U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2

U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2 é uma linhagem celular de osteossarcoma humano com edição genômica, derivada de células U2OS, na qual o locus endógeno RANBP2 (também conhecido como NUP358) foi modificado por CRISPR/Cas9 para codificar uma etiqueta SNAPf em fase com a proteína nativa. A Nup358/RanBP2 é uma grande nucleoporina localizada nos filamentos citoplasmáticos do complexo de poros nucleares (NPC) e desempenha papéis críticos no transporte nucleocitoplasmático, na SUMOilação e nos processos mitóticos. A marcação endógena garante que o SNAPf-Nup358 seja expresso sob o controle de um promotor fisiológico, mantendo os níveis de expressão nativos e minimizando artefatos associados a sistemas de superexpressão.

A etiqueta SNAPf é uma variante de marcação rápida da etiqueta SNAP que se liga covalentemente a substratos conjugados com benzilguanina, permitindo a marcação fluorescente seletiva e estável de Nup358 em células vivas ou fixadas. Nas células U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2, a proteína de fusão se localiza no envelope nuclear em uma distribuição pontilhada característica dos filamentos citoplasmáticos do NPC. Essa configuração permite o uso de imagens de fluorescência de alta resolução, microscopia de super-resolução, marcação por pulso-perseguição e técnicas de rastreamento de moléculas individuais para estudar a arquitetura e a dinâmica do NPC. A morfologia achatada e os núcleos grandes das células U2OS facilitam ainda mais a obtenção de imagens quantitativas das estruturas do envelope nuclear.

Esse modelo permite a investigação das funções específicas da Nup358 na exportação nuclear dependente de CRM1/exportina, na regulação do ciclo da GTPase Ran e na organização espacial das plataformas de transporte citoplasmático. Dado o envolvimento da Nup358 na montagem do fuso mitótico e na função do cinetocoro, a linhagem celular também é adequada para o estudo da redistribuição das nucleoporinas dependente do ciclo celular e da desmontagem/remontagem do NPC durante a mitose. A U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2 oferece uma plataforma fisiologicamente relevante para a análise dos aspectos estruturais e funcionais da face citoplasmática do complexo de poros nucleares em células humanas.

37 °C, 5% de CO₂, atmosfera umidificada.

1. Confirm that the vial remains deeply frozen upon delivery, as cells are shipped on dry ice to maintain optimal temperatures during transit.

2. Upon receipt, either store the cryovial immediately at temperatures below -150°C to ensure the preservation of cellular integrity, or proceed to step 3 if immediate culturing is required.

3. For immediate culturing, swiftly thaw the vial by immersing it in a 37°C water bath with clean water and an antimicrobial agent, agitating gently for 40-60 seconds until a small ice clump remains.

4. Perform all subsequent steps under sterile conditions in a flow hood, disinfecting the cryovial with 70% ethanol before opening.

5. Carefully open the disinfected vial and transfer the cell suspension into a 15 ml centrifuge tube containing 8 ml of room-temperature culture medium, mixing gently.

6. Centrifuge the mixture at 300 x g for 3 minutes to separate the cells and carefully discard the supernatant containing residual freezing medium.

7. Gently resuspend the cell pellet in 10 ml of fresh culture medium. For adherent cells, divide the suspension between two T25 culture flasks; for suspension cultures, transfer all the medium into one T25 flask to promote effective cell interaction and growth.

8. Adhere to established subculture protocols for continued growth and maintenance of the cell line, ensuring reliable experimental outcomes.

A contaminação por micoplasma é descartada por meio de ensaios baseados em PCR e de métodos de detecção de micoplasma baseados em luminescência.

Para garantir que não haja contaminação por bactérias, fungos ou leveduras, as culturas celulares são submetidas a inspeções visuais diárias.

Para preservação a longo prazo, coloque os frascos em nitrogênio líquido em fase de vapor a uma temperatura entre aproximadamente −150 e −196 °C. O armazenamento a −80 °C é aceitável apenas como uma etapa intermediária de curta duração antes da transferência para o nitrogênio líquido.

As linhagens celulares criopreservadas são enviadas em gelo seco, em embalagens isoladas e validadas, com refrigerante suficiente para manter a temperatura em aproximadamente −78 °C durante todo o transporte. Ao receber a remessa, inspecione o recipiente imediatamente e transfira os frascos sem demora para o local de armazenamento adequado.

Na Cytion, garantimos a qualidade e a viabilidade de nossos produtos. Garantimos que nossas células permanecerão viáveis no início da cultura por 60 dias após o envio de nossas instalações. Asseguramos que todos os materiais estão em conformidade com as especificações descritas no Certificado de Análise e/ou na Ficha Técnica do Produto.

Para obter todos os detalhes, consulte nossa Declaração de Garantia.