U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133

A U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133 é uma linhagem celular de osteossarcoma humano geneticamente modificada, derivada da linhagem parental U2OS, na qual o locus endógeno NUP133 foi modificado por meio da edição do genoma mediada por CRISPR/Cas9 para codificar uma etiqueta SNAPf no extremo C-terminal. A NUP133 é um componente central do complexo Y (complexo NUP107-160), um subcomplexo estrutural essencial para a montagem e manutenção do complexo de poros nucleares (NPC). Ao introduzir a sequência codificadora da SNAPf em fase no locus endógeno, a proteína de fusão é expressa sob controle regulatório nativo, preservando os níveis fisiológicos de expressão e a localização subcelular.

A etiqueta SNAPf é uma variante de marcação rápida da etiqueta SNAP, uma O6-alquilguanina-DNA-alquiltransferase modificada que reage covalentemente com substratos conjugados à benzilguanina. Isso permite a marcação fluorescente altamente específica e versátil da Nup133 em células vivas ou fixadas, utilizando substratos SNAP permeáveis ou impermeáveis às células. Nas células U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133, a proteína de fusão se localiza no envelope nuclear em um padrão pontilhado característico dos complexos de poros nucleares. Como a marcação ocorre no locus endógeno, a estequiometria e a arquitetura dos complexos de poros nucleares (NPC) são minimamente perturbadas, tornando este modelo adequado para microscopia quantitativa de super-resolução, rastreamento de moléculas únicas e análises cinéticas da montagem e renovação dos NPCs.

Essa linhagem celular oferece uma plataforma robusta para o estudo do transporte nuclear, da dinâmica do tráfego nucleocitoplasmático, da biogênese dos NPCs durante a interfase e da remontagem nuclear pós-mitótica, bem como da organização estrutural do complexo Y dentro da estrutura dos poros. A linhagem U2OS apresenta morfologia plana e núcleos grandes, facilitando a obtenção de imagens de alta resolução. As células U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133 são particularmente adequadas para experimentos de marcação do tipo “pulse-chase”, microscopia correlativa de luz e eletrônica, e abordagens de imagem multicolorida em combinação com nucleoporinas ou fatores de transporte adicionalmente marcados de forma endógena.

37 °C, 5% de CO₂, atmosfera umidificada.

1. Confirm that the vial remains deeply frozen upon delivery, as cells are shipped on dry ice to maintain optimal temperatures during transit.

2. Upon receipt, either store the cryovial immediately at temperatures below -150°C to ensure the preservation of cellular integrity, or proceed to step 3 if immediate culturing is required.

3. For immediate culturing, swiftly thaw the vial by immersing it in a 37°C water bath with clean water and an antimicrobial agent, agitating gently for 40-60 seconds until a small ice clump remains.

4. Perform all subsequent steps under sterile conditions in a flow hood, disinfecting the cryovial with 70% ethanol before opening.

5. Carefully open the disinfected vial and transfer the cell suspension into a 15 ml centrifuge tube containing 8 ml of room-temperature culture medium, mixing gently.

6. Centrifuge the mixture at 300 x g for 3 minutes to separate the cells and carefully discard the supernatant containing residual freezing medium.

7. Gently resuspend the cell pellet in 10 ml of fresh culture medium. For adherent cells, divide the suspension between two T25 culture flasks; for suspension cultures, transfer all the medium into one T25 flask to promote effective cell interaction and growth.

8. Adhere to established subculture protocols for continued growth and maintenance of the cell line, ensuring reliable experimental outcomes.

A contaminação por micoplasma é descartada por meio de ensaios baseados em PCR e de métodos de detecção de micoplasma baseados em luminescência.

Para garantir que não haja contaminação por bactérias, fungos ou leveduras, as culturas celulares são submetidas a inspeções visuais diárias.

Para preservação a longo prazo, coloque os frascos em nitrogênio líquido em fase de vapor a uma temperatura entre aproximadamente −150 e −196 °C. O armazenamento a −80 °C é aceitável apenas como uma etapa intermediária de curta duração antes da transferência para o nitrogênio líquido.

As linhagens celulares criopreservadas são enviadas em gelo seco, em embalagens isoladas e validadas, com refrigerante suficiente para manter a temperatura em aproximadamente −78 °C durante todo o transporte. Ao receber a remessa, inspecione o recipiente imediatamente e transfira os frascos sem demora para o local de armazenamento adequado.

Na Cytion, garantimos a qualidade e a viabilidade de nossos produtos. Garantimos que nossas células permanecerão viáveis no início da cultura por 60 dias após o envio de nossas instalações. Asseguramos que todos os materiais estão em conformidade com as especificações descritas no Certificado de Análise e/ou na Ficha Técnica do Produto.

Para obter todos os detalhes, consulte nossa Declaração de Garantia.