณฑ์ของเรา เรารับประกันว่าเซลล์ของเราจะยังมีชีวิตอยู่เมื่อเริ่มการเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 60 วันหลังจากจัดส่งจากโรงงานของเรา เรารับรองว่าวัสดุทั้งหมดเป็นไปตามข้อกำหนดที่ระบุไว้ใน ใบรับรองการวิเคราะห์ และ/หรือแผ่นข้อมูลผลิตภัณฑ์

สำหรับรายละเอียดเพิ่มเติม กรุณาดูที่ <a href=""/Who-we-are/Warranty/"" hreflang=""x-default"">นโยบายการรับประกัน.